pH、葡萄糖和幾種陽離子對本溪細(xì)鱗魚精子活力的影響

摘 要：為給本溪細(xì)鱗魚（Brachymystax lenok Pallas）人工繁殖中最佳受精激活介質(zhì)的選擇提供理論依據(jù)，也為細(xì)鱗魚的精子稀釋液和保存液的配制提供科學(xué)依據(jù)，采用平板載片法，研究了pH、葡萄糖和Na+、K+、Ca2+、Mg2+等金屬離子以及冷藏時間對本溪細(xì)鱗魚精子活力的影響。結(jié)果顯示，精子應(yīng)在超低溫條件下進(jìn)行保存。研究表明，應(yīng)采用自來水配置，pH為8，且應(yīng)含有0.5 g/L Na+、0.3 g/L Mg2+、0.3 g/L Ca2+ 和50 mmol/L葡萄糖，從而達(dá)到本溪細(xì)鱗魚人工授精的最佳條件。研究得出，適宜濃度的pH值和葡萄糖、Na+、Mg2+、Ca2+對本溪細(xì)鱗魚精子活力有增強(qiáng)作用。K+會抑制本溪細(xì)鱗魚的精子活力，而Na+是促進(jìn)本溪細(xì)鱗魚精子活力的主要因素。

關(guān)鍵詞：細(xì)鱗魚（Brachymystax lenok Pallas）;精子活力;金屬離子;pH;葡萄糖

細(xì)鱗魚（Brachymystax lenok Pallas）也可稱細(xì)鱗鮭，因其鱗片相對細(xì)小而獲此名。從動物分類學(xué)的角度來看，歸屬于鮭形目，鮭科，細(xì)鱗鮭屬，屬于冷水性山麓魚類。細(xì)鱗魚原產(chǎn)于我國，是大型名貴的冷水性魚類，通常棲息在秦嶺地區(qū)海拔處于 900～2 300 m之間的山澗溪流當(dāng)中，常在河流流速很快、水質(zhì)清亮干凈、底質(zhì)為大型石頭的河段中活動。據(jù)相關(guān)研究表明，現(xiàn)如今在我國各地分布的細(xì)鱗魚均屬于同一種。最近幾年來，由于生態(tài)環(huán)境惡化和人為過度捕撈，導(dǎo)致細(xì)鱗魚棲息環(huán)境被破壞，分布范圍逐漸縮小，種群資源衰退嚴(yán)重。我國野生動物保護(hù)法已將細(xì)鱗魚列入國家二級重點(diǎn)保護(hù)水生野生動物名單，為了更好地保護(hù)這一珍貴物種，鑒于國家對自然資源保護(hù)的日益重視，應(yīng)加強(qiáng)對細(xì)鱗魚人工繁殖方面的不斷研究[1]。

" 目前在細(xì)鱗魚養(yǎng)殖、人工繁殖等領(lǐng)域已展開了一定的研究工作，但在精子活力方面尚未見報道。為此，研究本溪細(xì)鱗魚精子在不同溶液作為激活介質(zhì)條件下的活力變化，可以為本溪細(xì)鱗魚的人工繁殖提供一定的基礎(chǔ)，有助于我國細(xì)鱗魚資源得到保護(hù)和恢復(fù)，能夠合理開發(fā)利用細(xì)鱗魚資源；并為本溪細(xì)鱗魚的雜交提供一定的數(shù)據(jù)參考[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇遼寧祺鱗漁業(yè)有限公司養(yǎng)殖場內(nèi)體色鮮艷、發(fā)黑，腹部灰黑色，魚體型呈紡錘形，體質(zhì)健壯，無病無傷的3尾雄魚作為試驗(yàn)魚。試驗(yàn)期間未注射催情劑。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)溶液的配制

為排除其他無關(guān)因素的干擾，試驗(yàn)用到的化學(xué)試劑均為分析純，所有溶液均用純水配制成所需要的濃度。Na+、K+、Mg2+、Ca2+組分別用NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2溶液配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g/L共8個濃度梯度。

