枸杞活性物質的提取工藝優化及活性測定

摘要：采用水提法提取枸杞中的活性成分，并選取料液比、酶解溫度、酶解pH 3個單因素，在單因素實驗結果的基礎上利用響應面法對多糖和蛋白質的提取工藝進行優化，得到的最佳提取工藝為料液比1∶25.29、酶解溫度59.29 ℃、酶解pH 5.94，多糖和蛋白質的理論含量為79.36%，在最佳提取工藝下提取3次，平均含量為79.05%，可見響應面法得到的提取工藝的穩定性與可靠性高。對提取物進行抗氧化活性測定，結果表明，枸杞提取物對超氧陰離子自由基有一定的清除作用，但清除作用不明顯；對羥基自由基有較好的清除作用，在低濃度時與VC相當；在DPPH自由基清除實驗中，在較小質量濃度時其清除能力弱于VC，但在較高質量濃度時其清除能力逐漸接近VC，表明枸杞具有較強的抗氧化能力。

關鍵詞：多糖；工藝優化；抗氧化

中圖分類號：TS201.1""""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）09-0114-06

Optimization of Extraction Process of Active Substances from

Lycium barbarum and Determination of Activity

SHU Yu-zhu， YAO Wen-bo*

（Shaanxi University of Science and Technology， Xi'an 710021， China）

Abstract： The active components in Lycium barbarum are extracted by water extraction method， and solid-liquid ratio， enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis pH are selected as the three single factors， the extraction process of polysaccharides and proteins is optimized by response surface method on the basis of single factor experimental results， and the best extraction process is obtained as follows： solid-liquid ratio is 1∶25.29， enzymatic hydrolysis temperature is 59.29 ℃， and enzymatic hydrolysis pH is 5.94. The theoretical content of polysaccharides and proteins is 79.36%， and the average content is 79.05% after three times of extraction under the optimal extraction process. It can be seen that the extraction process obtained by response surface method has high stability and reliability. The antioxidant activity of the extracts is determined， and the results show that the extracts of Lycium barbarum have a certain scavenging effect on superoxide anion radical， but the scavenging effect is not obvious; they have a good scavenging effect on hydroxyl radical， which is equivalent to VC at low concentration; in the DPPH radical scavenging experiment， their scavenging capacity is weaker than VC at low mass concentration， but gradually close to VC at high mass concentration， indicating that Lycium barbarum has strong antioxidant ability.

Key words： polysaccharides; process optimization; antioxidation

收稿日期：2024-03-16

基金項目：陜西省科技廳科技計劃-農業領域項目（2022NY-035）；陜西省西安市科技計劃項目（20NYYF0022，22NYYF048）；陜西省西安市未央區科技計劃項目（202040）;陜西科技大學博士科研啟動基金項目（2022BJ-29）；陜西省教育廳2023年度一般專項科學研究計劃項目（23JK0352）

作者簡介：舒雨竹（2000—），女，碩士研究生，研究方向：食用菌多糖。

*通信作者：姚文博（1989—），男，講師，博士，研究方向：食品安全毒理學。

枸杞的營養價值非常高，屬于藥食同源性食品[1-5]。枸杞中蘊含許多含量豐富的活性物質，如多糖、活性肽等[6]。據研究報道，枸杞多糖不僅有增強機體免疫力[7]、防衰老[8]、增強造血功能、防止遺傳損傷、抗癌[9]、抑制腫瘤生長和細胞突變等作用，而且對高血脂患者的血脂也具有非常明顯的影響，能顯著降低血清膽固醇和三酰甘油的含量，具有抗氧化功能[10-12]。而枸杞中的蛋白質含量也很多，其中含有20種人體所需氨基酸，且含有人體必需的8種氨基酸（異亮氨酸、色氨酸等）[13-15]。蛋白的來源主要分為動物來源和植物來源。動物性蛋白更利于人類攝取，但是成本過高。植物性蛋白是世界上最大的可再生蛋白資源之一，其來源廣，具有抗氧化、抗菌、降血糖、降血脂、降血壓和增強免疫力等功能。近年來，由于肽可以維護細胞結構，調節人體生理功能，利用植物性蛋白制備生物肽用于保健品、醫療等領域逐漸增加。有研究發現，生物活性肽具有抗氧化、抗癌、抗突變等活性。將枸杞進行深加工，利用枸杞蛋白制備生物活性肽可提高其經濟效益。因此，提取枸杞活性物質、提高其提取率對開發枸杞資源具有重要意義。枸杞富含營養成分，其中枸杞多糖是其主要的活性成分，如何實現枸杞多糖的高效提取是本課題擬解決的關鍵科學問題，不同的酶能夠作用于枸杞的不同部位，比如纖維素酶可以促進細胞壁的破裂，從而加速細胞內容物的釋放，因此，考察酶的作用對枸杞活性物質提取率的影響具有一定的研究意義。

