基于熒光探針技術檢測糧油儲運中的赭曲霉毒素A

摘 要：為實現糧油儲運中真菌毒素的快速檢測，本文建立基于熒光探針技術檢測赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的熒光傳感方法。通過制備硫化銅納米顆粒（Copper Sulfide Nanoparticles，CuS NPs）以及在CuS NPs上修飾OTA單體克隆抗體（Antibody，Ab）形成硫化銅納米顆粒-OTA單克隆抗體免疫信號標記物（CuS-Ab NPs）進行熒光檢測，采用外標法定量。結果顯示，OTA濃度在0.1～200.0 ng·mL-1線性關系良好，方法檢出限為0.01 ng·mL-1，加標回收率為93.89%～109.96%，相對標準偏差為2.37%～5.12%。該方法檢測靈敏度及準確性高、特異性好，適用于糧油儲運中OTA的檢測。

關鍵詞：熒光探針技術；赭曲霉毒素A（OTA）；加標回收率

Detection of Ochratoxin A in Grain and Oil Storage and Transportation Based on Fluorescence Probe Technology

DU Ruiting

（Hohhot Grain and Oil Quality Testing Center， Hohhot 010070， China）

Abstract： In order to realize the rapid detection of mycotoxins in grain and oil storage and transportation， a fluorescence sensing method based on fluorescence probe technology was established to detect ochratoxin A （OTA）. Copper sulfide nanoparticles （CuS NPs） were prepared and OTA monoclonal antibody （Ab） was modified on CuS NPs to form copper sulfide nanoparticles-OTA monoclonal antibody immune signal marker （CuS-Ab NPs） for fluorescence detection， and external standard method was used for quantification. The results showed that the linear relationship of OTA concentration was good in the range of 0.1 ng·mL-1 to 200.0 ng·mL-1， the detection limit of the method was 0.01 ng·mL-1， the recovery rate was 93.89% to 109.96%， and the relative standard deviation was 2.37% to 5.12%. This method has high sensitivity， accuracy and specificity， and is suitable for OTA detection in grain and oil storage and transportation.

Keywords： fluorescent probe technology; ochratoxin A （OTA）; spiked recovery rate

近年來，隨著經濟的快速發展以及生活水平的提高，人們對糧油質量的關注度日益增加[1]。綠色、無毒無害的食品不僅能夠滿足人們日常所需的營養膳食，且不會對人體造成任何傷害。然而，在糧油儲運過程中，食品易受到真菌毒素、殺蟲劑等物質的污染，對人們健康造成嚴重威脅[2]。因此，有必要采取有效的技術手段對糧油質量進行檢測，從而確保糧油安全。糧油中最具代表性的毒素包括赭曲霉毒素A（Ochratoxin，OTA）、玉米赤霉烯酮毒素（Zearalenone，ZEN）、伏馬毒素（Fumonisin，FB1）、嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）及黃曲霉毒素（Aflatoxin B1，AFB1）和T-2毒素等[3]。有研究發現，OTA與動物的腎毒性相關，并有可能造成動物肝臟受損[4]，對人體健康產生極大威脅。目前，針對糧油中真菌毒素檢測常用的技術手段包括色譜分析、傳感器以及免疫分析[5]等。其中，基于熒光探針的檢測技術具有靈敏度高、快速、樣品消耗低等優點，但該方法在檢測OTA的應用研究中鮮少報道。基于此，本文建立基于熒光探針技術檢測糧油儲運中OTA的方法，以實現真菌毒素的快速、高效檢測。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

玉米、咖啡和大豆，購自某大型超市。

巰基乙酸，阿拉丁試劑有限公司；氯化銅，國藥集團化學試劑有限公司；NaOH、濃硫酸，天津市風船化學試劑科技有限公司；硫代乙酰胺，天津博迪化工股份有限公司；戊二醛50%，天津市大茂化學試劑廠；2-嗎啉乙磺酸，天津渤化化學試劑有限公司；N-N二甲基甲酰胺，北京金泰宏達生物科技有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺、牛血清白蛋白，北京索萊寶科技有限公司。上述所有試劑均為分析純。

