鉆喙蘭屬種質資源鑒評與分子身份證構建

摘""要：鉆喙蘭屬為蘭科的一類附生型蘭花，具有較高的觀賞價值和經濟價值。本研究基于前期收集的鉆喙蘭屬3個常見種的10份不同種質資源，采用熒光標記毛細管電泳進行等位變異檢測，篩選出21對SSR多態性引物，其中13對引物位點呈高多態性，共擴增出47個等位基因，平均觀測等位基因數（Na）為2.238，平均有效等位基因數（Ne）為1.860。21個位點的觀測雜合度（Ho）為0～0.778，均值為0.421，期望雜合度（He）為0.148～0.574，均值僅0.340，Shannon指數（I）為0.096～0.987，均值為0.567。10份種質的聚類結果和PCoA分析與傳統植物學分類一致，可將10份種質按種劃分成3個類群。在此基礎上篩選出4對核心引物構建每份種質的分子身份證。本研究為后續鉆喙蘭屬種質資源的收集保存、鑒評和開發利用奠定基礎。

關鍵詞：鉆喙蘭屬；SSR；分子身份證

中圖分類號：S682.31""""""文獻標志碼：A

Identification"of"Germplasm"Resources"and"Construction"of"Molecular"Identity"Card"for"Rhynchostylis

XIAO"Wenfang，"LI"Zuo，"CHEN"Heming，"LYU"Fubing*

Environmental"Horticulture"Research"Institute，"Guangdong"Academy"of"Agricultural"Sciences"/"Guangdong"Key"Lab"of"Ornamental"Plant"Germplasm"Innovation"and"Utilization，"Guangzhou，"Guangdong"510640，"China

Abstract："Rhynchostylis"is"an"epiphytic"orchid"belonging"to"the"Orchidaceae"family."It"possesses"high"ornamental"and"economic"value."In"this"study，"based"on"the"collection"of"10"different"germplasm"resources"from"three"common"species"of"Rhynchostylis，"21"pairs"of"SSR"polymorphic"primers"were"selected"using"fluorescent-labeled"capillary"electrophoresis"for"allele"variation"detection."Among"them，"13"primer"pairs"exhibited"high"polymorphism，"resulting"in"a"total"of"47"amplified"alleles."The"average"number"of"observed"alleles"（Na）"was"2.238，"and"the"average"number"of"effective"alleles"（Ne）"was"1.860."The"observed"heterozygosity"（Ho）"of"the"21"loci"ranged"from"0"to"0.778，"with"a"mean"of"0.421，"while"the"expected"heterozygosity"（He）"ranged"from"0.148"to"0.574，"with"a"mean"of"only"0.340."The"Shannon"index"（I）"ranged"from"0.096"to"0.987，"with"a"mean"of"0.567."The"clustering"results"and"PCoA"analyses"of"the"10"germplasm"were"consistent"with"the"traditional"botanical"classification，"and"all"the"germplasm"could"be"classified"into"three"taxa"by"species."On"this"basis，"four"pairs"of"core"primers"were"selected"to"construct"a"molecular"ID"for"each"germplasm."This"study"lays"a"foundation"for"the"collection，"conservation，"identification，"development"and"utilization"of"the"germplasm"resources"of"Rhynchostylis.

Keywords："Rhynchostylis;"SSR;"molecular"ID

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.007

鉆喙蘭屬（Rhynchostylis"Blume）為蘭科、樹蘭亞科、萬代蘭族、指甲蘭亞族的一類單軸生長型附生蘭花，具花多且密的總狀花序，因此又得名狐貍尾蘭。該屬目前僅發現和鑒定5個原生種，包括鉆喙蘭（R."retusa）、海南鉆喙蘭（R."gigantea）、立梗狐尾蘭（R."coelestis）、R."rieferi和R."cymifera，主要分布于我國的云南省、貴州省、海南島，以及印度、斯里蘭卡和東南亞各國[1]。該屬植物株型緊湊、花繁色艷且絕大多數具濃烈芳香，栽培管理簡單，耐熱性強，易雜交，具有較高的觀賞價值和開發應用前景。從19世紀中葉開始，陸續有鉆喙蘭屬的種間雜交種、與近緣蘭科植物之間的屬間雜交種在英國皇家園藝學會（Royal"Horticultural"Society）登錄，截至2023年6月，登錄的鉆喙蘭屬原生種F1代雜交組合已達402個。泰國作為野生鉆喙蘭屬植物分布的中心地區之一，是最早開展鉆喙蘭屬植物育種、繁殖及栽培研究的國家之一，培育的品種在世界各地十分暢銷。我國最早于19世紀末20世紀初由臺灣企業從泰國引種栽培鉆喙蘭屬植物，并進行育種和栽培的相關研究，目前已培育出四倍體海南鉆喙蘭等極具特色的新品種，成為國內外各大蘭展的獲獎熱門品種[2]。但我國大陸地區的市場尚未打開，鉆喙蘭屬植物鮮為消費者所知。

