野櫻莓果渣酵素發酵工藝優化及抗氧化活性研究

摘要：為了充分利用野櫻莓果渣副產物，變廢為寶，該試驗選取酵母菌和干酪乳桿菌對野櫻莓果渣進行發酵，以總酚含量、SOD酶活性為指標，通過單因素試驗和響應面試驗確定酵母菌發酵的最優工藝參數為接種量0.40%、發酵溫度27.1 ℃、發酵時間12 h、初始糖度17.99%。在酵母菌發酵12 h后，在37 ℃條件下接種干酪乳桿菌，其接種量為0.30%，靜置發酵16 h后在20 ℃環境中進行24 h的后發酵，使其產香。在此條件下，發酵液SOD酶活性為325.00 U/mL，總酚含量為1.981 mg/mL，酵母菌數為2.18×108 CFU/mL，干酪乳桿菌數為7.55×107 CFU/mL，總酸含量為3.23 g/dL；抗氧化活性結果表明，當酵素液濃度為60 μg/mL時，DPPH·、·OH和ABTS+·清除率分別為（94.05±0.003）%、（94.11±0.018）%和（99.50±0.002）%，其還原力為VC對照組的81.12%。

關鍵詞：野櫻莓；果渣；酵素；發酵；抗氧化活性

中圖分類號：TS255.36 """""文獻標志碼：A """"文章編號：1000-9973（2024）09-0029-09

Optimization of Fermentation Technology of Aronia melanocarpa Pomace

Enzyme and Study on Its Antioxidant Activity

YANG Liu1， DING Xue1， JIANG Zhi-peng1， CHEN Wen-wen1，

CHEN Sheng1， MA Ning1， XU Sheng-yu2， WANG Jing-yi3*

（1.School of Food Science and Engineering， Changchun University， Changchun 130022， China;

2.Baishan Linyuanchun Ecological Technology Co.， Ltd.， Baishan 134300， China;

3.Office of Academic Affairs， Changchun University， Changchun 130022， China）

Abstract： In order to fully utilize the by-products of Aronia melanocarpa pomace and turn waste into treasure， yeast and Lactobacillus casei are selected to ferment Aronia melanocarpa pomace. With the total phenol content and SOD enzyme activity as the indexes， the optimal technology parameters for yeast fermentation are determined by single factor test and response surface test as follows： inoculation amount is 0.40%， fermentation temperature is 27.1 ℃， fermentation time is 12 h and initial sugar content is 17.99%. After 12 h of yeast fermentation， Lactobacillus casei is inoculated at 37 ℃with the inoculation amount of 0.30%. After 16 h of static fermentation， 24 h of post fermentation is carried out at 20 ℃ to make it produce aroma. Under these conditions， SOD enzyme activity of fermentation broth is 325.00 U/mL， total phenol content is 1.981 mg/mL， yeast count is 2.18×108 CFU/mL， Lactobacillus casei count is 7.55×107 CFU/mL， and total acid content is 3.23 g/dL. The antioxidant activity results show that when the concentration of enzyme liquid is 60 μg/mL， the scavenging rates on DPPH·， ·OH and ABTS+· are （94.05±0.003）%， （94.11±0.018）% and （99.50±0.002）% respectively， and the reducing power is 81.12% of that of VC control group.

Key words： Aronia melanocarpa; pomace; enzyme; fermentation; antioxidant activity

收稿日期：2024-03-25

基金項目：吉林省教育廳項目（JJKH20230682KJ）;吉林省科技廳項目（20220202082NC）

作者簡介：楊柳（1981—），女，副教授，博士，研究方向：農產品加工與貯藏。

*通信作者：王靜怡（1989—），女，講師，碩士，研究方向：有機化學。

野櫻莓也稱不老莓，主要用于果汁、果酒的生產，而果渣作為加工廢棄物多被丟棄，既降低了營養成分的利用率，造成資源浪費，又引起環境污染。據報道，我國每年產生的野櫻莓果渣有幾百萬噸。有研究表明，野櫻莓果渣中含有豐富的營養物質，如花青素、原花青素、多酚、黃酮等，其中多酚類物質含量是其他漿果的數倍[1]，果渣具有抗氧化、抑菌、抗炎癥和保護心腦血管等諸多生理功能[2-4]。

