不同構型的氟苯尼考體外抑菌活性研究

摘要：采用管蝶法研究不同構型的氟苯尼考是否具有抑菌活性。結果表明左旋氟苯尼考對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌作用；而右旋氟苯尼考對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌無抑菌作用；外消旋氟苯尼考對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用，其抑菌作用來自左旋氟苯尼考。

關鍵詞：構型；氟苯尼考；管碟法；抑菌活性

氟苯尼考，化學分子式為C12H14Cl2FNO4S，英文名Florfenicol，化學全稱為D-（+）-蘇-1-對甲砜基苯基-2-二氯乙酰氨基-3-氟丙醇[1]，是《中華人民共和國獸藥典》（2020年版）中收錄的氯霉素類合成抗生素獸用藥。氟苯尼考屬于酰胺醇類抗生素，通過抑制細菌蛋白質的合成起殺菌作用，具有廣譜抗菌的特點[2]，可用于治療敏感細菌感染的家禽、家畜和魚等，對致病細菌感染導致的呼吸系統和腸道疾病有奇效[3]。對敏感菌的抗菌活性與氯霉素和甲砜霉素相似，但對耐氯霉素及甲砜霉素的細菌仍敏感[4]，如金黃色葡萄球菌、溶血性巴氏桿菌、傷寒沙門氏菌、克雷白氏桿菌、大腸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等[5]。研究表明：氯霉素中芳香環上含對位硝基官能團，該結構的存在會引起動物機體的再生障礙性貧血，有嚴重的不良反應。因而被禁用。氟苯尼考是將氯霉素中-NO2基團以-CH3-SO2基團替換，改變了空間構型，使得該不良反應消除，因此可廣泛應用于食品動物細菌性疾病臨床[6]。

本實驗取用下列兩種同分異構體：

1）N-[（1R，2S）-1-氟甲基-2-羥基-2-（4-甲砜基）苯基]乙基-2，2-二氯乙酰胺，結構式如圖1。比旋度為-18°，以下簡稱為左旋氟苯尼考；

2）N-[（1R，2R）-1-氟甲基-2-羥基-2-（4-甲砜基）苯基]乙基-2，2-二氯乙酰胺，結構式如圖2。比旋度為+18°，以下簡稱為右旋氟苯尼考。

本試驗采用管碟法進行了不同構型的氟苯尼考抑菌活性的研究，為生產具有生物活性的氟苯尼考提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥品

左旋氟苯尼考、右旋氟苯尼考、外消旋氟苯尼考均來自湖北省龍翔藥業有限公司。外消旋氟苯尼考為等量的左旋氟苯尼考和右旋氟苯尼考混合得到，其比旋度為0°。

1.2 菌種

標準菌株：大腸桿菌/大腸埃希菌（escherichia coli，E. coli），金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，S. aureus），禽巴氏桿菌（avian pasteurella multocida，Apm），豬胸膜肺炎放線桿菌（actinobacillus pleuropneumoniae，App），以上菌株均購自中檢所，傳代代數均為5代以內。

1.3 培養基及儀器

普通肉湯培養基，六號（VI）培養基，二號（II）培養基，鮮血瓊脂培養基，巧克力瓊脂培養基（含V因子和X因子），DNP-9082型電熱恒溫培養箱，恒溫水浴鍋，游標卡尺。

1.4 抑菌活性的測定

1）菌懸液的制備。先對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、禽巴氏桿菌和豬胸膜肺炎放線桿菌的冷凍菌種進行復蘇，再將其接種在牛肉湯蛋白胨培養斜面上，37 ℃下培養20～22 h。用10 mL滅菌水將菌苔洗下備用。

2）樣品溶液制備。精密稱取左旋氟苯尼考、右旋氟苯尼考和外消旋氟苯尼考0.025 g，用少量無水乙醇溶解樣品后用滅菌水定容至50 mL。

3）管碟法測抑菌活性：

大腸桿菌雙碟的制備：取121 ℃、20 min滅菌后的標準尺寸玻璃平皿（底部無明顯形變），VI培養基及營養瓊脂培養基同條件滅菌后，放置于恒溫水浴鍋中，50 ℃保溫。待溫度平衡后，在玻璃平皿中緩慢勻速注入VI培養基20 mL。輕微搖晃，使培養基分布均勻，再放置于水平桌面上（桌面以水平尺調節水平），使凝固，作為底層培養基。底層培養基完全凝固后，放置于40～50 ℃的恒溫加熱板上，避免底部過冷上層培養基凝固過快導致雙碟凹凸不平，影響實驗結果。在保溫至平衡的營養瓊脂中加入大腸桿菌懸液，按照每100 mL營養瓊脂培養基加0.8 mL大腸桿菌懸液。輕微搖晃使均勻，在上述底層培養皿中分別加入10 mL含大腸桿菌的混合培養基，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置在水平臺上冷卻后，在培養基中等距離分散放置牛津杯2個。

①取7個雙碟在培養皿合適位置處做標記，在靠近標記的牛津杯中用移液槍移取50 μL的左旋氟苯尼考溶液，在另一個牛津杯中取50 μL的右旋氟苯尼考溶液，再重復6次；

②取7個雙碟在培養皿合適位置處做標記，在靠近標記的牛津杯中用移液槍移取50 μL的外消旋氟苯尼考溶液，在另一個牛津杯中取50 μL的左旋氟苯尼考溶液，再重復6次；

③取7個雙碟在培養皿合適位置處做標記，在靠近標記的牛津杯中用移液槍移取50 μL的右旋氟苯尼考溶液，在另一個牛津杯中取50 μL的外消旋氟苯尼考溶液，再重復6次；

