一株豬流行性腹瀉病毒的鑒定及S基因分析

摘要：為了解宜賓市豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的基因組特征，本試驗利用RT-PCR技術從腹瀉仔豬腸道內含物中分離出一株感染宜賓市豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的株系，并將其命名為SCYB202212。通過RT-PCR方法對S基因進行擴增，對測序結果拼接并構建系統進化樹。結果表明SCYB202212的S基因長度為4161 bp；系統發育樹分析發現，SCYB202212與CH-HeN-ZLH-2022，SXSL，S2021株處于同一獨立分支，屬于GⅡ-a亞型。本研究有助于深入了解宜賓市PEDV分離毒株的分子特性，為后續該病的診斷試劑和疫苗開發提供依據。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；S基因；分子特性

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種急性、傳染性腹瀉疾病，臨床癥狀主要表現為腹瀉、嘔吐、脫水和生長緩慢等癥狀，危害嚴重養豬業，尤其對哺乳仔豬危害更為嚴重，發病率高達100%，病死率高達80%[1]。1984 年中國首次報道該病[2]。2010 年我國暴發大面積PED 疫情，給養豬業造成嚴重損失[3-4]。PEDV屬于甲級冠狀病毒，是一種基因組長度為27～33 kb的單鏈RNA病毒。PEDV的纖突（S）蛋白是一種I型糖蛋白，由1 383個氨基酸構成，具有促進中和抗體的生成的作用[5]。S基因是該病毒最主要的毒力基因，不同毒株的S基因存在多樣性。因此，了解PEDV的S基因對了解該病毒的遺傳特性、流行性、變異及疫苗開發等相當重要[6-7]。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2021年 9月，在宜賓市的一家養豬場，發現了仔豬腹瀉情況嚴重的問題。為了研究發病原因，剖解了5只發病仔豬，并提取了其腸道內容物進行分析。內容物用無菌鹽水研磨（含雙抗，其中青霉素濃度為200 IU/mL，鏈霉素濃度為200 mg/mL），按照1：5的體積比，將研磨液反復凍融2～3次，最后一次取出置于4 ℃ 8 000 g離心10 min，取上清液，用于RNA提取和RT-PCR擴增。

1.2 試劑來源

RNA 提取和反轉錄試劑盒購自TAKARA公司，DNA凝膠回收試劑盒購自天根生物科技有限公司，核酸測序在上海生物工程有限公司完成。

1.3引物設計與合成

本實驗室保存鑒定引物和S基因擴增引物，目的片段長度分別為671和4 161 bp，引物均由上海生物工程有限公司合成（見表1）。

1.4 病毒RNA的提取及RT-PCR

將樣品按照提取試劑盒說明書抽提總RNA，并進行反轉錄，反轉錄體系為：dNTP mix 12.5 μL，RNasin酶抑制劑0.5 μL，引物各 0.5 μL，提取總RNA 2 μL，加ddH2O至25 μL。42 ℃反轉錄1 h，產物置于-70 ℃保存。

1.5 P CR檢測

PCR檢測的反應體系為：Green Taq Mix 12.5 μL；PEDV-F 0.5 μL；PEDV-R 0.5 uL；模板2 μL，加ddH2O至25 μL。擴增條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應結束后，將擴增產物置于1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳。

1.6 S基因擴增和測序

以病毒的 cDNA 為模板，進行PCR 擴增，反應體系為：dNTP Mix 12.5 μL；S-F 1.0 μL；S-R 1.0 uL；模板 2 μL，加ddH2O至25 μL。擴增條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 50 s，共35個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。反應結束后，擴增產物置于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。之后對得到的目的片段進行純化回收，并將純化產物送至公司測序。

1.7 序列分析

應用SeqMan軟件，將測序序列進行拼接。應用MegAlign軟件，將PEDVS基因序列與GenBank上發表的39條PEDV毒株S基因參考序列（表2），進行比對分析，并用 Mega軟件構建系統遺傳發育進化樹。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測結果

對腸道內容物樣品進行PEDV檢測，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果擴增出671 bp的目的條帶，與預期目的條帶大小一致（圖1），說明臨床樣品存在PEDV的感染。

2.2 S基因的獲得

以病毒的cDNA為模板，進行PEDV的S基因擴增，得到與預期大小一致的目的條帶，將擴增的目的片段進行純化，并將純化后的產物進行測序。將測序結果與NCBI 上公布的PEDV參考株序列比對，確認得到了S基因的全長序列，并將其來源毒株命名為SCYB202212毒株。