酵素作為一種生物催化劑，參與體內的多種代謝活動[5]。酵素為酶的舊稱，不僅用來形容酶，而且用來形容產酶微生物和有關調節因子之間的相互作用[6]。酵素中含有豐富的蛋白酶、超氧化物歧化酶、脂肪酶、花青素、多酚類、維生素、礦物質等營養成分[7-8]，具有潤腸通便、消炎殺菌、抗氧化、凈化血液等功效[9-12]。

干酪乳桿菌具有降血壓、防治腹瀉、提高免疫力、降低膽固醇等作用，現多被應用于酸乳、保健飲品中[13]；酵母菌除了能豐富發酵制品的風味外，還能很好地抑制有害菌的生長，并對人體存在益生功能[14]。

本試驗以野櫻莓果渣為原料，采用二步發酵法制備野櫻莓果渣酵素，并對其抗氧化活性進行研究。此研究對提高野櫻莓資源的綜合利用率、產品附加值及對吉林省地方經濟發展、解決就業、農民創收具有十分重要的意義。

1 材料與設備

1.1 發酵菌種

葡萄酒、果酒專用酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；干酪乳桿菌：鄭州百益寶生物技術有限公司。

1.2 材料與試劑

酵母膏、蔗糖、碳酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸鈣、硫酸鎂、MRS瓊脂、MRS肉湯、沒食子酸、福林酚、鄰苯三酚、三氯乙酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、水楊酸、無水乙醇、抗壞血酸、無水碳酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗設備

UV2700紫外可見分光光度計 日本島津儀器有限公司；HD-E804-55A電熱鼓風干燥箱 上海儀電物理光學儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；DHP-600電熱恒溫培養箱 上海坤誠科學儀器有限公司；XFS-280MB高壓滅菌鍋 上海尚儀儀器設備有限公司；MSD510熒光顯微鏡 邁時迪（東莞）科技有限公司。

1.4 實驗內容與方法

1.4.1 野櫻莓果渣酵素的制備

1.4.1.1 工藝流程

圖1 果渣酵素制備的工藝流程圖

Fig.1 Process flow diagram of preparation of pomace enzyme

1.4.1.2 操作要點

a.酶解

果渣按1∶2.5的料液比（g/mL）加入蒸餾水，按照底物質量分數3%添加纖維素酶與果膠酶，二者質量比為1.3∶1，酶解時間為2 h，酶解溫度為50 ℃，酶解pH值為5。

b.調配

參考楊培青[15]的方法，按照質量比向酶解液中補充0.2%酵母膏、0.8%碳酸銨、1.7%磷酸氫二鉀、0.02%磷酸鈣、0.02%硫酸鎂，調節發酵液的pH值至5，再添加蔗糖，通過糖酸一體機對其糖度進行測定，使其達到設定初始糖度。

c.滅菌

將調配好的發酵液進行巴氏殺菌，加熱至85 ℃，保溫15 s，冷卻至室溫備用。

d.菌種活化培養

酵母菌用100 mL無菌生理鹽水溶解，在30 ℃下水浴30 min，于4 ℃下冷藏保存[16]；干酪乳桿菌用MRS培養基在37 ℃下進行二代培養，再在MRS肉湯培養基中靜置培養48 h，在4 ℃下冷藏保存。

e.接種

在無菌環境下，保證發酵液充分溶氧，先后接入酵母菌、干酪乳桿菌。

f.發酵

對調配好的果渣酶解液進行靜置發酵，測定酵素液總酚含量和SOD酶活性。

1.4.2 酵母菌發酵的單因素試驗

由表1可知，以總酚含量和SOD酶活性為指標，分別考察酵母菌發酵時間、發酵溫度、初始糖度和接種量4個因素，確定最適酵母菌發酵條件。

1.4.3 酵母菌發酵的響應面試驗

在單因素試驗的基礎上設計響應面試驗，確定酵母菌發酵的最優工藝。

1.4.4 干酪乳桿菌發酵的單因素試驗

在無菌環境下，向經酵母菌發酵后的發酵液中接入干酪乳桿菌。由表2可知，以總酚含量和SOD酶活性為指標，分別考察干酪乳桿菌發酵時間、發酵溫度和接種量3個因素，確定最適干酪乳桿菌發酵條件。

