禽流感病毒(H9亞型)流行性毒株的分離、篩選與鑒定

摘要：為了明確2023年我國禽流感病毒H9N2亞型的流行情況，從北京、河北、河南、山東、山西、福建、四川、廣西、遼寧等地養殖場送檢的50份病料進行病毒分離鑒定，共分離到19株具有血凝性的培養物，對19個具有血凝性的培養物開展了血清學試驗和RT-PCR試驗初步鑒定，其中8株鑒定為H9N2亞型禽流感病毒，接下來對8株H9N2亞型禽流感病毒進行了HA基因測序與遺傳進化分析，同時使用8株H9N2分離株以及目前普遍使用的H9亞型禽流感滅活疫苗的疫苗株制備滅活疫苗免疫SPF雞制備高免血清，開展交叉血凝抑制試驗，篩選出血清保護譜廣的分離株BJ23株，然后使用BJ23株在SPF雞中開展免疫攻毒保護研究。結果表明，分離株與我國目前普遍使用的H9亞型禽流感滅活疫苗株之間存在著一定的遺傳距離，HA基因的核苷酸同源性為87.5％～93.1％，8株H9N2分離株同屬于Y280種系；BJ23株對近年來分離的H9N2禽流感毒株交叉血凝保護譜廣；使用BJ23株制備的滅活疫苗免疫SPF雞后21日，使用8株分離株以及目前普遍使用的疫苗株WJ57株進行免疫后攻毒試驗，BJ23株制備的疫苗不僅可以抵御同源毒株的攻擊，而且對異源毒株的攻擊也可提供理想的保護。結果表明，BJ23株適合作為疫苗候選株進行進一步研究。

關鍵詞：H9N2亞型禽流感病毒；疫苗株；篩選

禽流感（Avian influenza，AIV）是禽流行性感冒的簡稱，是由禽流感病毒引起的一種禽類傳染性疾病綜合征[1]。根據致病力強弱，在臨床上可分為高致病性禽流感和低致病性禽流感。低致病性禽流感病毒感染后可致禽表現出輕度的呼吸道癥狀、消化道癥狀，死亡率較低[2]。H9N2亞型禽流感病毒是由8個基因節段組成的單股負鏈RNA病毒，毒力通常表現為低致病性，其存在廣泛并持續感染，降低禽的生產能力[3-4]。1992年，H9N2禽流感病毒（AIV）在廣東地區首次暴發，隨后向其他地區蔓延[5]，1998年，迅速擴散到中國大部分省份[6]，隨后在我國大部分地區家禽群體中廣泛流行，已成為雞群中流行的禽流感病毒的主要亞型[7-8]。

H9亞型AI系列滅活疫苗，幾乎是我國獸醫生物制品中種毒株最多的疫苗。2003年，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所所研發的禽流感滅活疫苗（H9N2亞型，SDS696株）獲得二類新獸藥證書，成為我國第一個關于H9亞型AI的新獸藥。目前，我國已經通過審批的H9亞型AI滅活疫苗已達百余種。H9亞型系列滅活疫苗涉及的H9毒株有Re-2株、SDS696株、SS株、L株、HP株、SY株、LG1株、YBF003株、F株、S2株、NJ02株、NJ01株、HZ株、JY株、HN106株、WJ57株等20余種。疫苗的大規模使用對禽流感的防控確實發揮了重要作用。近些年間 H9N2亞型禽流感的監測數據表明，當前流行的H9N2病毒在遺傳進化和抗原性分析方面均發生了比較顯著的變化，其中HA基因遺傳進化分支已演變為以Y280亞系占絕對優勢[9-10]。這提示我們，應該盡快篩選新的H9N2疫苗株用于研制新型疫苗，以應對已出現變異的H9N2亞型禽流感的防控。

1 材料

1.1 樣品

樣品為采自北京、河北、河南、山東、山西、福建、四川、廣西、遼寧等地養殖場送檢的50份發病雞肺臟、喉頭、氣管等組織。

1.2 種蛋及實驗動物

SPF種蛋及SPF雞購自北京勃林格殷格翰實驗動物技術有限公司。

1.3 陽性血清

H9亞型禽流感病毒陽性血清購自哈爾濱維科生物技術開發公司；H5、H7亞型禽流感病毒HI陽性血清由乾元浩生物股份有限公司提供；雞新城疫陽性血清和EDS76HI陽性血清購自中國獸醫藥品監察所。

1.4 試劑

總RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR試劑盒、DL 2000 Marker等購自北京全式金生物技術有限公司；pMD18-T載體試劑盒、DH5α感受態細胞均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。

2 方法

2.1 病毒分離

1）樣品處理。取采集發病雞的肺臟、喉頭、氣管、肝臟、脾臟、輸卵管等組織，與適量的生理鹽水加入EP管中，使用振蕩不銹鋼株法充分研磨病變組織，經5 000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清液過濾除菌后備用。

2）雞胚接種。將上清液經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，0.2 mL/胚，37 ℃孵化箱中培養，每日檢胚1次，24 h內死亡的雞胚棄去，24 h后死亡的雞胚隨時收獲，至96 h，取出全部雞胚，分別收獲雞胚液，留樣進行紅細胞凝集試驗。

2.2 病毒鑒定

1）血清學鑒定。取血凝陽性的樣品配制成4HAU抗原，通過雞新城疫HI陽性血清，EDS76HI陽性血清，禽流感H9亞型特異性抗血清、H5、H7亞型特異性抗血清、SPF雞血清進行紅細胞凝集抑制試驗開展血清學鑒定。