用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaCl溶液與去離子水分別配成pH值4、5、6、7、8、9、10共7個梯度的激活液。

葡萄糖組用葡萄糖和純水分別配制成25、50、125、150 mmol/L共5個濃度梯度。

1.2.2 精液的獲得

采取本溪細(xì)鱗魚精子時，先用純水沖洗魚體腹部和生殖孔，然后用干毛巾擦去魚體表面和生殖孔附近的水分，輕壓魚體腹部的兩側(cè)，便可獲取精液。所取得的精液在觀察時應(yīng)呈現(xiàn)為乳白色，具有較高的黏稠度，遇水能夠快速散開。獲取的精液未受到水、尿、糞、血液、黏液等物質(zhì)的污染。

1.2.3 精子活力的觀察

采用平板載片法[2]。用解剖針頭蘸取少量精液，放置在平板載玻片上。吸取一滴激活液，經(jīng)充分融合后于顯微鏡（OlympusCX21）下觀察，并用計時器記錄時間，每組重復(fù)試驗(yàn)3次。精子活力的等級可依據(jù)蘇天鳳等[3]的標(biāo)準(zhǔn)。對精子活力進(jìn)行評價的主要指標(biāo)包括：精子激活后的持續(xù)運(yùn)動時間（即壽命）、精子的運(yùn)動速率、精子激活的比率等。鑒于精子只有處于快速運(yùn)動的狀態(tài)下才擁有受精的能力，所以本試驗(yàn)僅僅針對精子快速運(yùn)動的時間、精子的壽命以及精子激活的比例進(jìn)行觀察和記錄。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用Duncan方法進(jìn)行組間差異分析，顯著性水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對本溪細(xì)鱗魚精子活力的影響

由表1可知，當(dāng)溶液的pH值為8時，本溪細(xì)鱗魚精子的快速運(yùn)動時間和精子的壽命最長，激活比例也最高。本溪細(xì)鱗魚精子活力在pH值為8時精子快速運(yùn)動時間和壽命最長，精子激活比例最高，分別為（11.7±2.5）s和（32.3±3.1） s，（51.6±2.9）%。其快速運(yùn)動時間和壽命與pH為7以及9組相比，差異并不顯著（P＞0.05），但與pH為4和10 的組別顯著差異。當(dāng)pH值低于8時，隨著pH值的升高，精子壽命和精子激活比例呈上升趨勢；而當(dāng)pH值大于8時，隨著pH值的增加，精子快速運(yùn)動時間和壽命減少，精子激活比例降低。

2.2 不同的葡萄糖溶液濃度對本溪細(xì)鱗魚精子活力的影響

由表2可知，當(dāng)葡萄糖溶液的濃度為50 mmol/L時，精子快速運(yùn)動的時長和壽命處于最大值，精子激活的比例也處于最高值，分別是（30.3±3.1）s、（61.3±2.5）s、（86.7±5.8）%。當(dāng)葡萄糖濃度大于50 mmol/L時，隨著葡萄糖濃度的不斷增加，精子快速運(yùn)動的時間和壽命呈現(xiàn)下降趨勢，精子激活的比例也有所降低。50 mmol/L葡萄糖組的精子快速運(yùn)動時間、壽命以及激活比例與150 mmol/L葡萄糖組的差異最為顯著。當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到150 mmol/L時，本溪細(xì)鱗魚的精子活力受到了抑制，其原因或許是濃度過高致使溶液的滲透壓過高，進(jìn)而破壞了精子結(jié)構(gòu)。

