海南草豆蔻揮發油化學成分分析及對單增李斯特菌抑菌性的研究

摘要：分析海南草豆蔻揮發油的化學成分種類和含量，明確揮發油對單增李斯特菌的抑菌活性。采用水蒸氣蒸餾法提取草豆蔻揮發油，利用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）檢測和分析其化學成分。采用濾紙片擴散法測定單增李斯特菌對揮發油的藥物敏感性，采用微量二倍稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。結果表明，草豆蔻揮發油得率為1.26%，分離鑒定出107種化合物，草豆蔻揮發油對單增李斯特菌的抑菌圈直徑為15.44 mm，為高敏感性，MIC和MBC分別為0.078，0.312 5 mg/mL。海南草豆蔻揮發油得率較高，揮發性化學成分種類豐富，并且對單增李斯特菌具有較好的抑菌效果。該研究為優異草豆蔻品種的選育提供了數據支持，同時也為草豆蔻揮發油在天然食品抗菌劑開發中的應用提供了理論基礎和參考。

關鍵詞：草豆蔻；海南；揮發油；化學成分；GC-MS；單增李斯特菌；抑菌活性

中圖分類號：TS255.1 """""文獻標志碼：A """"文章編號：1000-9973（2024）09-0089-07

Analysis of Chemical Components of Volatile Oil from Hainan Alpinia

katsumadai Hayata and Study on Its Antimicrobial Activity

Against Listeria monocytogenes

WANG Dan， DING Shu-xian， JIANG Qian， WANG Xue-feng， WANG Qing-long，

WANG Mao-yuan， CHEN Xiao-lu， ZHAO Jian-ping*， YU Fu-lai*

（Tropical Crops Germplasm Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key

Laboratory of Biology and Cultivation of Chinese Herbal Medicines， Ministry of Agriculture and

Rural Affairs/Hainan Provincial Engineering Research Center for Tropical Medicinal Plants，

Haikou 571101， China）

Abstract： The types and content of chemical components of volatile oil from Hainan Alpinia katsumadai Hayata are analyzed， and the antimicrobial activity of volatile oil against Listeria monocytogenes is determined. The volatile oil is extracted from Alpinia katsumadai" Hayata by steam distillation method and its chemical components are detected and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The drug sensitivity of Listeria monocytogenes to volatile oil is determined by filter paper diffusion method， and the minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） are determined by trace double dilution method. The results show that the yield of volatile oil from Alpinia katsumadai" Hayata is 1.26%， and 107 compounds are isolated and identified. The inhibitory zone diameter of volatile oil against Listeria monocytogenes is 15.44 mm， indicating that it has high sensitivity. MIC and MBC are 0.078， 0.312 5 mg/mL respectively. The yield of volatile oil from Hainan Alpinia katsumadai

Hayata is higher， the types of volatile chemical components are rich， and it has a good antimicrobial effect on Listeria monocytogenes. This study has provided data support for the breeding of excellent Alpinia katsumadai Hayata varieties， and also provided theoretical basis and references for the application of volatile oil from Alpinia katsumadai Hayata in the development of natural food antimicrobial agents.

Key words： Alpinia katsumadai Hayata; Hainan; volatile oil; chemical components; GC-MS; Listeria monocytogenes; antimicrobial activity

收稿日期：2024-04-23

基金項目：海南省重點研發計劃項目（ZDYF2024SHFZ132）；中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所非營利項目（PZS2023013）；中國熱帶農業科學院基本科研業務費專項資金（1630032022008）

作者簡介：王丹（1982—），女，黑龍江牡丹江人，副研究員，研究方向：南藥資源研究與開發。

*通信作者：趙建平（1965—），男，云南石林人，研究員，研究方向：熱帶作物產品加工與貯藏；

于福來（1983—），男，吉林長春人，研究員，博士，研究方向：南藥資源定向培育及開發利用。

草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）是姜科山姜屬植物草豆蔻的干燥近成熟種子，主產地為海南、廣東、廣西和云南，具有燥濕行氣、溫中止嘔的功效[1-2]。同時，草豆蔻是我國傳統的藥食同源中藥，是非常重要的香辛料和食品調味料。近年來，隨著草豆蔻市場需求的增加，草豆蔻野生和半野生狀態的藥材產量不穩定、質量差異大等問題凸顯出來。因此，急需篩選出藥效成分穩定、生物活性高的優異草豆蔻種質。