除傳統雜交育種工作外，鉆喙蘭屬植物的相關研究主要集中在組培快繁、栽培管理和野生資源分布及鑒定等方面[3-7]，分子生物學方面僅有極少量利用不同分子標記或簡化基因組測序針對單獨的種進行遺傳多樣性等方面的分析。針對海南鉆喙蘭，目前僅利用SRAP標記技術分析來自海南島22個居群地的144份野生資源的遺傳多樣性[8]，發現海南鉆喙蘭的核型公式為2n=2x=36m+"2sm[9]，并利用RT-PCR結合RACE技術從海南鉆喙蘭中分離得到2個僅在生殖器官中表達的B類MADS-box基因RgAP3和RgPI[10]；針對鉆喙蘭，目前僅利用2個RAPD引物對包括鉆喙蘭在內的9個不同的蘭科原生種進行了遺傳相似性分析[11]，利用13條RAPD引物和7條ISSR引物對采自印度7個不同地區的鉆喙蘭進行遺傳多樣性分析[12]，并利用ddRAD技術對包括鉆喙蘭在內的4個蘭花原生種進行簡化基因組測序和遺傳多樣性分析[13]；針對立梗狐尾蘭構建了包含10"600個BAC克隆的人工細菌染色體[14]以供后續進行基因組結構分析。

基于鉆喙蘭屬植物本身的優良特性，及其與蝴蝶蘭（Phalaenopsis"Blume）、萬代蘭（Vanda）、指甲蘭（Aerides"falcata"Lindl.）等能夠進行遠緣雜交創制跨屬雜交新種質的優勢，近年來受到越來越多育種工作者的關注，急需系統性開展鉆喙蘭屬種質資源的開發、保護、保存與鑒評工作。TP-M13-SSR（simple"sequence"repeat"with"tailed"primer"M13）技術結合了SSR分子標記技術和熒光測序技術，具有重復性高、結果準確等優點，在較大程度上解決了傳統凝膠電泳分析通量較低、擴增產物檢測流程繁瑣、數據記錄工作量大等一系列問題[15]。目前TP-M13-SSR已在茶花[16]、百合[17]、桂花[18]、荷花[19]等各類觀賞花卉的種質資源鑒定和指紋圖譜構建方面得到應用，在蘭科植物中已成功應用于蝴蝶蘭的突變體鑒定[20]、建蘭（Cymbidium"ensifolium）的核心種質構建[21]、石斛蘭（Dendrobium"Sw.）原生種的鑒評[22]等方面。

為充分保護和利用鉆喙蘭屬資源的多樣性，本研究利用自主開發的鉆喙蘭屬基因組SSR引物和蘭科通用SSR引物，對鉆喙蘭屬常見3個種的10份種質資源進行分析鑒評，從DNA水平揭示鉆喙蘭屬種質資源的親緣關系，分析其遺傳多樣性并建立種質資源的分子身份證，為鉆喙蘭屬種質資源的保護及開發利用提供理論依據。

1""材料與方法

1.1""材料

供試品種為廣東省農業科學院環境園藝研究所收集保存的10份鉆喙蘭屬原生種資源，具體性狀信息見表1，均種植于廣東省農業現代化科技示范區廣東省農業科學院環境園藝研究所溫室大棚內，于2020年5月采集根尖，于液氮中速凍15"min后放入超低溫冰箱，備用。