④取7個雙碟在培養皿合適位置處做標記，在靠近標記的牛津杯中用移液槍移取100 μL的外消旋氟苯尼考溶液，在另一個牛津杯中取50 μL的右旋氟苯尼考溶液，再重復6次。

金黃色葡萄球菌雙碟的制備：按照大腸桿菌雙碟的制備方法中同法制備底層培養基，其中VI培養基更換為II培養基，其他方法不變。再同上述方法制備金黃色葡萄球菌雙碟。

禽巴氏桿菌雙碟的制備：按照大腸桿菌雙碟的制備方法中同法制備底層培養基，其中VI培養基更換為鮮血瓊脂培養基，其他方法不變。再同上述方法制備禽巴氏桿菌雙碟。

豬胸膜肺炎放線桿菌雙碟的制備：按照大腸桿菌雙碟的制備方法中同法制備底層培養基，其中VI培養基更換為巧克力瓊脂培養基，其他方法不變。再同上述方法制備禽巴氏桿菌雙碟。

2 實驗結果

2.1 不同構型的氟苯尼考對不同菌種的抑菌效果

通過管碟法對不同構型的氟苯尼考對不同敏感菌進行陽性菌測試實驗，以透明抑菌圈的大小進行抑菌效果評價。符號“+++”為對相關菌株抑制的高度敏感性，符號“++”為對相關菌株抑制的中度敏感性，符號“+”為對相關菌株抑制的低度敏感性，符號“-”為沒有抑菌圈生成，無抑菌性。

實驗結果（表1）表明，左旋氟苯尼考對本實驗選用的4個敏感菌株均具有較好的抑菌活性；而右旋氟苯尼考均無抑菌圈產生，無抑菌活性；外消旋氟苯尼考產生的抑菌圈大小僅次于左旋氟苯尼考，也展現出較好的活性，可能其抑菌性來自左旋氟苯尼考。

2.2 左旋氟苯尼考與右旋氟苯尼考對受試菌的影響對比

由圖3可以看出，右旋氟苯尼考無抑菌透明圈，對受試菌沒有抑制作用，左旋氟苯尼考對受試菌抑制作用明顯。

2.3 左旋氟苯尼考與外消旋氟苯尼考對受試菌的影響對比

由圖4可以看出，外消旋氟苯尼考對受試菌有一定的抑制作用，左旋氟苯尼考對受試菌抑制作用明顯。

以游標卡尺測量左旋氟苯尼考與外消旋氟苯尼考對大腸桿菌的抑菌透明圈直徑，見表2。左旋氟苯尼考（添加量50 μL）平均抑菌圈直徑為28.76 mm，RSD7為0.22%，顯示出良好的重復性和準確性。外消旋氟苯尼考平均抑菌直徑為25.80 mm（添加量50 μL），其中一組異常數據27.80 mm舍棄，可能為雙碟不平或牛津杯底部不平等原因導致，RSD6為0.10%，顯示出良好的重復性和準確性。將外消旋氟苯尼考濃度提升1倍后平均抑菌直徑為28.75 mm（添加量100 μL），RSD7為0.22%，顯示出良好的重復性和準確性。

實驗結果表明，在相同實驗條件下，左旋氟苯尼考相較于外消旋氟苯尼考有更強的抑菌能力，左旋氟苯尼考在低濃度下對大腸桿菌表現出較高的生物活性，能夠抑制其生長繁殖。而外消旋氟苯尼考將濃度提升一倍后，平均抑菌直徑與左旋氟苯尼考相似，因此可以確定外消旋氟苯尼考抑菌性來自左旋氟苯尼考。

2.4 右旋氟苯尼考與外消旋氟苯尼考對受試菌的影響對比

由圖5可以看出，外消旋氟苯尼考對受試菌有一定的抑制作用，右旋氟苯尼考對受試菌沒有抑制作用。

3 結論

本實驗通過對左旋氟苯尼考、右旋氟苯尼考及外消旋氟苯尼考對多種細菌菌株的抑菌活性進行深入研究，得出了明確的結論。實驗結果表明，左旋氟苯尼考對本實驗選用的四種常見病原體均具有顯著的抑菌作用，能夠有效抑制這些菌株的生長繁殖，控制畜禽養殖過程中的相關感染。相反，右旋氟苯尼考則對上述菌株沒有顯示出任何明顯的抑菌效果。實驗結果表明氟苯尼考生物活性與其構型存在關聯性，與左旋氟苯尼考的含量呈正相關，這與不同構型氟苯尼考對致病菌作用靶點相關[7]。這一發現有助于理解氟苯尼考立體異構體在藥效上的不同表現。

鑒于以上研究結果，在實際生產和臨床應用中，為了提高氟苯尼考藥物的實際作用療效，應當提升制劑中左旋氟苯尼考的含量，避免出現假藥或劣藥，以次充好。通過測定左旋氟苯尼考的含量，可以確保氟苯尼考藥物的生物作用效果，還可以針對性地制定科學用藥方案，減少治療過程中的藥物殘留，提升食品安全質量。

參考文獻：

[1] 萬進，麻紅利，孫少輝.氟苯尼考及其制劑研究進展[J].中國獸藥雜志，2022，56（10）：54-59.

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[3] 何英霞，覃智斌，梁世仁，等.氟苯尼考的毒副作用及其在豬臨床上的應用[J].現代畜牧科技，2021（7）：10-11+13.

[4] 王麗平，江善祥，史曉麗，等.氟苯尼考體外抗菌活性測定[J].獸藥與飼料添加劑，2003（2）：13-14.

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[7] 文麗，吳澤華，李仕超.氟苯尼考手性特性及在臨床上的應用[J].豬業科學，2016（8）：70-71.