《中華人民共和國藥典》（2020版一部）規定，揮發油是草豆蔻的主要藥效成分之一，藥材揮發油含量不得少于1.0%（mL/g）[3]。研究表明，草豆蔻中的揮發油具有保護胃黏膜、抗胃潰瘍、抗炎、抑菌等作用[4-6]。魏潔書等[7]研究發現草豆蔻種子團揮發油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑制效果。彭芙等[8]研究證實草豆蔻揮發油可以抑制奶牛乳腺炎病原菌。此外，褚祚晨[9]發現草豆蔻的揮發油微乳液對香蕉炭疽病有很好的抑制作用，對香蕉有一定的保鮮作用。但是，有關草豆蔻揮發油對食源性致病菌單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）的抑制作用未見報道。單增李斯特菌屬于革蘭氏陽性菌，其容易感染肉類、蛋類、海產品、乳制品等絕大多數食品，且對抗菌劑的抗性較強[10]，可引發李斯特菌病，致死率高達20%～30%，是發達國家列為重點控制的食源性疾病[11-12]。

因此，本研究以農業農村部（海南儋州）中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所藥用植物種質資源圃篩選出的草豆蔻優異種質資源為材料，以水蒸氣蒸餾法提取其干燥種子精油，采用GC-MS分析和鑒定草豆蔻精油的揮發性成分，并研究草豆蔻揮發油對食源性致病菌單增李斯特菌的抑菌作用，為后續草豆蔻優異品種選育和天然抗菌劑的開發應用提供了一定的理論基礎和數據支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗所用草豆蔻采樣于農業農村部（海南儋州）中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所藥用植物種質資源圃，由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所王茂媛研究員鑒定為姜科植物草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）的干燥近成熟種子。

1.2 試劑和菌種

無水乙醇、過二硫酸鉀：西隴科學股份有限公司；2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）：上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸（VC）、2，2-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）：東京化成工業株式會社；總抗氧化能力（FRAP法）試劑盒：蘇州科銘生物技術有限公司；AR0030 PBS緩沖液：武漢博士德生物工程有限公司；氨芐青霉素：Biosharp生物科技公司。

實驗用單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）：北京北納創聯生物技術研究院。

1.3 主要儀器與設備

F-100SD超聲波清洗機 深圳福洋科技集團有限公司；ME104E/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Tecan/Spark 10M多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；N4S紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 揮發油提取

取草豆蔻干燥種子，用粉碎機打粉后過篩。根據前期實驗結果，確定以料液比1∶10將150 g果粉與1 500 mL去離子水混合于圓底燒瓶中，用保鮮膜封口后超聲30 min，功率360 W，溫度30～40 ℃。超聲后，采用電熱套于230 ℃加熱，水蒸氣蒸餾5 h，待冷卻后取出揮發油，用無水硫酸鈉干燥水分后轉入棕色瓶中密封，放入4 ℃冰箱中避光保存。揮發油得率計算公式如下：

揮發油得率（%）=揮發油質量（g）/樣品質量（g）×100%。

1.4.2 揮發油GC-MS分析

取50 μL提取的草豆蔻揮發油，用異丙醇溶解，配制成濃度為2.5%的溶液，進行GC-MS分析。

1.4.2.1 色譜條件

采用Agilent 7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀對草豆蔻揮發油成分進行測定。采用VF-WAXms色譜柱（0.25 mm×30 mm，0.25 μm）。以60 ℃為起始溫度，保持1 min；以4 ℃/min升溫至150 ℃，再以6 ℃/min升溫至230 ℃；進樣口溫度為230 ℃；進樣量為1.0 μL，分流比為8∶1。

1.4.2.2 質譜條件

離子源為EI源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，接口溫度230 ℃，倍增管電壓1 043 V，采集類型為全掃描，質量范圍30～400 amu。

