橡膠樹白粉菌分生孢子DNA的微量提取方法建立

摘""要：由橡膠樹白粉菌（Erysiphe"quercicola）引發的橡膠樹白粉病是我國天然橡膠產業中的一個重要病害，其對乳膠產量造成了嚴重威脅。隨著預測預報技術的不斷進步，結合qPCR檢測和孢子捕捉技術有望成為高效預測白粉病流行的新方法。本研究針對橡膠樹白粉菌分生孢子DNA的微量提取，通過比較不同預處理方式、不同材質的研磨珠以及不同類型的研磨裝置，篩選出了最適合的孢子樣品研磨體系。進一步比較了CTAB法與幾種商業提取試劑盒的提取效率，最終確定了一種可行的孢子DNA微量提取方法：將白粉菌分生孢子水溶液置于4"℃超聲處理10"min后加入2"mm氧化鋯珠0.2"g、0.4～0.6"mm玻璃珠0.2"g以及0.2"mm氧化鋯珠0.2"g，用組織研磨儀在4"℃"70"Hz條件下研磨40"s，停10"s，20個循環，最后使用CTAB法提取DNA。通過qPCR定量，可以在101"個/mL的孢子懸浮液當中檢出橡膠樹白粉菌DNA，且不受田間復雜情況的干擾，具有高靈敏度和強特異性，為橡膠樹白粉病的預測預報提供了可靠的理論依據和有效的技術手段。

關鍵詞：橡膠樹；白粉菌；分生孢子；DNA；微量提取中圖分類號：S432.1""""""文獻標志碼：A

Establishment"of"a"Microscale"DNA"Extraction"Method"for"Rubber"Tree"Powdery"Mildew"Spores

FENG"Deyu1，2，"LIANG"Xiaoyu1，2，"WANG"Hanmo1，"HUANG"Xize1，"ZHOU"Shaoyao1，2，"WANG"Meng1，2，"ZHANG"Yu1，2*

1."Sanya"Institute"of"Breeding"and"Multiplication，"Hainan"University，"Sanya，"Hainan"572024，"China;"2."College"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Danzhou，"Hainan"571737，"China

Abstract："Powdery"mildew"caused"by"Erysiphe"quercicola"is"a"significant"disease"in"China’s"natural"rubber"industry，"posing"a"severe"threat"to"latex"production."With"the"continuous"advancement"of"predictive"and"forecasting"technologies，"the"combination"of"qPCR"detection"and"spore"capture"techniques"holds"promise"as"an"efficient"method"for"predicting"the"prevalence"of"powdery"mildew."In"this"study，"we"focused"on"the"microscale"extraction"of"DNA"from"rubber"tree"powdery"mildew"spores."We"compared"various"pre-treatment"methods，"different"types"of"grinding"beads"with"varying"materials，"and"different"types"of"grinding"machines"to"identify"the"most"suitable"spore"sample"grinding"system."Furthermore，"we"compared"the"efficiency"of"the"CTAB"method"with"several"commercial"extraction"kits."Ultimately，"we"established"a"feasible"microscale"DNA"extraction"method"for"spores："first，"the"powdery"mildew"spore"water"solution"subjected"to"4"℃"ultrasonication"for"10"min，"subsequently，"2"mm"zirconia"beads"（0.2"g），"glass"beads"（0.4-0.6"mm，"0.2"g），"and"0.2"mm"zirconia"beads"（0.2"g）"added，"tissue"grinder"70"Hz"at"4"℃，"grind"40"s，"stop"10"s，"20"cycles，"finally，"DNA"extracted"using"the"CTAB"method."This"method"effectively"and"stably"extracts"DNA"from"101"spores/mL"rubber"tree"powdery"mildew"spores，"without"being"affected"by"complex"field"conditions，"and"demonstrates"high"sensitivity"and"specificity."It"provides"a"reliable"theoretical"basis"and"an"effective"technical"approach"for"the"prediction"and"forecasting"of"rubber"tree"powdery"mildew.