1.4.5 二次發酵試驗

本試驗先接種酵母菌，發酵到合適時間，再接種干酪乳桿菌。在保證野櫻莓果渣發酵液充分溶氧的條件下，以酵母菌的最優工藝參數進行發酵，發酵時間分別設定為8，12，16 h[15]，然后接種干酪乳桿菌，按照干酪乳桿菌發酵單因素試驗結果繼續發酵至終點。測定酵素液中總酸含量、總酚含量、SOD酶活性、酵母菌數和干酪乳桿菌活菌數，根據各指標的變化綜合確定干酪乳桿菌的最佳接入時間。

1.4.6 指標測定

1.4.6.1 總酚的測定

按照GB/T 31740.2—2015《茶制品 第2部分：茶多酚》中的方法進行測定。

1.4.6.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定

按照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》中第一種方法進行測定。

1.4.6.3 酵母菌的測定

按照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢測 霉菌和酵母計數》中直接鏡檢計數法進行測定。

1.4.6.4 干酪乳桿菌的測定

按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢測 乳酸菌檢驗》中的方法進行測定。

1.4.6.5 總酸的測定

按照GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》中的方法進行測定。

1.4.7 抗氧化活性測定

1.4.7.1 還原力的測定

參照劉夢培等[17]的方法。

1.4.7.2 DPPH自由基清除能力的測定

參照王佳[18]的方法。

1.4.7.3 羥基自由基清除能力的測定

參照段紅梅等[19]的方法。

1.4.7.4 ABTS自由基清除能力的測定

參照劉維兵等[20]的部分方法。

1.5 數據處理

采用SPSS軟件進行統計分析，結果用平均值±標準差表示，應用ANOVA分析各組結果間的顯著性差異（P＜0.05）；響應面試驗數據采用Design-Expert 8.0.6軟件進行處理；采用Origin 2019b軟件進行數據圖形處理。

2 結果與分析

2.1 酵母菌發酵的單因素試驗結果與分析

2.1.1 發酵時間的確定

由圖2可知，隨著發酵時間的延長，總酚含量和SOD酶活性均呈先上升后下降的趨勢。當發酵時間為12 h時，總酚含量和SOD酶活性均達到最高值，分別為（1.96±0.066） mg/mL和（235.00±7.806） U/mL。這可能是由于長時間發酵，使得酵母菌不斷生長繁殖，發酵產物有機酸等不斷增多，進而抑制酶活力。因此，確定酵母菌最適發酵時間為12 h。

2.1.2 發酵溫度的確定

由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，總酚含量和SOD酶活性均先上升后下降。當發酵溫度為27 ℃時，總酚含量和SOD酶活性均達到最高值，分別為（2.03±0.006） mg/mL和（240.00±3.039） U/mL。之后隨著溫度的升高，總酚含量和SOD酶活性均降低，這可能是由于過高的溫度影響了酵母菌的生長繁殖，進而抑制了果渣酵素的發酵。因此，確定酵母菌最適發酵溫度為27 ℃。

2.1.3 初始糖度的確定

由圖4可知，隨著初始糖度的增加，總酚含量先緩慢上升后下降，而SOD酶活性先上升后下降。當初始糖度為18%時，總酚含量和SOD酶活性均達到最高值，分別為（1.35±0.013） mg/mL和（190.00±1.767） U/mL。這是由于酵母菌在生長繁殖過程中不斷消耗糖類物質，適當增加初始糖度會促進酵母菌生長繁殖，進而影響總酚含量和SOD酶活性，但初始糖度過高反而會抑制酵母菌生長繁殖。因此，確定酵母菌最適發酵初始糖度為18%。

2.1.4 接種量的確定

由圖5可知，隨著酵母菌接種量的增加，總酚含量變化不明顯，而SOD酶活性先上升后下降。當酵母菌接種量為0.4%時，發酵液的總酚含量為（1.35±0.049） mg/mL，SOD酶活性達到最高值，為（240.00±3.039） U/mL，這可能是由于大量酵母菌生長，糖和氧被消耗完，發酵液中的營養物質無法滿足其生長繁殖需求，菌體活性受到影響，導致SOD酶活性下降。因此，確定酵母菌最適接種量為0.4%。

2.2 響應面試驗結果與分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken設計響應面試驗，響應面試驗因素及水平設計見表3，響應面試驗設計及結果見表4。

