花椒籽蛋白的制備工藝優(yōu)化及組成分析

摘要：以花椒籽蛋白提取率為評價指標，采用單因素試驗和響應面試驗研究4個因素（料液比、pH值、提取溫度和提取時間）對花椒籽蛋白提取率的影響。通過SDS-PAGE凝膠電泳和氨基酸分析，探究花椒籽蛋白的組成。結果表明，花椒籽蛋白的最佳提取工藝條件為料液比1∶35（g/mL）、pH值9.0、提取溫度45 ℃、提取時間3.5 h，在該條件下花椒籽蛋白提取率可達46.54%。花椒籽蛋白由6個主要亞基組成：54，31，25，18，10，9 kDa，其中31 kDa的蛋白質含量最豐富。花椒籽蛋白氨基酸種類齊全，其中Glu含量最高，達到16.37 g/100 g。此外，花椒籽蛋白中必需氨基酸、疏水性氨基酸和酸性氨基酸含量較高，分別為36.88，34.75，24.65 g/100 g。由此可知，花椒籽蛋白是一種營養(yǎng)價值較高的優(yōu)質蛋白質資源，同時可能具備抗氧化功能。

關鍵詞：花椒籽蛋白；提取率；單因素試驗；響應面法；氨基酸組成

中圖分類號：TS201.1 """""文獻標志碼：A """"文章編號：1000-9973（2024）09-0101-08

Optimization of Preparation Process of Zanthoxylum bungeanum

Seed Protein and Its Composition Analysis

DONG Si-yu， SUN Xin， LI Ying-qiu*

（College of Food Science and Engineering， Qilu University of Technology

（Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250353， China）

Abstract： With Zanthoxylum bungeanum seed protein extraction rate as the evaluation index， single factor test and response surface test are used to investigate the effects of solid-liquid ratio， pH value， extraction temperature and extraction time on Zanthoxylum bungeanum seed protein extraction rate. The composition of Zanthoxylum bungeanum seed protein is explored by SDS-PAGE gel electrophoresis and amino acid analysis. The results show that the optimal extraction process conditions are solid-liquid ratio of 1∶35 （g/mL）， pH value of 9.0， extraction temperature of 45 ℃ and extraction time of 3.5 h. The extraction rate of Zanthoxylum bungeanum seed protein under these conditions could reach 46.54%. Zanthoxylum bungeanum seed protein consists of six major subunits， namely 54， 31， 25， 18， 10， 9 kDa， among which， the content of 31 kDa protein is the most abundant. Zanthoxylum bungeanum seed protein has a complete variety of amino acids， among which， the content of Glu is the hightest of 16.37 g/100 g. In addition， the content of essential amino acids， hydrophobic amino acids and acidic amino acids in Zanthoxylum bungeanum seed protein is higher， which is 36.88， 34.75， 24.65 g/100 g respectively. In conclusion， Zanthoxylum bungeanum seed protein is a kind of high-quality protein resource with high nutritional value and it may have antioxidant function.

Key words： Zanthoxylum bungeanum seed protein; extraction rate; single factor test; response surface method; amino acid composition

收稿日期：2024-03-20

基金項目：山東省與重慶市科技合作項目（2021LYXZ018）；齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）科教產(chǎn)融合試點工程重大創(chuàng)新專項項目（2022JBZ01-08）；山東省重點研發(fā)計劃項目（2020CXGC010604）

作者簡介：董思雨（1999—），女，碩士，研究方向：食品科學。

*通信作者：李迎秋（1972—），女，教授，博士，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

花椒籽（Zanthoxylum bungeanum seed）呈黑色，有光澤，是花椒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，占花椒質量的3/5，富含多種營養(yǎng)成分，但實際利用率較低[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，脫脂的花椒籽種仁中含有60%以上的蛋白質[3]，這些蛋白質具有多種生物活性，因此深入研究花椒籽蛋白對豐富植物蛋白資源、提高農產(chǎn)品副產(chǎn)物資源利用率具有重要意義。

目前關于花椒籽蛋白的研究主要集中在蛋白的理化功能性質和多肽的生物活性方面。劉慶慶等[4]證明了pH偏移可以改變花椒籽蛋白的理化性質和乳化性。原洪[5]制備出具備抗氧化和抗菌活性的花椒籽鐵結合肽；姜太玲等[6]從花椒籽蛋白中純化出抗菌肽，對大腸桿菌的抑制率達100%；吳紅洋等[7]從花椒籽蛋白中純化出降血壓肽，具有良好的血管緊張素轉換酶抑制效果；張志清等[8]使用Alcalase酶解花椒籽蛋白制得抗氧化肽，對DPPH自由基的清除率為61.00%。另外，張志清等[9]、宋燕[10]分別通過響應面試驗優(yōu)化了鹽提法和酶法提取花椒籽蛋白的工藝參數(shù)。但有關響應面優(yōu)化堿溶酸沉法提取花椒籽蛋白工藝條件的研究以及對花椒籽蛋白組成的分析尚無報道。