2）RT-PCR試驗分型鑒定。取血凝陽性樣品，用EasyPure Viral DNA/RNA K提取RNA，并反轉錄為cDNA。使用H9N2亞型分型鑒定引物進行PCR鑒定。PCR產物經電泳鑒定大小正確后，送測序公司進行核苷酸序列測定。使用DNA STAR軟件對測序結果進行拼接。從Gen Bank中獲得具有代表性的H9N2亞型禽流感病毒的HA基因序列，及國內部分H9亞型禽流感滅活疫苗產品所用疫苗株的HA基因序列，使用軟件進行遺傳進化分析。

2.3 候選毒株的免疫效力研究

1）交叉HI試驗。8株無外源病毒污染的病毒以及目前普遍使用的H9亞型禽流感滅活疫苗所用毒株以常規方法制備油乳劑滅活苗，分別以每只0.3 mL的劑量免疫21日齡SPF雞，每種疫苗免疫5只。另設5只SPF雞不免疫作為對照，同條件飼養。免疫后21日，各免疫組以及同條件對照雞5只，分別采血，分離血清，使用9種病毒液的滅活抗原作為血凝抑制試驗抗原，開展交叉血凝抑制試驗。

2）攻毒和病毒分離。篩選出血清保護譜廣的分離株，使用制備的滅活疫苗免疫21日齡SPF雞， 每只0.3 mL，免后21日，使用9株病毒液分別進行攻毒，10只/組。攻毒方法為：將病毒液用PBS（0.l mol/L，pH值7.0～7.4）稀釋10倍，通過靜脈注射攻毒，0.2 mL/只，每只雞攻毒劑量不低于106.0EID50。攻毒后第5日，采集喉頭與泄殖腔棉拭子，將采自同一只雞的兩種棉拭液混合后作為一個樣品，接種于10日齡SPF雞胚進行病毒分離。對病毒分離為陰性的樣品應盲傳1代再進行判定。

3 結果

3.1 血清學鑒定

通過雞新城疫HI陽性血清，EDS76HI陽性血清，禽流感H9亞型特異性抗血清、H5、H7亞型特異性抗血清、SPF雞血清對19個血凝陽性雞胚液進行紅細胞凝集抑制試驗開展血清學鑒定。19個樣品中其中8個樣品僅與H9亞型特異性抗血清呈陽，其余均為陰性反應，表明所分離的8個毒株可能為H9亞型禽流感病毒。

3.2 病毒HA基因鑒定

1）病毒的RT-PCR試驗鑒定結果。對經過血清學鑒定可能為H9亞型禽流感的8個毒株進行PCR鑒定，結果顯示，使用的兩對特異性引物分別擴增出了約1 101 bp和1 038 bp大小的條帶，與預期相符。

2）病毒HA基因的遺傳進化分析。使用軟件對分離株、疫苗株及參考株的HA基因進行遺傳進化分析，結果見圖1。根據群系劃分，選擇分析的8株病毒的HA基因均屬于歐亞群系的Y280群系（或BJ94群系），我國目前廣泛使用的部分疫苗株（如F98、SS、WJ57、和SD696）等也均屬于Y280群系（或BJ94群系）。

3.3 候選毒株的免疫效力研究

1）取8株經鑒定為H9亞型禽流感毒株，用β-丙內酯滅活后制備油乳劑滅活疫苗，多點注射接種6周齡SPF雞，免疫1 mL/羽，接下來每次間隔2周分別進行2免、3免，0.5 mL/羽，于三免后21天采血，分離血清，使用8種病毒液的滅活抗原作為血凝抑制試驗抗原，開展交叉血凝抑制試驗，從試驗結果可以看出，不同毒株制備的陽性血清使用不同的檢測抗原進行檢測，離散度最小的是BJ23株的陽性血清，這說明BJ23株抗原制備的陽性血清能較好地與近年分離的H9N2禽流感毒株結合，作為候選毒株的幾率較大。

2）攻毒后病毒分離結果。攻毒后第5日，采集棉拭子并接種雞胚進行病毒分離，結果詳見表4。病毒分離結果顯示， BJ23株對同源毒株和異源毒株的攻擊均可產生理想的保護（8/10～10/10保護）同時對目前普遍使用的H9亞型禽流感滅活疫苗（WJ57）也有很好的保護作用。

4 討論

禽流感的大范圍流行給養禽業造成了巨大的經濟損失，疫苗免疫仍然是防止禽流感暴發的主要措施，但禽流感病毒在復制過程中很容易發生基因突變及基因重組，導致基因型眾多，給疫苗的研究帶來了極大的困難。近年來，對我國H9亞型禽流感病毒的分子進化及抗原性的相關研究有不少報道。H9N2亞型禽流感病毒在我國經過不斷的抗原漂移。研究結論部分指出。疫苗的基因同源性和抗原性差異引起的保護效力不足可能是導致H9亞型禽流感病毒在我國持續存在的主要原因之一。部分毒株制備的滅活疫苗免疫雞后，對同源或異源毒株的攻擊均難以提供保護，而另有部分毒株不僅可抵御同源毒株的攻擊，而且可以有效抵御異源毒株的攻擊。這說明不同毒株之間的免疫原性存在著較大差異，必須通過多毒株之間的交叉保護試驗以篩選出適合用于制備疫苗的、具有良好免疫原性的毒株。本研究結果亦發現不同分離株之間的交叉免疫原性存在著一定的差異性，因此認為通過研究毒株之間的交叉保護性以篩選出免疫原性更好的疫苗候選毒株是提高疫苗保護效力的有效途徑。

本研究用BJ23株H9亞型禽流感病毒制苗免疫雞后，不僅對同源毒株的攻擊提供了良好的保護，也可以有效抵御異源毒株的攻擊。表明BJ23株具有較好的交叉免疫原性與較廣的抗原保護譜，適合作為疫苗候選株用于疫苗研制。■

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收稿日期：2024-03-25