鴨疫里氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

摘要：本研究從重慶榮昌某養鴨場疑似患鴨疫里氏桿菌的病死鴨體內采取病料，經分離純化后，獲得一株細菌，采用生化試驗和16S rRNA基因測序技術進行鑒定。結果表明，分離株的生化試驗符合鴨疫里氏桿菌的特性，16S rRNA基因序列與RA strain1120的同源性達到99.7%，確定該分離菌為鴨疫里氏桿菌。雛鴨致病性試驗，試驗組肌肉注射分離菌液0.2 mL（2.6×108 CFU），接種3 d后，雛鴨出現明顯的臨床癥狀，7 d后，雛鴨全部死亡。藥敏試驗結果顯示對慶大霉素、頭孢氨芐、多西環素、卡那霉素、氨芐西林等多種藥物耐藥。

關鍵詞：鴨疫里氏桿菌；16S rRNA；同源性；藥敏試驗

鴨疫里氏桿菌病是鴨、雞等禽類的一種急性高度接觸性傳染病，主要侵害1～2月齡特別是1月齡內的雛鴨，其發病率和死亡率都較高，分別可達90%和75%以上[1]。感染后，病鴨出現食欲減退或不食，呼吸道癥狀，口鼻有黏性汁液流出，關節腫大，跛行[2]，排黃綠色稀糞并有神經癥狀等[3]，該病存在于我國各養鴨地區并呈全球流行性，給我國以及世界各養鴨國的經濟發展都造成了重創。

鴨疫里氏桿菌病的病原鴨疫里氏桿菌（riemerella anatipestifer，RA）隸屬于里默桿菌屬，為革蘭氏陰性菌，菌體呈多形態，如小桿狀、橢圓形以及長絲狀，無鞭毛，不形成芽孢。RA的生長需要較高的營養條件，在巧克力瓊脂培養基上生長良好，若接種于普通培養基上則不會生長。RA的血清型共有21種，命名為血清1-21型，程安春等[4]于二十世紀初，通過研究又發現了RA的四種新的血清型。目前，在我國流行的有血清1-8型以及10、11、13、14型。

近年來，抗生素廣泛用于細菌性傳染病的治療，在其發揮治療作用的同時，由于其在臨床上的濫用，已造成了嚴重耐藥性的發生，其中關于鴨疫里氏桿菌抗藥的報道也逐漸增多，因此對該菌進行耐藥性鑒定有利于為臨床用藥提供依據[5]。

1 材料與方法

1.1" 試驗動物和材料

1）試驗動物：10日齡健康雛鴨（櫻桃谷鴨）購自重慶永健生物技術有限公司，所有試驗用鴨經實驗室檢測為鴨疫里氏桿菌陰性。

2）主要試劑：鮮血瓊脂培養基；巧克力瓊脂培養基；馬丁肉湯；LB營養肉湯；抗菌藥物藥敏紙片；細菌生化管；細菌基因組DNA提取試劑盒；PCR擴增反應試劑盒；引物；DNA膠回收試劑盒；DNA Marker；核酸染色劑；10×Loading Buffer購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1）病料來源與采集。重慶榮昌某養鴨場3～6周齡的鴨發病，死亡率達12%。無菌操作，從該鴨場病死鴨采集病料。

2）病原分離。將病樣接種于巧克力瓊脂平板上，在37 ℃培養箱中培養48 h，勾取疑似的單個菌落進行下一步純化，最后獲得純化菌株，命名為RA40，4 ℃下保存備用。

3）形態學觀察。將RA40培養于巧克力瓊脂平板中，置于37 ℃恒溫箱中，48 h后觀察其生長狀況、菌落特性。勾取培養基上的單個菌落涂片，經革蘭氏染色，通過鏡檢，對細菌形態特點進行觀察記錄。

4）生化試驗。分離菌株分別進行糖發酵試驗（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）、吲哚試驗、MR試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、明膠液化試驗等，置于37 ℃恒溫箱48 h，觀察并記錄結果。

5）16S rRNA基因的擴增及測序。挑取細菌的單個菌落接種至5 mL LB營養肉湯，37 ℃振蕩培養48 h。根據細菌基因組提取試劑盒的說明書，進行細菌基因組提取，PCR擴增16S rRNA基因。PCR擴增采用25 μL體系：Premix Ex Taq12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O 6.5 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，經35個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳，將結果截圖保存；PCR產物按照PCR產物凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收，并將回收產物交由生物公司對細菌的基因組進行測序。