2.3 S基因序列分析

應用SeqMan軟件對SCYB202212毒株的S基因進行比對和拼接，結果顯示，SCYB202212毒株的S基因全長4161nt，編碼氨基酸1388個。應用MegAlign軟件，將SCYB202212毒株的S基因核苷酸序列，與GenBank上發表的39株參考毒株的核苷酸序列進行同源性對比。結果表明，核苷酸同源性在92.4%（LZC）～99.8%（SC2021）（圖2）。并構建S基因核苷酸的系統發育樹，結果見圖3。PEDV毒株有兩個明顯的分支，即GⅠ和GⅡ型，SCYB202212與國內PEDV疫苗株CH-HeN-ZLH-2022、SXSL在同一個分支上，與CH-HeN-ZLH-2022、SXSL和SC2021毒株的遺傳距離較近。遺傳進化分析表明，SCYB202212屬于GⅡ-a變異毒株。

3 討論

自我國暴發PEDV以來，PEDV病毒對世界許多國家和地區的養豬業帶來了巨大的沖擊。本研究通過反轉錄PCR擴增試驗，對四川宜賓市某規模場豬群腹瀉病例進行了診斷，綜合分析發現，本次疫病很可能是由PEDV感染引起的。疫病發生后果斷采取消滅傳染源、切斷病毒傳播途徑等措施能有效預防此病的發生。

S蛋白是PEDV關鍵毒力蛋白，該蛋白含有多個B細胞表位和抗體結構域，主要介導膜融合進行細胞侵染，感染后可使機體產生中和抗體，致病機理是通過膜融合入侵到宿主細胞，S基因的突變能夠引起PEDV毒力的改變[7]。

本研究應用 Mega 5.0 軟件，將分離到S基因與Gene Bank上39 條參考序列建立系統發育樹，結果顯示，分離毒株與CH-HeN-ZLH-2022，SXSL，SC2021遺傳關系較近，屬于PEDV GⅡ-a毒株。結果表明，本研究得到S基因的毒株為變異毒株。

目前采取的主要的防控措施：①加強飼養管理，做好豬場的日常清潔、消毒和生物安全防控措施，建立日常規范的消毒程序，做好飼養帶豬消毒和豬群出欄后的全面徹底消毒，在疫病高發季節，增加消毒頻次，開窗通風，對進場人員、車輛、物品和飼料等也要進行消毒；②加強母豬管理，豬流行性腹瀉主要侵害對象是仔豬，健康的母豬能在一定程度上保障仔豬的健康，因此，在母豬生產過程中，控制好豬舍的溫度、濕度和營養，能保證仔豬的質量；③疫苗接種，疫苗免疫是預防PEDV最有效的方式，目前，國內市場多采取活疫苗+滅活疫苗的方式進行，通過疫苗接種可以使仔豬通過被動免疫獲得母源抗體，從而提高仔豬抗病能力，從根本上防止豬流行性腹瀉的發生。■

參考文獻：

[1] 楊春杰，秦毅斌，陳櫻，等.廣西豬流行性腹瀉病毒感染病例的確診與病毒S基因變異分析[J].畜牧與獸醫，2021，53（8）： 86-93.

[2] SUN R Q， CAI R J， CHEN Y Q. et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets， China [J]. Emerging Infect Dis， 2012，18（1）：161-163.

[3] CHEN J F， WANG C B， SHI H Y， et al. Molecular epidemiology of porcine epidemic dianhea virus in China [J]. Arch Virol， 2010，155（9）：1471-1476

[4] LI W T， LI H， LIU Y B， et al. New variants of porcine epidemic diarrhea virus， China， 2011 [J]. Emerging Infect Dis，2012，18（8）：1350-1353.

[5] JIESHI Y， CHITHRA S， TIRTH U， et al. Piglet immunization with a spike subunit vaccine enhances disease by porcine epidemic diarrhea virus[J]. NPJ Vaccines， 2021，6（1）：22.

[6] MASTER P S. The molecular biology of coronaviruses[J].Adv Virus Res， 2006，66：193-202.

[7] 楊德強.豬流行性腹瀉病毒S基因在昆蟲細胞中的表達及其單克隆抗體的制備[D].中國農業科學院，2017.

收稿日期：2023-09-07

基金項目：宜賓學院博士啟動項目（2019QD09，2019QD10） ；2020年四川省“天府萬人計劃”天府農業大師項目。

作者簡介：潘延樂（1989— ），女，甘肅靖遠人，碩士研究生，獸醫師，從事動物疫病防控工作。1057744054@qq.com。

*通信作者：田志革，E-mail： beishugege@126.com；尹華江，E-mail：yinhuajiang6363@126.com。