標準品OTA（1 mg·mL-1）、ZEN（1 mg·mL-1）、FB1（5 mg·mL-1）、DON（5 mg·mL-1）、AFB1（10 mg·mL-1）和T-2毒素（10 mg·mL-1），北京壇墨質檢科技有限公司；OTA單克隆抗體（5 mg·mL-1）、抗原（4 mg·mL-1），山東綠都科技有限公司。實驗中所用水均為超純水。

1.2 實驗儀器

S210 pH計、AL240電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；MK3酶標儀、F1微量移液器、Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀，美國賽默飛世爾公司；DHG-9245A恒溫培養箱，上海恒科儀器有限公司；F97Pro熒光分光光度計，上海棱光技術有限公司；Mili-Q純水系統，美國Millipore公司；LS13320激光粒度，美國貝克曼庫爾特公司；JEM-2100F掃描電鏡、D/max 2500 X射線衍射儀，日本理學株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 納米顆粒及免疫信號標記物的制備

（1）硫化銅納米顆粒（Copper Sulfide Nanoparticles，CuS NPs）的制備。在100 mL超純水中加入1.705 g CuCl2·2H2O和13.85 mL巰基乙酸，混合攪拌30 min，加入濃度為20 mg·mL-1的NaOH溶液，使溶液的pH值達到9.0。然后，加入0.751 g硫代乙酰胺，在50 ℃條件下反應6 h并通入N2，以充分去除氧氣。最后用超濾離心管離心洗滌3次，并將其分散于超純水中，制備得到CuS NPs。

（2）硫化銅納米顆粒-OTA單克隆抗體免疫信號標記物（CuS-Ab NPs）的制備。分別取100 μL濃度為32 mg·mL-1的N-羥基琥珀酰亞胺和濃度為20 mg·mL-1的N-N二甲基甲酰胺（用2-嗎啉乙磺酸緩沖液配制，pH=5.5）溶液，與1 mL CuS NPs懸浮液混合，活化CuS NPs表面的羧基，在25 ℃條件下反應2 h，離心后去除上清液，再將1 mL濃度為220 μg·mL-1的OTA單克隆抗體加入其中，于4 ℃下振蕩孵育12 h，離心。最后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，制備得到CuS-Ab NPs。

1.3.2 定量檢測方法及標準曲線的繪制

①對黑色聚苯乙烯微孔板的表面用200 μL濃度為2.5%的戊二醛（PBS緩沖液溶解）氨基活化2 h，之后使用PBS洗滌3次；②在活化后的微孔板上加入50 μL濃度為30 μg·mL-1的OTA抗原，37 ℃孵育2 h以固定OTA抗原，用PBS緩沖液洗滌3次后，再加入120 μL濃度為5%的牛血清白蛋白溶液，再次用PBS緩沖液洗滌3次；③將50 μL濃度為0.7 mg·mL-1的CuS-Ab NPs和不同濃度的OTA加入到固定有OTA抗原的微孔板中，37 ℃反應60 min，并用PBS緩沖液洗滌3次；④為溶解CuS-Ab NPs免疫標記物的Cu2+，將200 μL濃度為0.1 mol·L-1的鹽酸溶液加入到微孔板中，于37 ℃下振蕩反應30 min；⑤加入5 μL濃度為0.5 mg·mL-1的銅離子熒光探針繼續振蕩45 min，進行熒光檢測。實驗中，用PBS緩沖液將OTA的標準品稀釋為不同濃度梯度（0.1 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1）的OTA，并依據相應的熒光強度來繪制標準曲線。

1.3.3 特異性實驗

在檢測中可能存在被多種真菌毒素污染的現象，因此選取AFB1、DON、ZEN、FB1以及T-2毒素等干擾物質進行特異性實驗。這些毒素與OTA單克隆抗體相結合時，會發生假陽性。在實驗中，選取OTA濃度為1 ng·mL-1，其他毒素濃度為10 ng·mL-1，進行3次平行實驗。