Keywords："rubber"tree;"Erysiphe"quercicola;"spores;"DNA;"microscale"extraction

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.002

由橡膠樹白粉菌（Erysiphe"quercicola）引起的橡膠樹白粉病是我國植膠區重要葉部病害之一，主要危害橡膠樹的嫩葉、嫩芽、嫰梢和花序，嚴重時導致大面積葉片脫落，從而降低乳膠產量[1]。該病害流行程度與橡膠樹葉片物候期、氣候因子以及田間越冬菌量有關。通常情況下，嫩葉期平均氣溫較高、物候期不整齊，以及越冬菌量大都會導致橡膠樹白粉病的大流行，而且分生孢子可全年不斷地進行侵染[2-3]"。國內外學者已經對橡膠樹白粉病的流行規律以及預測預報方法進行了廣泛研究[4]，白粉菌的分生孢子具有體積小和質量輕的特點，可以隨著空氣流動而傳播。因此，使用孢子捕捉技術可以在病害爆發前或早期連續監測空氣中的分生孢子數量，這對于白粉病的早期預測和預報至關重要[5-6]。

以往對孢子捕捉器樣本中的病菌孢子分類和計數通常需要依賴顯微鏡觀察其形態特征，這種方法耗時且容易受到孢子皺縮和重疊等問題的干擾，從而降低準確性。為了提高準確性，國內外學者采用了計算機圖像識別技術，建立了智能化孢子捕捉分析系統[7-8]，該系統可以實現孢子的自動采集和顯微圖像的遠程采集傳輸等一系列功能[9]，從而顯著提高了孢子識別的準確性[10]。但對低豐度的樣本，分子生物學方法可以更精確地獲得孢子數量，熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time"quantitative"PCR，"qPCR）技術的出現，不僅可以檢測孢子捕捉器中的目標樣品，還能對其捕獲情況進行定量分析[11]。將qPCR與孢子捕捉技術相結合，可以為病害防控提供實用的方法，這一方法已在小麥白粉病[12]、黃瓜白粉病[13]、桃樹白粉病[14]的預測、預報工作中得到了應用。qPCR檢測技術的成功應用，高效獲取目標生物的DNA是關鍵。前人研究已經通過對捕捉帶上的小麥白粉菌分生孢子進行洗脫和破壁，發現了一種用于從孢子捕捉器的捕捉帶上提取小麥白粉菌DNA的方法，該方法最低可有效提取捕捉帶上約50個小麥白粉菌分生孢子的基因組DNA，其靈敏性和提取產率均超過了商業試劑盒[15]。本研究通過優化研磨程序、評估CTAB提取法與其他幾種商業試劑盒的提取效率，成功構建了一種適用于橡膠樹白粉菌分生孢子基因組DNA的微量提取方法。該方法能夠有效地提取出101"個/mL孢子懸浮液當中的橡膠樹白粉菌DNA，有助于孢子捕捉技術進一步評估膠園中白粉菌分生孢子的流行動態，這對于預防和控制橡膠樹白粉病，從而保護橡膠樹的健康生長具有重要意義。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試樣品""橡膠樹白粉菌菌株采自中國熱帶農業科學院橡膠研究所天然橡膠良種苗木繁育基地，于本實驗室單斑分離獲得菌株，并使用熱研73397橡膠樹芽接苗接種穩定傳代培養，菌株經鑒定命名為HO-3；田間孢子樣品收集自白粉病高發地區的云南景洪（22°01?00?N，100°49?00?E）和海南保亭（18°23?00?N，109°48?00?E）監測綜合試驗站的Burkard孢子捕捉器。

1.1.2""供試藥劑""β-巰基乙醇購自上海麥克林生化科技有限公司，蛋白酶K購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，三氯甲烷、異戊醇購自廣東光華科技股份有限公司，異丙醇與乙醇等購自廣東西隴科學股份有限公司；DNA提取試劑盒：2×CTAB"Solution（北京酷萊博科技有限公司），TIANamp"Soil"DNA"Kit[天根生化科技（北京）有限公司]，FastDNA?"SPIN"Kit"for"Soil（MP"Biomedicals"For"USA），HP"Plant"DNA"Kit（Omega"Bio-Tek"For"USA）；"qPCR"SYBR"Green"Master"Mix（南京諾唯贊科技有限公司）。

1.1.3""主要儀器""KQ-800DE超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），LGJ-10普通型（0.12"m2）真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發展有限公司），LUKYM-I冷凍組織研磨儀（廣州露卡測序儀器有限公司），JY-650E細胞破碎儀（上海熙揚儀器有限公司），CFX"Connect?"熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad"有限公司），CX21生物顯微鏡（OLYMPUS）。

1.2""方法

1.2.1""菌種培養與孢子懸浮液配置""熱研73397橡膠樹芽接苗于28"℃培育，待抽出2～3"cm古銅葉時接種白粉菌，后在18～22"℃、70%～90%"RH的條件下培養12～16"d即可獲得橡膠樹白粉菌孢子，用超純水洗脫下白粉菌分生孢子，利用顯微鏡加血球計數板將懸浮液濃度調整為104"個/mL，然后進行10倍梯度稀釋，得到101、102、103、104"個/mL的白粉菌孢子懸浮液，作為本試驗的研究對象。