2.3 陽離子對本溪細(xì)鱗魚精子活力的影響

由表3可知， K+對本溪細(xì)鱗魚精子活力存在抑制效應(yīng)。當(dāng)K+濃度達(dá)0.3 g/L時，精子快速運(yùn)動時間及壽命最長，精子激活比例亦最高，分別為（22.7±3.2）s、（47.3±1.5）s、（36.7±5.8）％。K+濃度0.4 g/L組的精子快速運(yùn)動時間與K+濃度0.3 g/L組的快速運(yùn)動時間和壽命差異并不顯著，但與其余各組的快速運(yùn)動時間和壽命差異明顯。伴隨K+濃度的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)K+濃度升至0.8 g/L時，本溪細(xì)鱗魚的精子活力被完全抑制。

由表4可知，Na+濃度是0.5 g/L時，精子快速運(yùn)動的時間與壽命最長，精子激活的比例也最高，分別為（36.7±1.5）s、（95.6±14.6）s、（89.6±3.1）%。Na+濃度 0.5 g/L 組精子快速運(yùn)動的時間和壽命，與Na+濃度0.4 g/L組的快速運(yùn)動時間及壽命不存在顯著差別，但跟其余各組的快速運(yùn)動時間和壽命有顯著差異。

由表5可知，當(dāng)Ca2+濃度為0.3 g/L時， 精子快速運(yùn)動時間和精子激活比例最高，分別為（22.3±3.5）s， （81.7±2.9）％。Ca2+濃度0.4 g/L組精子快速運(yùn)動時間和壽命以及激活率與Ca2+濃度0.3 g/L組差異不顯著，與其余各組差異顯著。當(dāng)Ca2+濃度大于0.3 g/L時，隨Ca2+濃度的增加，精子激活比例降低。

由表6可知，當(dāng) Mg2+濃度為 0.3 g/L 時，精子快速運(yùn)動的時間和壽命最長，精子激活的比例最高，分別是（23.0±2.0）s、（ 60.7±4.7）s、（88.3±2.9）%。Mg2+濃度0.3 g/L組的精子快速運(yùn)動時間、壽命以及激活率，與Mg2+濃度0.4 g/L組的差異不明顯，而與其余各組的差異顯著。當(dāng)Mg2+濃度低于0.3 g/L時，精子快速運(yùn)動的時間及壽命會隨著Mg2+濃度的增加而增加，精子激活比例也隨之增加;當(dāng)Mg2+濃度大于0.3 g/L時，隨Mg2+濃度的增加，精子激活比例降低。

綜上所述，本溪細(xì)鱗魚精子快速運(yùn)動時間、壽命、激活比例隨著Na+、Ca2+、Mg2+濃度的增加呈先增加后減少的趨勢，具有相同的變化規(guī)律。當(dāng)Na+、Ca2+、Mg2+濃度分別為0.5 g/L，0.3 g/L，0.3 g/L時，精子快速運(yùn)動時間和存活時間最長、精子激活率最高。

2.4 冷藏時間對本溪細(xì)鱗魚精子激活率的影響

由表7可知，魚類精子的激活率與魚體本身的精子質(zhì)量有關(guān)，并且隨著冷藏時間的增加，精子激活率逐漸降低，直到精子逐漸失活。冷藏12 h后精子激活率大幅度下降，直到冷藏36 h后精子不再被自來水激活。

3 討論

3.1 pH對本溪細(xì)鱗魚精子活力的影響

硬骨魚類精巢和精漿中的精子一般是不活動的，卻具有潛在運(yùn)動能力，只有排到體外的精子被激活液或外界水環(huán)境稀釋后，其所處環(huán)境的滲透壓發(fā)生變化后才能被激活，具有活動能力[4]。

從已有研究成果可知，大多數(shù)淡水魚類精漿的pH值范圍在7.0～9.0之間，呈偏堿性[5]。本次試驗(yàn)結(jié)果得出，當(dāng)pH為8時，精子活力最高。由試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)可知，激活本溪細(xì)鱗魚精子的最適pH值在8左右，與大眼鱖、彩鯽、翹嘴紅鲌、長鰭籃子魚類似[6]。可以看出，大多數(shù)魚類精子活力的適宜pH與精漿的pH范圍一致。因此，本溪細(xì)鱗魚在人工授精時，選擇偏堿性的水環(huán)境能夠有效提高人工授精時的受精率[7]。