1.3.4 樣品前處理方法

分別稱取1 g大豆面、玉米面和咖啡面置于5 mL離心管中，加入2 mL濃度為10 ng·mL-1的OTA標準液，漩渦振蕩5 min，然后在轉速為10 000 r·min-1條件下離心15 min，取上清液，并過0.45 μm微濾膜，最后用PBS緩沖液稀釋。

2 結果與分析

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 CuS-Ab NPs濃度的優化

通過研究不同濃度CuS-Ab NPs對應熒光強度的變化，可知CuS-Ab NPs濃度為0.5～0.7 mg·mL-1時，其對應的熒光強度隨CuS-Ab NPs濃度的增大而增強；當濃度在0.7～0.9 mg·mL-1時，其對應的熒光強度基本不變。因此，選擇CuS-Ab NPs濃度為0.7 mg·mL-1進行后續實驗。

2.1.2 OTA抗原濃度的優化

通過研究不同OTA抗原濃度下熒光強度的變化，可知OTA抗原濃度為10～30 μg·mL-1時，熒光強度隨OTA抗原濃度的增加而增強；當OTA抗原濃度為30～50 μg·mL-1時，熒光強度保持不變。因此，選擇OTA抗原濃度為30 μg·mL-1進行后續實驗。

2.1.3 反應時間的優化

通過研究不同反應時間對熒光強度的影響，可知在20～60 min，Cu2+探針發生開環導致水解反應產物逐漸增多，且熒光強度增大；當反應時間超過60 min后，CuS-Ab NPs和OTA抗原的濃度、熒光強度均降低。因此，選擇反應時間為60 min進行后續實驗。

2.2 標準曲線的繪制

按照1.3.2項所示方法，進行熒光檢測，發現目標產物在495 nm激發光極下發出508～650 nm的發射光，且與熒光強度成正比，熒光強度在554 nm處達到峰值。因此，選取在554 nm熒光強度下對OTA進行定量檢測，結果如圖1所示。以OTA濃度為橫坐標，以其對應的熒光強度為縱坐標，建立標準曲線，線性方程為y=-5.211x+8 426，相關系數為R2=0.693 8，表明OTA濃度在0.1～200.0 ng·mL-1線性關系良好。

2.3 檢出限

以3倍信噪比（S/N=3）對應的濃度為檢出限，計算得到檢出限為0.01 ng·mL-1，表明該方法能夠實現對糧油樣品中OTA的快速檢測，且靈敏度高。

2.4 特異性實驗

為驗證基于熒光探針檢測糧油中毒素OTA的特異性，選取1.3.3項中提到的5種毒素作為干擾物質，測定結果如圖2所示。圖2中，縱坐標為空白對照組（F0）/實驗組（F）。當只加入OTA時，F0/F值最大；當加入5種干擾物時，F0/F值較小且相差較小，表明干擾物質不能與OTA結合。結果表明，OTA和抗體間具有高結合作用，特異性良好。

2.5 加標回收實驗

選取被OTA污染的玉米、大豆和咖啡按照本研究中建立的方法進行檢測，以研究基于熒光探針技術對糧油中真菌毒素檢測的適用性。同時，采用傳統的酶聯免疫吸附方法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）進行對比，結果如表1所示。

由表1可知，在0.5 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的加標水平下，按照ELISA法測定不同樣品中OTA的加標回收率為88.36%～109.00%，而按照本研究中建立方法所測定的結果為93.89%～109.96%；ELISA方法計算得到相對標準偏差為3.35%～6.32%，而基于本研究中建立方法的結果為2.37%～5.12%。對比可知，兩種方法結果基本保持一致，表明基于熒光探針技術對糧油中OTA含量的檢測結果準確性較高。

3 結論

本文建立了一種基于熒光探針技術檢測OTA的熒光傳感方法。結果表明，OTA濃度在0.1～200 ng·mL-1線性關系良好，方法檢出限為0.01 ng·mL-1，加標回收率為93.89%～109.96%，相對標準偏差為2.37%～5.12%。該方法檢測靈敏度及準確性高、特異性好，適用于糧油儲運中OTA的檢測。

參考文獻

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