6）致病性試驗。取一周齡健康雛鴨10只隨機分成2組，一組為試驗組，肌肉注射分離菌培養菌液0.2 mL（2.6×108 CFU） ，另一組為空白對照組，分別隔離飼養、觀察并記錄雛鴨的生理狀況。

7）藥敏試驗。用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，吸取30 μL菌液（2.6×108 CFU），均勻涂布于巧克力瓊脂平板表面，待完全吸收后，將各藥敏片貼附在平板的合適位置。置于37 ℃培養箱中48 h，觀察抑菌情況。判定標準參照美國實驗標準委員會（NCCLS）藥敏紙片擴散法規則標準。

2 試驗結果

2.1 培養特性及形態學觀察

RA40菌株于37 ℃培養48 h，在巧克力瓊脂平板上，呈圓形、凸起、邊緣整齊、光滑透明的菌落（圖1）。革蘭氏染色為陰性菌，菌體呈桿狀、橢圓等多種形態。單個或成雙存在（圖2）。

2.2 生化鑒定結果

2.3 16S rRNA基因擴增及測序

經16S rRNA基因擴增，獲得凝膠電泳片段與目的片段大小相符（圖4）。PCR產物根據PCR產物凝膠回收試劑盒說明書的步驟，進行膠回收，再送至生物公司進行細菌基因測序。

2.4 細菌的基因序列鑒定與系統發育分析

經16S rRNA基因的測序，獲得大小為1 420 bp的基因序列（見附錄），通過NCBI的Blast檢索系統，選擇與其相關性較高的序列，通過DNA star軟件進行同源性分析（圖4）和系統發育樹的構建（圖5）。發現該分離菌株與RA strain-11202的同源性達99.7%，說明該分離菌為鴨疫里氏桿菌。

2.5 致病性試驗結果

接種3d后，雛鴨出現明顯的臨床癥狀，表現為精神萎靡、食欲不振、不愿走動、下痢等。接種7 d后，雛鴨全部死亡，剖檢可發現氣囊、心包、肝周病變。

2.6 藥敏試驗結果

3 分析與討論

本研究從重慶榮昌某鴨場病死鴨采集病料，分離純化得到一株細菌，對該菌進行了形態學鑒定和生化試驗，初步判斷為鴨疫里氏桿菌。為了進一步得到確切的結果，可使用現代分子生物技術。目前，16S rRNA基因序列測定技術已經廣泛地應用于細菌的鑒定。通過該技術對目的基因進行擴增、電泳、測序，同時將所測得的基因序列通過NCBI的Blast檢索系統進行同源性分析以及系統發育樹的構建，結果如圖5、圖6顯示，RA40與RA strain11202同源性最高，為99.7%，因此確定該菌株為鴨疫里氏桿菌。

通過藥敏試驗篩選出病原菌的敏感藥物是臨床治療傳染病的重要原則。藥敏試驗結果發現RA40對慶大霉素、多西環素、卡那霉素、氨芐西林、頭孢氨芐等抗菌藥物耐藥，僅對四環素、紅霉素等幾種藥物敏感。本次試驗結果表明RA已呈現出多重耐藥，且與已有研究報道的藥物敏感結果有一定的差異。因此，在實際臨床治療的過程中，應該嚴格地開展藥物篩選，合理用藥，以保證療效和避免耐藥性的產生。

4 結論

本試驗從榮昌某發病鴨場病死鴨采集病料，分離純化得到一株細菌，采用生化試驗和16S rRNA基因測序技術進行分析，鑒定出該菌株為鴨疫里氏桿菌。致病性試驗結果表明小劑量RA菌液即可導致一周齡雛鴨全部死亡。藥敏試驗鑒定發現該菌對慶大霉素、多西環素、卡那霉素、氨芐西林、頭孢氨芐等抗菌藥物耐藥，僅對四環素、紅霉素等幾種藥物敏感。

參考文獻：

[1] 李春芬，李郁. 鴨疫里氏桿菌病研究進展[J].動物醫學進展，2007，28（8）：64-67.

[2] 田樹飛，李子平.鴨疫里默氏桿菌病原與防治研究進展[J].安徽農業科學，2007，35（20）：6150-6151.

[3] 蔡寶祥.動物傳染病診斷學[M].江蘇科學技術出版社，1991，201-203.

[4] 程安春，汪銘書，陳孝躍，等.我國鴨疫里默氏桿菌血清型調查及新血清型的發現和病原特性[J].中國獸醫學報，2003，23（4）：320-323.

[5] 程安春，汪書銘，郭宇飛，等. 鴨疫里默氏桿菌病及其在我國的流行動態和防治對策[J].中國家禽，2003，25（11）：29-31.