1.2""方法

根據簡化基因組信息開發篩選出12對鉆喙蘭屬內和12對鉆喙蘭屬與蝴蝶蘭屬通用引物（待發表），在不同樣品中進行單重PCR擴增，反應體系總體積為10"μL，其中含50"ng/μL"DNA模板1.2"μL，10×Buffer"Ⅰ緩沖液1.0"μL，5"U/μL的TaKaRa"HS"Taq酶0.1"μL，5"μmol/L的上下游引物各0.3"μL，2.5"mmol/L的dNTP"0.8"μL，5"μmol/L的TP-M13"0.5"μL，去離子水5.8"μL。反應程序為：95"℃預變性5"min；95"℃變性30"s，60"℃退火30"s，72"℃延伸30"s，30個循環；95"℃變性30"s，53"℃退火30"s，72"℃延伸30"s，10個循環；60"℃，30"min。

在96孔板中，每孔加入篩選引物的擴增產物1.0"μL，ROX-500分子量內標和甲酰胺混合液（0.5∶8.5）9"μL，95"℃變性3"min后，利用ABI"3730XL檢測儀進行檢測，1"kV電壓進樣10"s，電泳15"kV，30"min。將Data"Collection軟件收集的原始數據文件導入到GeneMapper"3.2軟件中進行分析，將各峰值的位置與其泳道中的分子量內標予以比較，計算目標DNA片段的準確大小。各熒光標記座位上獨立進行3次重復的毛細管電泳檢測，取3次重復的平均值并四舍五入取整，作為試驗材料在該座位上的數據。

1.3""數據處理

根據擴增數據對10份鉆喙蘭屬種質進行遺傳多樣性分析。運用GenAlEx"6.503軟件計算引物的等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon指數（I）、觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He），并繪制PCoA圖，利用PowerMarker"V3.25軟件計算引物的多態性信息含量（PIC），利用NTSYS"2.10軟件進行聚類作圖。并根據引物的PIC及其在鉆喙蘭屬內不同種間的通用性篩選核心引物，構建每份種質的分子身份證。

2""結果與分析

2.1""鉆喙蘭屬種質資源概述

鉆喙蘭屬目前已發現和鑒定的原生種共5個，其中3個發現較早、分布廣泛、雜交利用率較高，3個種均已有雜交后代登錄，另2個原生種分布范圍狹窄、發現較晚，尚無育種利用和針對性研究。

2.1.1""海南鉆喙蘭（R."gigantea）""廣泛分布于中國海南島和中國黃海附近島嶼，緬甸仰光和東高附近以及北部的其他地方，泰國東部地區、西南地區的北碧府，新加坡及附近島嶼，老撾的萬象平原和波羅芬高地，柬埔寨的Camchay山，越南胡志明市和廣治省附近，婆羅洲，印度尼西亞的阿南巴斯島。該種的主要特點：花序下垂；花較大，花朵平均直徑為3.4"cm；唇瓣片前部明顯3裂；距狹圓錐形，底端銳尖；蕊柱足不明顯；芳香；花期冬季到春季[23]。山采株的花色主要為白底紅點、白底紅粗斑及純白色變種。目前不同品系間已雜交選育出純紅色變形，且臺灣地區利用粗斑帶橙色的突變個體已選育出橙色海南鉆喙蘭，并利用橙色個體與白色變種進行雜交選育偏綠色的海南鉆喙蘭。截至2023年6月，該種在英國皇家園藝學會登錄的雜交F1代有186個，其中海南鉆喙蘭作為父本的有156個，作為母本的有30個，可見其作為父本的雜交育性顯著高于作為母本的雜交育性。

2.1.2""立梗狐尾蘭（R."coelestis）"nbsp;廣泛分布于泰國北部、東北部、西部、西南部的山區和巴蜀省的低海拔地區，柬埔寨南部，越南大叻附近的山區，老撾。該種的主要特點：花序挺立斜生；花較小，花朵平均直徑為2.3"cm；唇瓣片前部明顯3裂；距狹圓錐形，底端銳尖下彎；蕊柱足明顯；芳香；花期春季到夏季[23]。山采株的花色為白底帶藍紫色暈、藍紫色唇瓣，也有白底帶紫紅色暈的變形和純白色的變形。目前中國臺灣地區利用多倍體育種技術已選育出四倍體的立梗藍狐尾。截至2023年4月，該種已在英國皇家園藝學會登錄的雜交F1代有174個，其中立梗狐尾蘭作為母本的有137個，作為父本的有37個，其作為父本的雜交育性顯著高于作為母本的雜交育性。