枸杞屬于枸杞科，主要生長在堿性土壤和砂質土壤中，屬于茄科灌木。枸杞果實作為中藥已經有2 000多年的歷史。近年來，枸杞果實因具有明顯的健康保護功能，在許多國家作為一種健康食品被普遍食用。據報道，枸杞果實對肝炎、糖尿病、高脂血癥、血栓形成和免疫缺陷具有多種生物活性和藥理活性。枸杞果實的活性成分復雜，含有18種氨基酸、21種微量礦物質、黃酮擬桿菌、蛋白質、多糖和類胡蘿卜素。多糖是枸杞果實中最重要的活性成分之一[16-19]，具有降血脂[20]、抗氧化[21-22]、調節免疫力、抗衰老和抗疲勞等多種生物活性。多糖的生物活性主要受其理化性質和化學結構的影響，并受其提取和純化方法的影響[23-24]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞：安徽松鹿堂生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）、正丁醇（色譜純）、氯仿（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；糖肽標準品（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司。

TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；10N-50A立式真空冷凍干燥機 上海爭巧科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方式

分別考察纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶對枸杞中多糖和蛋白質含量的影響。精密稱取干燥枸杞粉末1 g，分別置于3個小燒杯中，加入25 mL蒸餾水，分別在數顯恒溫水浴鍋中50 ℃提取120 min，將提取液放入微沸水中滅酶3～5 min，置于抽濾瓶中抽濾后置于旋蒸儀中直至旋蒸完全，加入10 mL蒸餾水復溶后倒入燒杯中，加入體積比為1∶5的95%乙醇溶液進行醇沉，置于4 ℃冰箱中，24 h后取出，離心，將沉淀物復溶后置于凍干機中凍干72 h后取出，稱量其凍干后提取物的質量，密封保存，備用，采用苯酚硫酸法和考馬斯亮藍法檢測在不同酶情況下提取物中多糖和蛋白質的含量。確定提取率最高的兩種酶，再將兩種酶調整為總量不變、比例不同的情況按照上述方法操作后測定含量，確定最適酶比例后進行后續實驗。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 料液比對枸杞活性物質提取含量的影響

精密稱取過篩后的干燥枸杞粉末1 g，分別置于5個小燒杯中，分別加入10，15，20，25，30 mL蒸餾水配成料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的溶液，加入0.45%纖維素酶∶果膠酶為3∶1的酶后將提取液的pH調至6，用保鮮膜封住燒杯口，在50 ℃溫度下水浴提取120 min，將提取液放入微沸水中滅酶3～5 min，置于抽濾瓶中抽濾后置于旋蒸儀中旋蒸完全，加入10 mL蒸餾水復溶后倒入燒杯中，加入體積比1∶5的95%乙醇溶液進行醇沉，置于4 ℃冰箱中，24 h后取出，放入臺式離心機中在8 000 r/min轉速下離心15 min，將沉淀物復溶后置于凍干機中凍干72 h后取出，稱量其凍干后提取物的質量，密封保存，備用，采用苯酚硫酸法和考馬斯亮藍法檢測在不同料液比下提取物中多糖和蛋白質的含量。

1.2.2.2 酶解溫度對枸杞活性物質提取含量的影響

精密稱取過篩后的干燥枸杞粉末1 g，分別置于5個小燒杯中，加入20 mL蒸餾水配制成料液比為1∶20的溶液，加入0.45%纖維素酶∶果膠酶為3∶1的酶后將提取液的pH調至6，用保鮮膜封住燒杯口，分別在30，40，50，60，70 ℃溫度下水浴提取120 min，提取液按照1.2.2.1的方式處理。

1.2.2.3 酶解pH對枸杞活性物質提取含量的影響

精密稱取過篩后的干燥枸杞粉末1 g，分別置于5個小燒杯中，加入20 mL蒸餾水配制成料液比為1∶20的溶液，加入0.45%纖維素酶∶果膠酶為3∶1的酶后分別將pH調至4，5，6，7，8，用保鮮膜封住燒杯口，在50 ℃溫度下水浴提取120 min，提取液按照1.2.2.1的方式處理。

1.2.3 響應面實驗

1.2.3.1 響應面實驗因素和水平

本實驗根據單因素實驗結果，利用Design-Expert V8.0.6軟件中心組合設計法設計三因素三水平響應面實驗，以枸杞活性成分含量為響應值，響應面實驗因素和水平見表1。