3.2 單糖對本溪細(xì)鱗魚精子活力的影響

單糖是魚類精漿的組成成分之一，是魚類精漿中主要碳水化合物。單糖（特別是葡萄糖、半乳糖和果糖）可以為體外受精的魚類精子運(yùn)動提供能量供應(yīng)[8]。不同魚類對單糖的吸收和利用也存在差異，如葡萄糖對細(xì)鱗斜頜鲴（Plagiognathops microlepis）的精子活力無明顯促進(jìn)作用[9]。而在一定濃度范圍內(nèi)，葡萄糖能促進(jìn)本溪細(xì)鱗魚精子活力，表明本溪細(xì)鱗魚精子有利用細(xì)胞外源性葡萄糖的能力。本溪細(xì)鱗魚的最適葡萄糖濃度在50 mmol/L左右，這一結(jié)果和翹嘴紅鮊、彩鯽的最適葡萄糖濃度相似[10]。當(dāng)葡萄糖濃度高于125 mmol/L時，本溪細(xì)鱗魚精子活力明顯受到抑制，可能是葡萄糖濃度升高致外界溶液滲透壓過高，破壞了精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)[11]。

3.3 無機(jī)離子對本溪細(xì)鱗魚精子活力的影響

Na+、K+是組成魚類精漿的重要物質(zhì)，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的重要因素。適宜的Na+、K+濃度， 是保持魚類精子活力的重要條件。研究表明0.3～0.7 g/L Na+濃度范圍是淡水魚類精子被激活的最佳范圍。例如多線盤鮈（Discogobio multilineatus Cui）[12]、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[13]、四川裂腹魚（Schizothorax kozlovi）[14]等。本試驗(yàn)表明，適宜的Na+濃度可以增強(qiáng)本溪細(xì)鱗魚的精子活力，Na+最適濃度為0.5 g /L，與大鱗鲃（Barbus capito）結(jié)果相同[15]。

K+濃度對不同魚類影響差別極大，比如在鮭科魚類精漿中，K+是抑制精子運(yùn)動的主要原因，當(dāng)精液排入淡水使K+濃度降低后，精子便被激活，其原因是精漿中有高出血漿5～10倍的K+，當(dāng)精液排入淡水中，K+濃度的降低起到了激活精子活動的作用[16]；而在鯉科魚類精漿中，適宜濃度的K+對精子活力有明顯的促進(jìn)作用，也有延長精子壽命的作用。例如蛇鮈（Saurogobio dumerili）、湖擬鯉（Rutilus rutilus lacustris）等[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K+離子濃度到0.8 g/L時本溪細(xì)鱗魚精子活力被完全抑制。與同屬鮭科的虹鱒魚結(jié)果相似。由此可見，本溪細(xì)鱗魚精子的抑制因子是K+。

Mg2+、Ca2+等金屬離子也是影響魚類精子活力的重要因素之一。激活鮭鱒類、鯉科魚類和鱘類精子活力的必要因子是水環(huán)境中的Ca2+[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，本溪細(xì)鱗魚精子活動時間的變化規(guī)律是相似的，呈先增加后減少的趨勢，與當(dāng)前相關(guān)的研究結(jié)果大致相同。本溪細(xì)鱗魚精子在不同濃度溶液中的活動時間也不同。比較發(fā)現(xiàn)，不同濃度Na+組的精子運(yùn)動時間和壽命均高于同濃度 Mg2+和 Ca2+組，由此推出，Na+是促進(jìn)本溪細(xì)鱗魚精子活力的主要因素。