1.4.3 抑制單增李斯特菌活性測定

1.4.3.1 抑菌圈的測定

采用濾紙片擴散法，在無菌環境下，用移液槍吸取15 μL草豆蔻揮發油滴在直徑為6 mm的無菌濾紙片上，待紙片充分吸收后貼在已涂布菌液的胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養基平板上，并標記好各藥液的名稱，每個藥液重復3次，菌液濃度為107 CFU/mL，菌液涂布量為60 μL。重復3次并標記好編號。陰性對照組為100%乙醇，陽性對照組為氨芐青霉素（濃度為0.04 mg/mL），培養條件為在37 ℃恒溫培養箱中培養12 h。培養結束后觀察并記錄抑菌圈的有無，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑大小，取平均值作為測定結果。

抑菌圈測定標準：抑菌圈直徑大于20 mm為極敏，直徑在15～20 mm之間為高敏，直徑在10～15 mm之間為中敏，直徑小于10 mm為低敏。

1.4.3.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定

在96孔培養板上采用微量二倍稀釋法進行MIC實驗，將草豆蔻揮發油溶于無水乙醇，分別配制成400，100，50，10，5 mg/mL的草豆蔻揮發油溶液。將96孔板上的A1孔作為起始孔，A、B、C、E、F、H 6排從左到右12個孔分別加入胰酪大豆胨液體（TSB）培養基100 μL。在A、B、C、H排的第一孔中加入100 μL配制好的草豆蔻揮發油溶液，在E、F排的第一孔中加入氨芐青霉素100 μL充分混勻至乳化，依次對1～12孔做梯度稀釋，充分混勻后在每孔中加入100 μL菌液（A～C為3個重復，E、F為陽性藥物對照，H為確認草豆蔻揮發油顏色是否有影響），在另一個96孔培養板的任意兩排用100%乙醇進行二倍稀釋作為陰性對照，再選兩排的1～6孔分別加入50，75，88，94，97，98 μL的培養基后，在每孔中再加入100 μL菌液作為空白對照，用封口膜封好后標記，在37 ℃培養箱中培養12 h后，使用酶標儀測定樣品的吸光度值，抑菌率達到80%的樣品濃度為草豆蔻揮發油對單增李斯特菌的最低抑菌濃度（MIC）。

1.4.3.3 最低殺菌濃度（MBC）的測定

采用瓊脂培養基平板法，吸取50 μL 1.4.3.2中各樣品MIC所對應的溶液均勻涂布于瓊脂培養基中，培養條件為在37 ℃恒溫培養箱中培養12 h，觀察培養基中有無菌株生長，草豆蔻揮發油的MBC為菌落數低于5個的平板所對應孔中的最低濃度。

2 結果與分析

2.1 草豆蔻揮發油得率

草豆蔻種子揮發油得率為1.26%，滿足《中華人民共和國藥典》中的規定，顯著高于其他文獻報道中采用水蒸氣蒸餾法提取獲得的草豆蔻揮發油得率，晏小霞等[13]的研究中草豆蔻種子揮發油得率為0.72%，魏潔書等[7]的實驗中草豆蔻揮發油得率為0.73%，進一步說明了草豆蔻藥材質量的差異很大，本實驗的草豆蔻藥材品質較好。

2.2 草豆蔻揮發油成分及分析

草豆蔻揮發油經GC-MS分析后總離子流圖見圖1，草豆蔻揮發油成分分析和相對含量見表1。

由表1可知，從草豆蔻揮發油中鑒定出107種化合物。揮發油主要包含萜類、醇類、芳香族以及少量的酸類、酯類、酮類、萘類等化合物。其中萜類化合物61種，主要為單萜類、倍半萜類化合物，相對含量占揮發油總量的76.10%。揮發油中相對含量較高的為桉葉油素（9.36%）、Z，Z，Z-1，5，9，9-四甲基-1，4，7-環十一碳三烯（9.27%）、傘花烴（7.67%）、α-水芹烯（7.30%）、法尼醇（5.71%）、石竹烯（4.59%）、α-松油醇（4.27%）等，相對含量占揮發油總量的48.16%。