1.2.2""優化研磨程序""（1）樣品不同預處理條件優化。采用超聲處理和冷凍干燥處理2種方法與無預處理條件進行比較，以優化樣品研磨的預處理條件。超聲處理的條件為在4"℃下超聲10"min，冷凍干燥處理則是將樣品置于–30"℃冷凍干燥器中直至樣品水分被完全抽干為止。

（2）不同研磨設備效果比較。冷凍組織研磨儀的工作參數為：溫度4"℃，振動頻率70"Hz，運行時間40"s，停頓時間10"s，循環次數為20次。細胞破碎儀的工作參數為：樣品放置于冰水混合物上，超聲功率360"W，運行時間為2"s，停頓時間為3"s，總破碎時間8"min。

（3）不同材質研磨珠體系。根據研磨珠的材質不同，分為石英砂體系和玻璃珠加氧化鋯珠2個體系。石英砂研磨體系添加的研磨珠數量分別為：2"mm石英砂0.2"g、0.5"mm石英砂0.2"g、0.2"mm石英砂0.2"g。玻璃珠加氧化鋯珠研磨體系添加的研磨珠數量為：2"mm氧化鋯珠0.2"g、0.4～0.6"mm玻璃珠0.2"g以及0.2"mm氧化鋯珠0.2"g。

1.2.3""比較4種不同DNA提取方法的效率""參照TIANamp"Soil"DNA"Kit、FastDNA?"SPIN"Kit"for"Soil、HP"Plant"DNA"Kit試劑盒說明書提取DNA。按傳統CTAB法進行橡膠樹白粉菌分生孢子DNA的提取與純化。

1.2.4""熒光定量PCR驗證""根據橡膠樹白粉菌（E."quercicola）基因組上的一段保守序列[16]（Gene"Bank："KP171513.1）設計定量PCR引物（DQ-25F："5?-ACCCCATCACGACTAAAATA-3?，"DQ-25R："5?-GGAAGTGGACCGACGAA-3?）。PCR反應體系（20"μL）：qPCR"SYBR"Green"Master"Mix"10"μL，DNA"3"μL，正、反向引物（10"μmol/L）各0.5"μL，ddH2O補足至20"μL。擴增程序：95"℃"30"s，95"℃"5"s，55"℃"35"s，40個循環；熔解曲線分析溫度范圍為60～95"℃。使用配套軟件BioRad"CFXManager分析定量數據，根據孢子濃度轉化以10為底的對數（x），與對應的Cq值（y）繪制圖表，Cq值越小表示初始模板濃度越高。

1.2.5""驗證DNA提取體系穩定性""對101、102、103、104"個/mL的懸浮液樣品進行3次獨立提取DNA，并使用qPCR進行定量檢測橡膠樹白粉菌DNA。每組樣品3次重復，分析組內變異系數和組間變異系數，以評估提取體系的重復性和再現性。

1.2.6""驗證田間孢子樣品的DNA提取效果""取海南和云南兩地區橡膠樹白粉病流行期內孢子捕捉器取的樣品。將最優體系提取捕捉器樣品中的橡膠樹白粉菌DNA，進行qPCR定量，將檢測結果與鏡檢結果進行相關性分析。

1.3""數據處理

使用IBM"SPSS"Statistics"26軟件進行均值、標準偏差、變異系數以及顯著性差異分析，并使用Origin軟件進行線性擬合和圖像繪制。

2""結果與分析

2.1""研磨程序優化

2.1.1""不同預處理條件對研磨效果的影響""將超聲處理、冷凍干燥處理以及無預處理3種樣品預處理方式進行對比，提取結果經過qPCR驗證。未進行預處理的102、101"個/mL懸浮液，提取的白粉菌DNA，檢測循環次數（Cq）均高于35，表明這些樣品中的橡膠白粉菌DNA濃度較低，或者可能存在檢測假陽性情況。經過2種預處理方法后，能夠顯著提高橡膠白粉菌的DNA產率，101、102、103、104"個/mL的樣品均能檢出白粉菌DNA。其中，超聲處理的提取效果要比冷凍干燥處理更好，提取的DNA濃度更高（圖1）。通過比較3組處理的qPCR數據發現，孢子樣品經過4"℃下超聲預處理10"min，提取產率更高，而且所需時間更短，更易于操作。