基于此，本文以堿溶酸沉法提取花椒籽蛋白，擬用單因素試驗和響應面試驗獲得幾個關鍵因素的最佳參數(shù)，并通過SDS-PAGE凝膠電泳圖譜和氨基酸測定分析花椒籽蛋白組成，從而分析其特征及潛在功能，以期為花椒籽蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，促進花椒籽蛋白的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽：由山東興源農產(chǎn)品有限公司提供的山東省濟南市萊蕪區(qū)大紅袍花椒籽；碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；福林酚（分析純）：上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-98-ⅡA型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金南儀器廠；Kjeltec 2300型全自動凱氏定氮儀 廣州賽為思儀器設備有限公司；Scientz-18N型真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1900紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；PowerPac HC型Bio-Rad電泳儀 美國Bio-Rad公司；L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 花椒籽蛋白的提取

脫脂的花椒籽粉末過80目篩，準確稱量1.000 g花椒籽粉末，按照一定的料液比加入蒸餾水，混勻。用1.0 mol/L NaOH調節(jié)溶液至堿性，置于恒溫水浴鍋中保溫，期間使用攪拌器攪拌。一段時間后，以6 000 r/min的轉速在室溫下離心15 min。用1.0 mol/L HCl將離心后的上清液調至酸性，再次離心，棄去上清液。所得沉淀用蒸餾水反復洗至中性，經(jīng)冷凍干燥后即得花椒籽蛋白。

花椒籽蛋白提取率按照下式計算：

花椒籽蛋白提取率（%）=提取液中蛋白質含量（g）總蛋白含量（g）×100%。

式中：提取液中蛋白質含量采用Lowry法[11]測定，總蛋白含量采用凱氏定氮儀測定，蛋白換算系數(shù)為6.25。

1.3.2 單因素試驗

按照1.3.1中方法制備蛋白質，通過單因素試驗探究料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45，g/mL）、pH值（7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5）、提取溫度（40，45，50，55，60，65 ℃）和提取時間（2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 h）對花椒籽蛋白提取率的影響。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結果，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件設計料液比、pH值、提取溫度、提取時間四因素三水平的響應面試驗，以花椒籽蛋白提取率為響應值。響應面試驗因素水平設計見表1。

1.3.4 SDS-PAGE凝膠電泳

將制得的花椒籽蛋白用還原型樣品溶解液配制成10 mg/mL的溶液，煮沸3 min后取10 μL上樣。首先在濃縮膠（3%）上以80 V電壓運行30 min，然后在分離膠（12%）上以120 V電壓運行120 min。制得的凝膠經(jīng)過固定2 h、染色2 h、脫色12 h后顯示出清晰條帶，即可使用凝膠成像儀拍照分析。

1.3.5 氨基酸組成

稱取0.1 g花椒籽蛋白與10 mL 6 mol/L HCl 混合，吹3 min氮氣后封口，于110 ℃水解24 h。水解液用雙層濾紙過濾，并用超純水定容至50 mL，適當稀釋后過0.22 μm濾膜。隨后取20 μL濾液于氨基酸自動分析儀中分析花椒籽蛋白的氨基酸組成。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

每個樣品做3次平行試驗，結果取平均值。采用Origin 8.0軟件分析數(shù)據(jù)并繪圖，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件分析響應面結果。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 料液比對花椒籽蛋白提取率的影響

在50 ℃、pH值為9.0的條件下提取4 h，料液比對花椒籽蛋白提取率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著花椒籽粉末與蒸餾水比例的增加，花椒籽蛋白的提取率先上升后下降，料液比為1∶35時，提取率達到最高。當料液比小于1∶35時，提取率隨著料液比的增大而增加，可能是因為料液比較小時，高黏度的溶液在一定程度上阻礙了蛋白質溶解；較大的料液比使花椒籽粉末分散更均勻，蛋白質之間的作用力減少，有利于蛋白質與水結合，從而增加了蛋白的溶解度[12]。當料液比大于1∶35時，提取率降低，可能是溶液過稀，使蛋白質分子與水結合不緊密，不利于花椒籽蛋白的溶出[13]。因此，選擇料液比1∶35作為響應面試驗設計的中心值。