2.1.3""鉆喙蘭（R."retusa）""廣泛分布于中國云南省西南部和貴州省，斯里蘭卡，印度北部和南部，泰國，馬來西亞，爪哇島，菲律賓呂宋島的巴丹省、布拉干省、甲米地和黎剎省。該種的主要特點：花序下垂；花較小，花朵平均直徑為2.2"cm；唇瓣片不明顯3裂；距囊狀，兩側壓扁，底端鈍圓；蕊柱足明顯；無香或淡香；花期冬季到春季[23]。山采株的花色為白底紫紅點，已選育出純白色變形。截至2023年4月，該種已在英國皇家園藝學會登錄的雜交F1代有46個，其中鉆喙蘭作為母本的僅有2個，作為父本的有44個，其作為父本的雜交育性同樣顯著高于作為母本的雜交育性。

2.1.4""R."rieferi""僅分布于菲律賓。2009年發現并鑒定為鉆喙蘭屬新種，尚無育種利用等針對性的相關研究。該種的主要特點：花序下垂；花較小；唇瓣狹窄且小，急劇上翹；距較短；芳香[24]。

2.1.5""R."cymifera""僅分布于印度西南部Nilambur的常綠森林中。2018年發現并鑒定為鉆喙蘭屬新種，尚無育種利用等針對性的相關研究。該種的主要特點：花序下垂；花較小；斜菱形花瓣；方形漸變成倒卵形的唇瓣，先端微凹；長且尖的距；球形花粉塊；無香；花期春季到夏季[25]。

本研究共采用6個不同的海南鉆喙蘭原生種、3個不同的立梗狐尾蘭原生種和1個山采株色鉆喙蘭原生種，涵蓋鉆喙蘭屬常見3個種中目前發現和鑒定的所有變種和變型，具體性狀見表1。除花色外，海南鉆喙蘭與鉆喙蘭、立梗狐尾蘭最主要的性狀區別在于花梗的下垂與直立，而鉆喙蘭區別于海南鉆喙蘭和立梗狐尾蘭的性狀主要在于花香及花朵數，鉆喙蘭基本無香但花朵數可多達百朵，海南鉆喙蘭和立梗狐尾蘭均具濃香但花朵數較少。

2.2""遺傳多樣性及聚類分析

采用自主開發的12對鉆喙蘭屬特異引物和12對鉆喙蘭屬與蝴蝶蘭屬通用引物，對來自3個種的10份鉆喙蘭屬種質進行檢測，其中3對引物擴增后不具多態性，其余21對引物共擴增出47個等位基因（表2），每對引物擴增出1～3個等位基因，Na均值為2.238，Ne均值為1.860。24個位點的Ho為0～0.778，均值為0.421，He為0.148～"0.574，均值僅0.340，I介于0.096～0.987之間，均值為0.567，表明供試種質的雜合程度極低，遺傳多樣性不高，這與供試種質均為原生種或其變型和變種有關。21對引物中有13對引物位點呈高多態性（PICgt;0.5）[26]，證明本研究所篩選出的多數引物適用于鉆喙蘭屬種質鑒評。

根據Nei’s遺傳距離，對10份鉆喙蘭屬種質資源構建UPGMA遺傳關系聚類圖（圖1），如圖1所示，10份鉆喙蘭屬種質被分為三大類，同一個種的種質聚為一類，10份鉆喙蘭屬種質的PCoA分析結果顯示，PCoA1和PCoA2分別占所有鉆喙蘭屬種質總遺傳變異的32.63%和15.30%；PCoA分析同樣將10份種質分為三大類，同一個種的種質聚為一類（圖2）。聚類結果和PCoA分析結果與鉆喙蘭屬種質植物學分類結果一致。

2.3""核心引物篩選及分子身份證構建

根據引物多態性信息含量（PIC）及其在鉆喙蘭屬內不同種間的通用性，從1對引物開始逐步增加引物數量篩選出可將供試種質全部區分的引物組合，最終確定引物組合28-N1001301+2-"N10002234+43-N5725511能夠將所有樣品區分開，但這3個引物的通用性均未達到100%，考慮到后續樣品的適用性，增加通用性100%的88-N1001036引物（PIC僅次于前3個引物）作為核心引物，最終確定28-N1001301+2-N10002234+"43-N5725511+8-N1001036作為今后鉆喙蘭屬種質資源鑒定的核心引物組合，其他引物作為備選。