2.1.2""研磨裝置對研磨效果的影響""通過qPCR進行樣品DNA的定量檢測，比較冷凍組織研磨儀與細胞破碎儀的研磨效果。2種研磨裝置均能夠成功提取到橡膠樹白粉菌DNA，但冷凍組織研磨儀的研磨效果明顯優于細胞破碎儀（圖2）。因此，使用冷凍組織研磨儀4"℃，振動頻率70"Hz，運行時間40"s，停頓時間10"s，循環20次對橡膠樹白粉菌孢子樣品進行研磨處理更適合。

2.1.3""研磨珠材質對研磨效果的影響""不同粒徑的研磨珠組合，可以影響樣品中提取的DNA的質量。本研究觀察不同研磨珠材質對橡膠樹白粉菌分生孢子樣品的DNA提取效果的影響，確定了2種效果較好的研磨珠組合，分別是3種粒徑石英砂組合和氧化鋯珠加玻璃珠的組合。在qPCR定量驗證中，氧化鋯珠與玻璃珠的組合提取DNA濃度均高于石英砂組，并且Cq值都在35以下，表明其研磨效果更佳（圖3）。因此，選擇添加2"mm氧化鋯珠0.2"g、0.4～0.6"mm玻璃珠0.2"g以及0.2"mm氧化鋯珠0.2"g作為本研究的研磨珠。

2.2""DNA提取方法比較

將CTAB法與另外3種商業DNA試劑盒對比提取4個濃度梯度（101、102、103、104"個/mL）的孢子懸浮液中的橡膠樹白粉菌DNA。由圖4可知，4種提取方法的提取產率從高到低分別為CTAB法gt;FastDNA?"SPIN"Kit"for"Soil提取試劑盒gt;TIANamp"Soil"DNA"Kit提取試劑盒gt;HP"Plant"DNA"Kit提取試劑盒，其中CTAB法在提取4個梯度的懸浮液中的橡膠樹白粉菌DNA中，提取產率均為最高，FastDNA?"SPIN"Kit"for"Soil提取試劑盒雖然也能提取出101"個/mL的白粉菌樣品DNA，與CTAB法的提取濃度無顯著差異，但其成本要高于CTAB法。因此，從實際操作與成本綜合考慮出發，本研究選擇CTAB法作為DNA提取方法。

2.3""提取體系準確性評價

本研究基于前文中的研磨程序優化以及比較不同DNA提取方式等，利用最優組合，成功構建了一套適用于橡膠樹白粉菌分生孢子DNA的微量提取方法。使用該體系提取101、102、103、104"個/mL懸浮液的橡膠樹白粉菌樣品DNA，進行qPCR定量檢測。擴增曲線成梯度分布，熔解曲線呈現單峰，標準曲線的相關系數為0.9198（圖5），該提取體系在室內評價工作中，表現出較好的準確性。

2.4""提取體系穩定性評價

通過3次提取懸浮液的橡膠樹白粉菌DNA樣品，使用qPCR進行定量檢測，并對每個樣品進行3次重復檢測，以評估該提取體系的穩定性（表1）。無論哪個濃度范圍內的孢子濃度在該提取體系條件下，3次測定結果均表現出很好的重復性和再現性，組內變異系數在0.30%～2.62%之間，組間變異系數為2.99%～7.14%，2組數值的變異系數均在15%以下。這表明該體系在處理橡膠樹白粉菌分生孢子樣品時具有良好的重復性，可以穩定地提取出適用于后續實驗的橡膠樹白粉菌基因組DNA。

2.5""田間孢子捕捉器樣品DNA提取驗證

橡膠樹白粉病流行期內，使用孢子捕捉器在云南和海南獲取的樣品成功觀察到了白粉菌分生孢子，并進行了孢子密度的統計。按照建立的提取體系提取了白粉菌分生孢子DNA，并使用qPCR進行定量。將Cq值轉化為孢子密度，然后進行2種檢測方法的相關性分析（圖6）。云南和海南地區監測站的孢子樣品顯示，2種檢測方法的相關系數分別為0.8555和0.9307，二者檢測結果一致。這表明，使用本研究構建的提取體系結合qPCR定量技術，可以作為人工鏡檢的替代方法，且不受田間復雜情況的影響，具有高靈敏度和特異性。

3""討論""