離子與滲透壓之間相互作用、相互聯(lián)系，共同影響精子活力。近幾年的一些相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明，魚類精漿的滲透壓范圍約是300 mOsmol/kg[19]。外界水環(huán)境滲透壓的變化會導(dǎo)致精子激活比例的變化。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在0.5 g/L的NaCl溶液中，本溪細(xì)鱗魚精子的快速運(yùn)動時間和壽命最長，精子激活比例最高。由此推測，本溪細(xì)鱗魚精子本身的滲透壓可能接近0.5 g/L NaCl溶液的滲透壓。受精率可以通過延長精子的快速運(yùn)動時間來提高。由此可知，在本溪細(xì)鱗魚人工授精時，可考慮用0.5 g/L NaCl溶液作為稀釋液，可以有助于提高受精率。

3.4 精子保存

在人工授精過程中，精子的保存是影響精子壽命和精子活動的又一關(guān)鍵因素。精子的活力隨著能量的消耗而降低，直到能量全部消耗光精子的壽命也隨之結(jié)束。精子能量消耗主要在運(yùn)動和調(diào)節(jié)滲透壓兩方面[20]。常通過控制溫度來降低精子的能量消耗，從而延長精子壽命。精子保存分常溫、低溫和超低溫三類。常溫保存的原理是配制適宜濃度的稀釋液，降低精子調(diào)節(jié)滲透壓平衡的能量消耗，使存活時間延長數(shù)小時。低溫保存的原理是低溫下精子細(xì)胞代謝不活躍，可將其壽命延長數(shù)天至十幾天[21]。超低溫保存是讓精子在超低溫（-80 ℃）的條件下處于假死狀態(tài)，從而使精子永久保存下來，解凍后精子活力會恢復(fù)到原來的狀態(tài)[22]。

4 結(jié)論

本溪細(xì)鱗魚人工授精時授精激活溶液應(yīng)在，溶液pH為8，且應(yīng)含0.5 g/L Na+、0.3 g/L Mg2+、0.3 g/L Ca2+和50 mmol/L葡萄糖的自來水中配置，精子的保存應(yīng)該在超低溫下進(jìn)行保存，可降低精子代謝活動。

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Effects of pH， glucose and several cations on sperm motility of Benxi Brachymystax lenok Pallas

LI Zhuoran1，HU Yayue1，WANG Maolin1，WANG Chang’an2

（1.Liaoning Northern Key Laboratory of Applied Biology and Aquaculture of Fish， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China;2. Heilongjiang Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Harbin 150000， China）

Abstract：To provide a theoretical basis for the selection of the best fertilization activation medium in the artificial breeding of Benxi Manchurian trout（Brachymystax lenok Pallas）， and also to provide a scientific basis for the preparation of sperm dilution and preservation solution of the fish， the effects of pH， glucose， metal ions such as Na+， K+， Ca2+， Mg2+ and cold storage time on sperm motility of Benxi Manchurian trout were studied by plate slide method. The results showed that sperm should be stored at ultra-low temperatures， the activation solution of artificial insemination of Benxi Manchurian trout should be prepared with tap water， pH 8， and contain 0.5 g/L Na+， 0.3 g/L Mg2+， 0.3 g/L Ca2+ and 50 mmol/L glucose. It was concluded that the appropriate pH value and glucose， Na+， Mg2+， Ca2+ can enhance sperm motility of Benxi Manchurian trout. K+ can inhibit the sperm motility of Benxi Manchurian trout. Na+ is the main factor promoting sperm motility of Benxi Manchurian trout.

Key words：Brachymystax lenok Pallas; sperm motility; metal ions; pH; glucose

（投稿日期：2024-06-27；修回日期：2024-07-09）

基金項(xiàng)目：2021年遼寧省海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展項(xiàng)目資助；2023年遼寧省教育廳面上項(xiàng)目（JYTMS）。

作者簡介：李卓然（1999.02-），女，在讀碩士， 研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)。E-mail：2460433369@qq.com。

作者簡介：王茂林（1980.04-），男，博士，副教授， 研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)。 E-mail：wangmaolin@dlou.edu.cn。