1.2.3.2 驗證實驗

在響應面模型預測得到的最佳提取工藝的基礎上進行3次重復性驗證實驗，判斷模型的穩定性和重現性。

1.2.4 枸杞中多糖和蛋白質含量的計算

采用苯酚硫酸法和考馬斯亮藍法測定多糖和蛋白質的含量。

1.2.5 抗氧化活性的測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

a.實驗試劑

100 mL 0.05 mg/mL DPPH溶液：稱取5 mg DPPH，用100 mL無水乙醇溶解，用錫紙包裹，于4 ℃避光備用。

分別配制枸杞提取物樣品溶液、VC溶液，濃度分別為0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL。

b.實驗步驟

取上述各濃度梯度的溶液各2 mL，加入DPPH溶液2 mL，渦旋混勻，記作A樣品。以無水乙醇代替DPPH溶液，渦旋混勻，記作A對照。以無水乙醇代替樣品溶液，渦旋混勻，記作A空白，以VC為陽性對照。將上述溶液在25 ℃下避光反應30 min后，于517 nm處測定吸光值。按下列公式計算清除率，每組實驗平行3次，取平均值。

c.計算公式

清除率（%）=［1—（A空白—A樣品）］/A對照×100%。

1.2.5.2 O2-自由基清除能力的測定

a.實驗試劑

Tris溶液的配制：準確稱取 Tris 0.605 6 g，加水定容至50 mL待用；用移液管準確移取濃HCl 0.415 mL，加水定容至50 mL待用；將上述兩種溶液按照Tris∶濃HCl為50∶23的比例混合均勻后，加水定容至100 mL，即配制成pH 8.2的Tris-HCl溶液。

焦性沒食子酸溶液的配制：準確稱取焦性沒食子酸 0.063 4 g，加適量水溶解后定容至100 mL待用。

分別配制枸杞提取物樣品溶液、VC溶液，濃度分別為0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL。

b.實驗步驟

取0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL樣品溶液、1 mL VC溶液于具塞試管中，隨后加入 Tris-HCl（pH 8.2）緩沖液3 mL，于30 ℃水浴20 min，放置至室溫后加入3 mL 5 mmol/L焦性沒食子酸溶液，混勻后放置3 min，加入1 mL濃鹽酸終止反應，在320 nm處測定吸光值A1，以水作為空白對照，抗壞血酸作為陽性對照，每個樣品進行 3次平行實驗，取其平均值。A樣品為待測液在320 nm處的吸光值；A試樣為以H2O代替鄰苯三酚在320 nm處的吸光值；A空白為以H2O代替待測液在320 nm處的吸光值。

c.計算公式

清除率（%）=［A空白—（A樣品—A試樣）］/A空白×100%。

1.2.5.3 OH-自由基清除能力的測定

a.實驗試劑

100 mL 9 mmol/L H2O2的配制：吸取90 μL 30% H2O2溶液加水定容至100 mL；

100 mL 9 mmol/L FeSO4的配制：稱取0.25 g FeSO4·7H2O，加水定容至100 mL；

100 mL 9 mmol/L水楊酸-無水乙醇溶液：稱取0.124 2 g水楊酸，用無水乙醇定容至100 mL。

分別配制枸杞提取物樣品溶液、VC溶液，濃度分別為0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL。

b.實驗步驟

取上述各濃度梯度的溶液各1 mL，加入9 mmol/L H2O2、9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸-無水乙醇溶液和蒸餾水各1 mL，渦旋混勻，在37 ℃水浴35 min。于510 nm處測定吸光值，記作A樣品。以蒸餾水代替提取液，記作A空白，H2O2溶液用蒸餾水替代，記作A試樣，按下列公式計算清除率。以VC溶液作為陽性對照。每組實驗平行3次，取平均值。

c.計算公式

清除率（%）=［A空白—（A樣品—A試樣）］/A空白×100%。

1.3 實驗方法

所有實驗均重復3次，采用GraphPad Prism 8.0.2和Design-Expert V8.0.6進行數據處理和繪圖分析。

2 結果與討論

2.1 提取工藝優化

2.1.1 最適酶的確定

由表2可知，在纖維素酶和果膠酶的提取條件下，枸杞活性成分的含量較高，因此確定后續實驗選取的酶為纖維素酶和果膠酶。

2.1.2 最適酶比例的確定

由表3可知，在纖維素酶∶果膠酶為3∶1的條件下，枸杞活性成分的含量較高，因此確定后續實驗選取的酶比例為3∶1。

2.1.3 料液比對提取含量的影響

由圖1可知，料液比為1∶25時，枸杞活性成分的含量達到最高，因此選擇1∶25作為實驗的最優條件，為響應面優化工藝提供了參考。

2.1.4 酶解溫度對提取含量的影響

由圖2可知，酶解溫度為60 ℃時，枸杞活性成分的含量達到最高，因此選擇酶解溫度60 ℃作為實驗的最優條件，為響應面優化工藝提供了參考。

2.1.5 酶解pH對提取含量的影響

由圖3可知，酶解pH為6時，枸杞活性成分的含量達到最高，因此選擇酶解pH 6作為實驗的最優條件，為響應面優化工藝提供了參考。

2.1.6 響應面優化提取工藝

按照表1設計響應面實驗，共得到17個實驗點，其中分析的實驗點有12個，中心點有5個。采用響應面法分析實驗結果，以枸杞活性成分含量為響應值，最終得到的回歸方程為含量=77.93+0.92A-2.09B-1.28C-9.05AB+1.39AC-4.61BC-12.01A2-16.13B2-7.17C2。