真菌分生孢子具有堅硬的細胞壁，富含多酚、多糖和蛋白質等復雜細胞成分，這些因素會影響DNA提取的效率和質量。周潔等[17]使用烘箱40"℃將孢子懸浮液中的水分烘干，結合液氮研磨法，用以提取土壤中的蚧蠟輪枝菌DNA。受此啟發，本研究選擇冷凍干燥儀處理孢子懸浮液中的水分，增加白粉菌孢子與研磨珠接觸面積的同時，還避免了溫度過高導致核酸的降解，從而提高提取效率。超聲處理可以破壞分生孢子的壁膜結構，釋放細胞質[18]。本研究將2種研磨前預處理方法與無預處理進行比較，結果表明，研磨前預處理能顯著提高對白粉菌孢子樣品的研磨效率，且能提取到含101"個/mL孢子懸浮液中的白粉菌DNA。本研究中，使用超聲處理要比冷凍干燥處理更能提高研磨效率，因此，選擇超聲處理作為研磨前對樣品的預處理方式。

針對這類生物含量較低的樣品，常規的液氮加研缽研磨破壁效果不佳，同時還會造成樣品的大量損耗，在本研究比較了細胞破碎儀和冷凍組織研磨儀2種裝置的研磨效果。細胞破碎儀的工作原理是將電能轉換為聲能，聲能通過液體介質變為一個個密集的小氣泡，小氣泡迅速破裂，產生能量，以實現破碎效果。WANG等[19]通過在富含腐殖酸的砂樣品中提取惡臭假單胞菌（Pseudomonas"putida）基因組DNA時，證明了細胞破碎儀能有效提高樣品的裂解效率。而組織研磨儀的工作原理，是通過摩擦研磨珠和孢子來實現破碎效果[20]。2種研磨儀都能有效破碎101、102、103、104"個/mL白粉菌懸浮液樣品，但冷凍組織研磨儀在本研究表現出更高的研磨效率，因此選擇冷凍組織研磨儀研磨本試驗孢子樣品更為合適。

研磨珠材質有玻璃珠、氧化鋯珠[21]和石英研磨珠[22]，其中氧化鋯珠具有更高的硬度與密度[23-24]，可以在短時間內破碎孢子且產生的熱量較少，最大程度地減少核酸降解的可能性。NIU等[25]通過將小粒徑（0.5"mm和0.1"mm）氧化鋯珠和材料密度較低的玻璃珠（0.5"mm）組合，可以從富含有機物和生物硅粘土的海底沉積物中，提取微生物DNA。為此，在本研究中針對樣品特定來源進行優化，加入了大粒徑的氧化鋯珠（2"mm），用以破碎橡膠白粉菌分生孢子堅韌的細胞壁，以及保留了小粒徑的氧化鋯珠與玻璃珠，以保證在處理白粉菌分生孢子微量樣品時，也能獲得較好的研磨效果。在比較不同的DNA提取方法時，CTAB法的提取產率最高。這種差異的原因是另外3種商業試劑盒在DNA洗脫純化過程中使用了過濾柱，這可能導致核酸丟失。相比之下，CTAB法通過異丙醇直接將產物沉淀在離心管底部，雖然提取時間較長，但成本最低[26]。

此外，本研究利用qPCR技術對孢子捕捉器捕捉的橡膠樹白粉菌分生孢子進行了定量檢測。與鏡檢孢子密度顯著正相關的結果表明，qPCR技術結合孢子捕捉技術具有不可替代的優勢。首先，它準確性高，使用橡膠樹白粉菌特異性引物，只會擴增出白粉菌特異性片段的產物，無需考慮其他形態特征相似的孢子。其次，它具有高靈敏度和強耐受性，鏡檢觀察容易受到田間復雜情況的干擾，影響統計準確性。另外，該技術獲取數據的時間較短，能夠同時處理多個樣品，極大地節約了操作時間[27]。目前，這項工作還有許多可以拓展的方向，例如提高DNA提取的質量，以滿足SSR、SRAP等分子標記技術和遺傳多樣性分析等分子實驗需求，為橡膠樹白粉菌群體遺傳結構分析以及分子生物學研究提供技術支持[28]。

4""結論""

本研究成功構建了1種適用于橡膠樹白粉菌分生孢子DNA的微量提取方法。該方法為4"℃超聲處理10"min，添加2"mm氧化鋯珠0.2"g、0.4～0.6"mm玻璃珠0.2"g和0.2"mm氧化鋯珠0.2"g，冷凍組織研磨儀在4"℃條件下、振動頻率為70"Hz、研磨40"s、停10"s、循環20次，使用CTAB法提取。

經田間孢子捕捉器樣品驗證后，定量結果與鏡檢觀察呈現出高度一致的正相關性，表明qPCR技術是一種可靠的替代方法，可取代顯微鏡觀察和菌落培養。有效提取孢子捕捉器上的白粉菌孢子DNA對于預測橡膠樹白粉病的爆發流行具有關鍵意義，同時也為其他分子檢測技術提供了堅實的理論基礎和技術支持。

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