進行方差分析及顯著性檢驗，結果見表5和表6。

由表5和表6可知，兩個回歸模型均極顯著（P＜0.000 1），而失擬項均不顯著（Pgt;0.05），同時R2分別為0.994 5和0.982 7，RAdj2分別為0.988 9和0.965 4，說明兩個模型與實際擬合度較好，可對試驗結果進行很好的描述。

由方差分析結果可知，總酚含量回歸模型中A2、B2、C2、D2的P值均lt;0.000 1，影響極顯著。AB、BC、CD的P值均lt;0.01，影響高度顯著，A、B、C、D、BD的P值均gt;0.05，影響不顯著。由F值可知，各因素對酵母菌發酵工藝總酚含量的影響順序為發酵溫度（B）gt;初始糖度（C）gt;接種量（D）gt;發酵時間（A）；SOD酶活性回歸模型中AB、AC、AD、BC、A2、B2、C2、D2的P值均lt;0.000 1，影響極顯著，CD的P值lt;0.01，影響高度顯著，A、C、BD的P值均gt;0.05，影響不顯著，由F值可知，各因素對酵母菌發酵工藝SOD酶活性的影響順序為接種量（D）gt;發酵溫度（B）gt;發酵時間（A）gt;初始糖度（C）。

由圖6可知，等高線圖均呈橢圓形，AB、BC、CD間的交互作用對總酚含量的影響較顯著，曲面坡度陡峭，AC、AD間的交互作用對總酚含量的影響顯著，曲面較陡；由圖7可知，等高線圖均呈橢圓形，AB、AC、AD、BC間的交互作用對SOD酶活性的影響較顯著，曲面坡度陡峭，CD間的交互作用對SOD酶活性的影響顯著，曲面較陡峭。

根據響應面軟件以總酚含量和SOD酶活性為指標，優化得到最優發酵工藝參數為發酵時間11.97 h、發酵溫度27.07 ℃、初始糖度17.99%、酵母菌接種量0.40%，此時總酚含量和SOD酶活性分別為1.99 mg/mL和238.57 U/mL。

考慮實際操作的可行性與方便性，將最優工藝參數轉化為發酵時間12 h、發酵溫度27 ℃、初始糖度18%、接種量0.4%，在此最優條件下進行3次平行試驗，取平均值作為驗證結果，總酚含量為1.96 mg/mL，SOD酶活性為237.02 U/mL，該值與預測值基本吻合，說明該模型是合理有效的。

2.3 干酪乳桿菌發酵的單因素試驗結果與分析

2.3.1 發酵時間的確定

由圖8可知，隨著發酵時間的延長，酵素液中總酚含量呈緩慢下降趨勢，SOD酶活性呈先上升后下降的趨勢。發酵8～24 h，總酚含量由（1.932±0.006） mg/mL下降至（1.839±0.164） mg/mL，下降了4.81%；當發酵時間為16 h時，SOD酶活性達到最高值（295.00±1.767） U/mL。這可能是由于隨著發酵時間的延長，產生的有機酸降低了體系的pH值，減緩了酚類物質分解轉換的速率，隨著發酵代謝產物的增多，抑制了SOD酶活性，部分產物與酚類物質反應，導致其快速減少。因此，確定干酪乳桿菌最適發酵時間為16 h。

2.3.2 發酵溫度的確定

由圖9可知，隨著發酵溫度的升高，總酚含量和SOD酶活性均呈先上升后下降的趨勢。當發酵溫度為37 ℃時，總酚含量和SOD酶活性均達到最高值，分別為（1.98±0.022） mg/mL和（291.25±1.767） U/mL，這可能是由于溫度過高抑制了干酪乳桿菌的活性。因此，確定干酪乳桿菌最適發酵溫度為37 ℃。

2.3.3 接種量的確定

由圖10可知，隨著干酪乳桿菌接種量的增加，總酚含量和SOD酶活性均呈先上升后下降的趨勢。當干酪乳桿菌接種量為3%時，總酚含量和SOD酶活性均達到最高值，分別為（1.84±0.002） mg/mL和（271.25±0.678） U/mL。這可能是由于隨著干酪乳桿菌接種量的增加，發酵液中的營養物質不足以滿足菌種的生長繁殖需求，且初始發酵產生的有機酸等物質抑制了酶活性，使得酚類物質分解聚合更加頻繁。因此，確定干酪乳桿菌發酵最適接種量為3%。