從草豆蔻揮發油中鑒定出的化學成分與文獻報道的化學成分類別、數量和相對含量差異較大，晏小霞等[13]從草豆蔻揮發油中鑒定出47種化合物，其中單萜類20種，倍半萜類8種，分別占揮發油總量的30.56%和26.79%，并且主要化合物的含量差異也較大，如法尼醇（18.02%）、1，8-桉葉油素（13.94%）、月桂酸（9.25%）、棕櫚酸（8.58%）、肉豆蔻酸（7.37%）等。于萍等[14]從草豆蔻精油中鑒定出42種化合物，主要是法尼醇（19.83%）、桉葉油素（12.52%）、2-苯基-2-丁酮（4.48%）、β-蒎烯（4.68%）、3-蒈烯（4.68%）等。這些差別可能與草豆蔻種質、品質、產地、氣候的不同有著密切關系[15-18]。

2.3 草豆蔻揮發油對單增李斯特菌抑菌活性分析

通過藥物在培養基平板上的擴散能力，根據抑菌圈大小判定待測藥物的抑菌效價，即藥物對該菌種的敏感性。草豆蔻揮發油對單增李斯特菌的抑菌圈直徑見圖2。

由圖2可知，草豆蔻揮發油對單增李斯特菌的抑菌圈直徑為（15.44±1.50） mm，為高敏，但是低于陽性對照藥物氨芐青霉素（28.91±0.62） mm，陰性對照組沒有抑菌效果。草豆蔻揮發油的MIC和MBC分別為0.078，0.312 5 mg/mL，雖然低于陽性對照組，但是優于其他植物精油，張承慧[19]研究發現，丁香精油對單增李斯特菌的MIC和MBC分別為0.5，1.0 mg/mL；洪小利等[20]證實肉桂精油對單增李斯特菌的MIC為0.2 mg/mL，說明草豆蔻揮發油對單增李斯特菌的抑菌效果優于其他植物精油。然而，劉曉麗等[21]利用超臨界CO2法萃取的黑胡椒、肉桂和丁香精油的MIC分別為0.048，0.072，0.096 mg/mL，且三者復配的復合精油對單增李斯特菌的MIC為0.016 mg/mL。說明采用不同的提取方法會導致所提取的揮發油化學成分存在一定差異，進而可能導致其抑菌活性的不同。

進一步結合GC-MS結果，據研究報道，草豆蔻揮發油中主要成分桉葉油素、α-水芹烯、法尼醇、石竹烯、α-松油醇、右旋萜二烯、2-茨酮、芳樟醇、莰烯、辛酸等成分具有不同程度的抑菌作用[22-25]，這可能是揮發油中單一抑菌成分或多種抑菌成分共同作用的結果，這可能是導致草豆蔻揮發油對單增李斯特菌具有顯著抑制作用的原因，具體機制還需進一步研究。

3 結論

目前，在海南等草豆蔻的主產區，草豆蔻主要資源仍處于野生和半野生狀態，導致藥材來源、種質性狀、產量和質量等不穩定，藥材品質差異很大，因此，亟需優異的草豆蔻種質和品種。揮發油是草豆蔻的主要有效成分之一，其含量與草豆蔻品質有關。不同提取方法或工藝條件對草豆蔻揮發油成分種類、含量的影響存在較大差異，可根據產品的需求選擇不同的提取方法和工藝條件。本實驗采用水蒸氣蒸餾法所獲得的草豆蔻揮發油得率為1.26%，優于《中華人民共和國藥典》中的規定和以往研究報道，并且由于草豆蔻揮發油成分豐富，具有107種揮發性成分，對單增李斯特菌顯示出較優的抑菌活性，為下一步優異品種的選育提供了理論基礎和數據支撐，同時也為草豆蔻揮發油在天然食品抗菌劑開發中的應用提供了一定的數據支持和參考。

參考文獻：

[1]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草（第8分冊，第24卷）[M].上海：上海科學技術出版社，1999：596-599.

[2]胡璇，王丹，于福來，等.草豆蔻的本草考證[J].中國實驗方劑學雜志，2020，26（21）：210-219.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2020：249.