由表4可知，響應面模型的P=0.007 7＜0.01，說明響應面模型差異極顯著，失擬項的P=0.089 5＞0.05，說明響應面實驗結果與模型擬合良好，可以使用該模型推測枸杞活性成分含量最大時的最優提取條件。各因素對枸杞活性成分含量的影響由大到小為酶解溫度＞酶解pH＞料液比。兩兩因素交互作用的等高線和響應面見圖4。

在圖4中X，Y軸為影響因素，Z軸為枸杞中活性成分的含量，由圖4可以明顯看出料液比與酶取溫度的交互作用、料液比與酶解pH的交互作用以及酶解溫度與酶解pH的交互作用。且每兩個因素的交互作用都明顯存在最高點。根據響應面法建立模型，最終得到最佳的提取條件為料液比1∶25.29、酶解溫度59.29 ℃、酶解pH 5.94，此條件下枸杞中活性成分含量為79.36%。

2.1.7 驗證實驗

在理論條件下提取的枸杞活性成分含量為79.36%。在此基礎上進行3次重復性實驗，結果見表5。可見預測值與實際提取值的吻合度較好，模型具有良好的穩定性和重現性。

2.2 抗氧化活性測定

2.2.1 DPPH自由基清除能力測定

按照1.2.5中的試劑配制方法配制溶液，并按照實驗步驟加入試劑，檢測提取物的活性。枸杞提取物、VC對DPPH自由基的清除效果見圖5。

由圖5可知，在實驗質量濃度范圍內VC對DPPH自由基的清除率基本上沒有變化，均大于80%，隨著質量濃度的上升，枸杞提取物對DPPH自由基的清除率增大，逐漸靠近VC。

2.2.2 O2-自由基清除能力測定

該體系中的鄰苯三酚在堿性條件下自氧化形成中間產物超氧陰離子自由基，此自由基能促進鄰苯三酚自氧化，因此通過測定某物質對鄰苯三酚自氧化的抑制作用，即可表征其對超氧陰離子自由基的清除作用，實驗結果見圖6。

由圖6可知，在所選質量濃度范圍內，隨著質量濃度的升高，VC的清除率略有上升，而枸杞提取物的清除率變化不明顯，均低于30%，說明枸杞提取物對超氧陰離子自由基的清除作用不明顯。

2.2.3 OH-自由基清除能力測定

枸杞提取物、VC對羥基自由基的清除效果見圖7。

由圖7可知，在所選質量濃度范圍內，隨著質量濃度的增大，VC、枸杞提取物清除羥基自由基的能力顯著增大，清除率達到50%時所需枸杞提取物、VC的質量濃度大約都在0.25 mg/mL，說明在此濃度范圍內枸杞提取物清除羥基自由基的能力與VC相當。

3 結論

本研究考察了提取酶的種類和酶比例對枸杞多糖和蛋白質含量的影響，發現最適酶為纖維素酶和果膠酶，最適的酶比例為3∶1。考察了料液比、酶解溫度、酶解pH 3個單因素對枸杞多糖和蛋白質含量的影響，然后采用Design-Expert V8.0.6軟件中心組合設計法設計響應面實驗并建立了模型，得到了預測的最優工藝，在預測的最優工藝基礎上，進行3次驗證實驗，發現理論含量與實際含量的吻合度達到99.61%，最終確定了最佳提取工藝為料液比1∶25.29、酶解溫度59.29 ℃、酶解pH 5.94。在此條件下提取的枸杞多糖和蛋白質的理論含量為79.36%，實際含量為79.05%。

利用3種不同的活性檢測方法對枸杞進行抗氧化活性檢測。通過測定枸杞對不同自由基的清除率來判斷枸杞的抗氧化能力。分別設置了5個不同的濃度，實驗結果表明，枸杞提取物對超氧陰離子自由基有一定的清除作用，但清除作用不明顯；對羥基自由基有較好的清除作用，在低濃度時與VC相當；在DPPH自由基清除實驗中，在較小質量濃度時其清除能力弱于VC，但在較高質量濃度時其清除能力逐漸接近VC，可見枸杞有較強的抗氧化能力。

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