2.4 二步發酵法干酪乳桿菌接種時間的結果與分析

由表7可知，在酵母菌發酵8～12 h后接種干酪乳桿菌至發酵結束，酵素液的pH值由初始值5.02下降至4.48，其余指標均呈上升趨勢，其中總酸含量相較初始值1.92 g/dL增加了68.22%，總酚含量相較初始值1.870 mg/mL增加了5.94%，SOD酶活性相較初始值306.25 U/mL增加了6.12%，酵母菌數為2.18×108 CFU/mL，干酪乳桿菌數為7.55×107 CFU/mL。在酵母菌發酵16 h后接種干酪乳桿菌至發酵結束，除酵母菌數外，總酸含量、總酚含量、SOD酶活性、干酪乳桿菌數與發酵12 h相比均有所下降。其原因可能是前期酵母菌發酵過程中消耗大量營養物質，進而導致后接入的干酪乳桿菌可利用的物質減少。且酵母菌發酵會產生乙醇，若發酵時間過長會導致乙醇濃度過高進而抑制干酪乳桿菌的生長，因此干酪乳桿菌活菌數、總酸含量、總酚含量、SOD酶活性均呈現下降趨勢。綜合考慮，干酪乳桿菌在發酵12 h后37 ℃條件下進行接種效果最佳。經發酵后得到酵素液中總酸含量為3.23 g/dL，總酚含量為1.981 mg/mL，SOD酶活性為325.00 U/mL，酵母菌數為2.18×108 CFU/mL，干酪乳桿菌數為7.55×107 CFU/mL。

2.5 抗氧化試驗結果與分析

2.5.1 還原力的測定

由圖11可知，隨著野櫻莓果渣酵素液濃度的增加，其吸光值增大，即還原力增大。不同濃度梯度的野櫻莓果渣酵素液和VC均具有一定的還原能力。當酵素液濃度為60 μg/mL時，野櫻莓果渣酵素液的吸光度為0.726±0.007，VC對照組的吸光度為0.895±0.002，此時野櫻莓果渣酵素液的還原力為VC對照組的81.12%。

2.5.2 DPPH自由基清除率的測定

由圖12可知，隨著野櫻莓果渣酵素液濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率逐漸增大。當野櫻莓果渣酵素液濃度為60 μg/mL時，野櫻莓果渣酵素液對DPPH自由基的清除率為（94.05±0.003）%，是VC對照組的97.44%。

2.5.3 羥基自由基清除率的測定

由圖13可知，隨著野櫻莓果渣酵素液濃度的增加，其對羥基自由基的清除率先逐漸增大后趨于平緩。當野櫻莓果渣酵素液濃度在60 μg/mL時，野櫻莓果渣酵素液對羥基自由基的清除率為（94.11±0.018）%，對照組VC對羥基自由基的清除率為（20.27±0.003）%。此時野櫻莓果渣酵素液對羥基自由基的清除率為VC對照組的4.64倍。

2.5.4 ABTS自由基清除率的測定

由圖14可知，隨著野櫻莓果渣酵素液濃度的增加，其對ABTS自由基的清除率逐漸增大。當野櫻莓果渣酵素液濃度為60 μg/mL時，野櫻莓果渣酵素液對ABTS自由基的清除率為（99.50±0.002）%，是VC對照組的99.58%。

3 結論

采用酵母菌和干酪乳桿菌對野櫻莓果渣進行發酵，通過單因素試驗和響應面試驗確定酵母菌發酵的最優工藝參數為接種量0.40%、發酵溫度27.1 ℃、發酵時間12 h、初始糖度17.99%。在酵母菌發酵12 h后，在37 ℃條件下接種干酪乳桿菌，其接種量為0.30%，靜置發酵16 h后在20 ℃條件下進行24 h的后發酵，使發酵液產香。在此條件下，發酵液SOD酶活性為325.00 U/mL，總酚含量為1.981 mg/mL，酵母菌數為2.18×108 CFU/mL，干酪乳桿菌數為7.55×107 CFU/mL，總酸含量為3.23 g/dL；抗氧化活性結果表明，當野櫻莓果渣酵素液濃度為60 μg/mL時，DPPH·、·OH和ABTS+·清除率分別為（94.05±0.003）%、（94.11±0.018）%和（99.50±0.002）%，其還原力為VC對照組的81.12%。

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