2.1.2 溶液pH值對花椒籽蛋白提取率的影響

在50 ℃、料液比1∶35的條件下提取4 h，溶液pH值對花椒籽蛋白提取率的影響見圖2。

由圖2可知，當pH值為7.0～9.0時，花椒籽蛋白提取率逐漸上升，當pH值為9.0時提取率達到最大，當pH值大于9.0時，提取率隨著pH值的增加而降低。當pH值小于9.0時，蛋白質提取率隨著溶液pH值的增加而上升，這是因為較高的堿濃度能夠促進極性基團的解離，同時也使銨根離子的電離增加，增強了蛋白的溶出效果，因此蛋白提取率較高[14]。當pH值大于9.0時，堿濃度過高使蛋白質結構遭到破壞，提取率下降，可能是蛋白質發(fā)生部分變性所致。因此，選擇pH值9.0作為響應面試驗設計的中心值。

2.1.3 提取溫度對花椒籽蛋白提取率的影響

在料液比1∶35、pH值9.0的條件下提取4 h，提取溫度對花椒籽蛋白提取率的影響見圖3。

由圖3可知，花椒籽蛋白提取率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當提取溫度為45 ℃時，花椒籽蛋白的提取率達到最大。當提取溫度低于45 ℃時，提取率隨著提取溫度的升高快速升高，這是因為提取溫度升高使分子運動加快，有利于蛋白質分子擴散并與水分子結合，提高了蛋白質的溶解度，從而花椒籽蛋白提取率提高。當提取溫度高于45 ℃時，蛋白質容易發(fā)生熱變性，造成蛋白質流失，從而導致提取率降低。因此，選擇提取溫度45 ℃作為響應面試驗設計的中心值。

2.1.4 提取時間對花椒籽蛋白提取率的影響

在50 ℃、料液比1∶35、pH值9.0的條件下提取蛋白，提取時間對花椒籽蛋白提取率的影響見圖4。

由圖4可知，當提取時間從2.5 h增加到3.5 h時，花椒籽蛋白提取率升高，當提取時間為3.5 h時，提取率最大，繼續(xù)延長提取時間，提取率呈現(xiàn)降低的趨勢。當提取時間小于3.5 h時，隨著提取時間的延長，更多的蛋白質得以溶出，提取率隨之增加。當提取時間為3.5 h時，水溶性蛋白的溶出趨于飽和，繼續(xù)延長提取時間已不能夠提高蛋白提取率。當提取時間高于3.5 h時，提取時間過長導致花椒籽蛋白重新被高含量的纖維素包埋[15]，限制了蛋白質溶出，提取率有所降低。因此，選擇提取時間3.5 h作為響應面試驗設計的中心值。

2.2 響應面試驗結果分析

提取花椒籽蛋白的響應面試驗設計及結果見表2。

該回歸模型的方差分析和顯著性檢驗結果見表3。

以料液比（A）、pH值（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）4個因素為自變量，以花椒籽蛋白提取率為響應值（Y），通過Design-Expert 8.0.6.1對表2中試驗數(shù)據(jù)進行二次回歸模型分析，擬合得到二次回歸方程Y=45.96+0.49A+0.83B－0.27C－0.19D+0.95AB－3.03AC－0.60AD－0.80BC+1.90BD+1.57CD－2.81A2－4.70B2－2.47C2－2.81D2。

由表3可知，模型的P值lt;0.001，表示堿溶酸沉法提取花椒籽蛋白的回歸模型達到極顯著水平；失擬項的P值為0.601 2gt;0.05，失擬項不顯著，表明模型的預測值與實測值能較好地擬合。模型的決定系數(shù)R2=0.983 7，校正決定系數(shù)RAdj2=0.967 4，說明模型的預測值與實測值之間有較好的相關性。以上結果表明該模型可以被用來預測4種提取條件對花椒籽蛋白提取率的影響。與此同時，該回歸方程中，一次項A（料液比）顯著，B（pH值）極顯著，C（提取溫度）和D（提取時間）不顯著；交互項AB、BC顯著，AC、BD、CD極顯著，AD不顯著；二次項A2、B2、C2、D2均極顯著，說明各因素之間的作用對花椒籽蛋白提取率的影響不是簡單的加和效應，而是一種復雜的交互影響的關系。由F值可知，4個因素對花椒籽蛋白提取率的影響大小為B（pH值）gt;A（料液比）gt;C（提取溫度）gt;D（提取時間）。

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對A（料液比）、B（pH值）、C（提取溫度）和D（提取時間）的交互作用進行分析，繪制響應面3D曲面圖和等高線圖，見圖5。曲面越彎曲表示兩因素交互作用的影響程度越大，等高線越接近橢圓形表示兩因素交互作用效果越明顯[16]。

由圖5可知，料液比和提取溫度、提取溫度與提取時間、pH值與提取時間、料液比與pH值的交互作用對花椒籽蛋白提取率具有明顯的影響，料液比與提取時間、提取溫度與pH值的交互作用對花椒籽蛋白提取率的影響不明顯。對該回歸模型進行數(shù)學分析，得到花椒籽蛋白的最佳提取工藝條件為料液比1∶36.30、pH值9.06、提取溫度43.69 ℃、提取時間3.45 h。在該條件下理論上花椒籽蛋白的提取率為46.12%。