[4]謝鵬，秦華珍，譚喜梅，等.草豆蔻化學成分和藥理作用研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2017，19（3）：60-63.

[5]吳珍，陳永順，杜士明，等.草豆蔻揮發油對大鼠醋酸性胃潰瘍的影響[J].中國醫院藥學雜志，2010，30（7）：560-563.

[6]BARBARA G， OLAF K， FRANZ B. Compounds of Alpinia katsumadai as potential efflux inhibitors in Mycobacterium smegmatis[J].Bioorganic amp; Medicinal Chemistry，2012，20（8）：2701-2706.

[7]魏潔書，胡錦珊，洪群華，等.南藥陽春砂、草豆蔻揮發油抑菌活性研究[J].生物化工，2023，9（3）：45-50.

[8]彭芙，代敏，萬峰.草豆蔻有效部位對奶牛乳腺炎病原菌的抗菌活性研究[J].中國獸醫科學，2012，42（10）：1073-1080.

[9]褚祚晨.草豆蔻精油微乳液的制備及對香蕉保鮮的影響[D].武漢：華中農業大學，2022.

[10]張鑫，李迎秋.兩種天然防腐劑對單增李斯特菌抑菌性的研究[J].中國調味品，2021，46（2）：37-39，45.

[11]LI W， BAI L， MA X， et al. Sentinel Listeriosis surveillance in selected hospitals， China， 2013—2017[J].Emerging Infectious Diseases，2019，25（12）：2274-2277.

[12]MARTINS J， CERQUEIRA M， SOUZA B， et al. Shelf life extension of Ricotta cheese using coatings of galactomannans from nonconventional sources incorporating nisin against Listeria monocytogenes[J].Journal of Agriculrural and Food Chemistry，2010，58（3）：1884-1891.

[13]晏小霞，王茂媛，王祝年，等.草豆蔻不同部位揮發油化學成分GC-MS分析[J].熱帶作物學報，2013，34（7）：1389-1394.

[14]于萍，崔兆杰，邱琴，等.草豆蔻揮發油化學成分的GC/MS研究[J].中國現代應用藥學，2002（2）：135-137.

[15]楊彬彬，容蓉，胡金芳，等.三種提取方法結合GC-MS分析比較草豆蔻的揮發性成分[J].中藥材，2014，37（3）：443-447.

[16]張沖，李磊，李恩霞，等.固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法分析草豆寇揮發性風味成分[J].生命科學儀器，2016，14（4）：35-37.

[17]陳少東，陳福北，盧平，等.草豆蔻中元素測定及索氏法提取的揮發油化學成分分析[J].中國調味品，2010，35（9）：87-90.

[18]WEI N， WANG M， ADAMS S J， et al. Comparative study and quality evaluation regarding morphology characters， volatile constituents， and triglycerides in seeds of five species used in traditional Chinese medicine[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2021，194（5）：113801.

[19]張承慧.丁香精油對單核細胞增生李斯特菌及其生物膜的抑制研究[D].鎮江：江蘇大學，2020.

[20]洪小利，嚴媛，林玲淼，等.肉桂精油對食源性腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌的抑菌作用[J].食品與發酵工業，2021，47（17）：54-60.

[21]劉曉麗，莫偉軒，吳克剛，等.復合香辛料精油對冷卻豬肉中單核增生性李斯特菌的抑制作用[J].中國調味品，2010，35（1）：42-45，49.

[22]楊素華，曾憲彪，鄧聿胤，等.樟樹葉純露揮發性成分與抑菌活性研究[J].廣東農業科學，2022，49（4）：88-96.

[23]吳克剛，趙欣欣，段雪娟，等.芳樟醇氣相抗菌活性與作用機制[J].食品科學，2021，41（1）：61-67.

[24]楊心儀，任潞，李適廷，等.1，8-桉葉油素對常見致齲菌的抗菌作用研究[J].北京口腔醫學，2023，31（6）：396-399.

[25]王一明.1，8-桉葉油素對大腸桿菌O101的抗菌和抗群體感應活性及其作用機制研究[D].雅安：四川農業大學，2023.