通過數據化編碼構建鉆喙蘭屬種質的分子身份證，其構成包括2個部分。第1部分為前2位字母，表示物種信息，鉆喙蘭屬目前共5個種，包括海南鉆喙蘭（RG）、立梗狐尾蘭（RC）、鉆喙蘭（RR）、R."rieferi（RI）、R."cymifera（RC）。第2部分為后續的數字，代表4對核心引物擴增結果，2-N10002234、28-N1001301、43-N5725511、88-N10010364的擴增片段按分子量大小排列，從小到大以阿拉伯數字1～9標注，若該位點在某個種質中無擴增則記為0，每個引物占2位。如R01海南鉆喙蘭（R."gigantea"‘Shen’s"Suns’）的分子身份證為RG00334411，RG代表其為海南鉆喙蘭這個種的種質資源，00334411為其通過核心引物擴增轉換而來的專屬編碼。最終構建的10份鉆喙蘭屬種質分子身份證代碼均不相同，能夠將所有種質區分開，并利用每個種質資源的分子身份證編號，分別制作種質特異的條形碼（圖1）。

3""討論

鉆喙蘭屬種質資源雖不豐富，但作為蝴蝶蘭屬近緣物種，具有易雜交的特性，可與蝴蝶蘭進行跨屬遠緣雜交創制新種質。因鉆喙蘭屬大多數種質具濃香，可作為蝴蝶蘭新品種的香味性狀親本來源，目前鉆喙蘭屬常見3個種與蝴蝶蘭屬不同種質均已有雜交新品種育成。且鉆喙蘭屬種質具有蝴蝶蘭不具備的許多優點，如栽培管理簡單粗放、抗性強，海南鉆喙蘭在廣東地區不用低溫催花可應春節開花，因此鉆喙蘭屬種質極具開發應用潛力。雖然鉆喙蘭屬的育種工作起步較早，1825年已在野外發現鉆喙蘭這個原生種并命名，1935年在英國皇家園藝學會上登錄了第1個鉆喙蘭與鳳蝶蘭的跨屬雜交種Rhynchanthe"Bernardii，1970年在英國皇家園藝學會上登錄了第1個海南鉆喙蘭與鉆喙蘭間的種間雜交種R."Chorchalood，但與蝴蝶蘭屬、石斛屬、萬代蘭屬等其他大屬相比，其進展緩慢，目前國內外僅個別蘭場栽培了少量單株作為稀有資源進行銷售，資源鑒評等相關研究相對十分匱乏，嚴重制約了鉆喙蘭屬種質的保護和開發利用。

我國作為鉆喙蘭屬野生資源分布區，海南島分布大量海南鉆喙蘭，而云南和貴州則分布有鉆喙蘭野生資源，但目前針對相關資源僅進行了少量的分布調查[2，"7]、組培快繁和栽培管理[5-6，"27]等方面的簡單研究，資源鑒評方面僅利用SRAP標記技術分析了來自海南島22個居群地144份野生資源的遺傳多樣性[7]。SSR分子標記是國際植物新品種保護聯盟指定的構建植物DNA指紋圖譜的首選方法[28]，可檢測DNA序列的差異，穩定性強、可重復性好，已廣泛應用于蘭科植物的種質鑒評[20-22，"29]。分子身份證是將目標種質的分子指紋圖譜進行編碼，形成種質對應的特異編號儲存其身份信息，對于數字化管理種質和鑒別具有重要作用，已在石斛蘭[22]、石蒜屬[30]等花卉中成功應用。本研究基于自有資源圃收集保存的鉆喙蘭屬3個常見種的10份不同種質資源，利用自主開發的SSR引物，對其進行遺傳多樣性分析、親緣關系分析和分子身份證構建。根據SSR分子標記分析的遺傳距離系數，利用UPGMA方法和PCoA分析可以將供試的10份鉆喙蘭屬種質按照種劃分為3個類群，與傳統植物分類結果一致。根據引物多態性信息含量及其在鉆喙蘭屬內不同種間的通用性篩選出的4對核心引物能夠將10份鉆喙蘭屬種質完全區分開，為每份種質建立了獨有的分子身份證。這充分說明本研究開發篩選的引物適用于鉆喙蘭屬種質的鑒評，可用于野生資源的遺傳多樣性分析、品種資源的分類鑒定、資源圃的分類管理等，為今后鉆喙蘭屬種質的收集保存和鑒定提供理論基礎。

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