2.3 響應面優(yōu)化模型的驗證結果分析

通過分析響應面回歸模型，得到了提取花椒籽蛋白的最佳工藝條件，為了方便試驗操作，將上述提取工藝條件修正為料液比1∶35、pH值9.0、提取溫度45 ℃、提取時間3.5 h。按照修正條件進行3次重復試驗檢驗模型的準確性，得到花椒籽蛋白的實際提取率為46.54%，與模型預測值的差異不大。由此可知，花椒籽蛋白提取條件的響應面回歸模型可以準確地預測花椒籽蛋白的提取率。

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳結果分析

SDS-PAGE可以分析蛋白質分子量組成的信息，花椒籽蛋白的還原型SDS-PAGE凝膠電泳圖譜見圖6，泳道M和泳道1分別代表標準分子量蛋白Marker和花椒籽蛋白電泳條帶。

由圖6可知，花椒籽蛋白包含6個主條帶，分子量分別為54，31，25，18，10，9 kDa，其中分子量為31 kDa和18 kDa的蛋白質含量較豐富。

2.5 氨基酸組成結果分析

花椒籽蛋白的氨基酸組成測定結果見表4，由于酸水解過程完全破壞了色氨酸，因此表4中未顯示色氨酸的測定值。

由表4可知，花椒籽蛋白中氨基酸種類齊全，共檢測出17種氨基酸，其中包括10種必需氨基酸（Thr、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His）和7種非必需氨基酸（Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Arg、Pro）。花椒籽蛋白的總氨基酸含量為84.82 g/100 g，其中必需氨基酸含量為36.88 g/100 g，占總氨基酸含量的0.434 8，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為0.769 3，均高于FAO/WHO的推薦值（0.4和0.6），說明花椒籽蛋白是一種營養(yǎng)價值較高的優(yōu)質蛋白質資源[17]。

氨基酸的組成、含量和序列往往會影響蛋白質的功能性質[18]。谷氨酸（Glu）是一種鮮味氨基酸，在花椒籽蛋白中含量最高，達到16.37 g/100 g，說明花椒籽蛋白可以用于增添鮮味。精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）和亮氨酸（Leu）在花椒籽蛋白中的含量也較高，分別為8.54，8.28，7.13 g/100 g。Arg有助于細胞分裂，對于維持嬰幼兒生長發(fā)育十分重要[19]；Asp不僅可以呈鮮味，而且可以消除疲勞，促進肝功能[20]；Leu能夠刺激肌肉蛋白合成，有助于肌肉代謝[21]。花椒籽蛋白中含有較高含量的Arg、Asp和Leu，說明其可能具備良好的上述功效。另外，花椒籽蛋白中疏水性氨基酸（HAA）和酸性氨基酸（NCAA）含量較高，分別為34.75，24.65 g/100 g。多數(shù)研究表明HAA可以提供電子，因而賦予蛋白質清除自由基的能力；NCAA側鏈的氨基和羧基一般具有金屬螯合能力[22]。因此，花椒籽蛋白可能具有較好的抗氧化活性，可以用于制備抗氧化產(chǎn)品。此外，支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的比值（BCAA/AAA）高往往有利于肌肉代謝、維持蛋白質穩(wěn)態(tài)，花椒籽蛋白的BCAA/AAA比值（1.95）高于大麻籽（1.83），說明花椒籽蛋白的上述功效優(yōu)于大麻籽[23]。賴氨酸與精氨酸的比值（Lys/Arg）低有利于降低血液中膽固醇含量，花椒籽蛋白的Lys/Arg比值（0.35）低于綠豆蛋白（0.98），說明花椒籽蛋白降低膽固醇的功效可能優(yōu)于綠豆蛋白[24]。

3 結論

通過響應面試驗得出各因素對花椒籽蛋白提取率的影響大小為pH值gt;料液比gt;提取溫度gt;提取時間，并且檢驗驗證響應面模型擬合良好，可以用于預測4個因素對提取率的影響。由上述試驗得到花椒籽蛋白的最佳提取條件為料液比1∶35、pH值9.0、提取溫度45 ℃、提取時間3.5 h，此條件下花椒籽蛋白的提取率可達46.54%。SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示花椒籽蛋白主要包含低分子量亞基，其中31 kDa的蛋白質含量最豐富。花椒籽蛋白氨基酸組成齊全，必需氨基酸含量高于FAO/WHO的推薦值，且含有較高含量的與抗氧化功能相關的疏水性氨基酸與酸性氨基酸，表明花椒籽蛋白是一種優(yōu)質的蛋白質資源。本研究為花椒籽蛋白的進一步加工和利用提供了參考，對提高花椒籽的附加值有一定的促進作用。

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