高效液相色譜法測定山西老陳醋中川芎嗪的方法優化

摘 要：本試驗對《地理標志產品 山西老陳醋》（GB/T 19777—2013）附錄B中高效液相色譜法測定山西老陳醋中川芎嗪的方法進行優化，通過單因素試驗和正交試驗對樣品處理過程中的溶液體系pH值、三氯甲烷用量、離心條件進行研究。最終確定使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節pH值至11.0，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次、于6 000 r·min-1下離心5 min的處理條件下測定效果最好，加標回收率為90.9%～93.8%，相對標準偏差為0.47%～1.19%，均可以滿足山西老陳醋中川芎嗪的測定需求。

關鍵詞：山西老陳醋；川芎嗪；高效液相色譜法

Optimization of High Performance Liquid Chromatography for Determination of Ligustrazine in Shanxi Aged Vinegar

XU Zhifang， ZHAO Yiru

（China Spectrum Testing Technology （Shanxi） Co.， Ltd.， Linfen 043000， China）

Abstract： This experiment optimized the method for determining ligustrazine in Shanxi aged vinegar by high-performance liquid chromatography in appendix B of GB/T 19777—2013. The pH value of the solution system， the amount of trichloromethane， and the centrifugation conditions during the sample processing were studied through single factor experiments and orthogonal experiments. Finally， it was determined to use sodium hydroxide solution （200 g·L-1） to adjust the pH to 11.0， extract twice with 5 mL of chloroform， and centrifuge at 6 000 r·min-1 for 5 min. The best results were obtained under the treatment conditions， with a standard recovery rate ranging from 90.9% to 93.8% and a relative standard deviation of 0.47% to 1.19%， all of which can meet the requirements for the determination of ligustrazine in Shanxi aged vinegar.

Keywords： Shanxi aged vinegar; ligustrazine; high-performance liquid chromatography

山西老陳醋是以高粱為主要原料，配以小米、豌豆、糯米、大米、小麥麩皮和苦蕎麥等優質淀粉質糧食作物以及谷糠、稻殼等輔料經液化、糖化、酒精化和醋化多道工藝生產而成的具有獨特風味的餐桌美味[1]。川芎嗪是山西老陳醋中的一種有益成分，具有改善人體心腦血管和微循環等功能，其主要來源于美拉德反應，含量與發酵水平、生產過程和陳放時間等因素有關[2]。研究表明，川芎嗪最早出現在醋酸發酵過程中，但該階段的產生量很少，加熱煎煮和密封陳放過程都能顯著增加川芎嗪的含量，且隨著陳放時間的延長，川芎嗪含量會持續增加，是山西老陳醋的特征指標之一[3-4]。《地理標志產品 山西老陳醋》（GB/T 19777—2013）附錄B[5]中規定了山西老陳醋中川芎嗪的檢測方法，但筆者在日常檢驗中發現該方法測定山西老陳醋的加標回收率較低（65%左右），基于此，本文對GB/T 19777—2013附錄B中高效液相色譜法測定山西老陳醋中川芎嗪的方法進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋樣：山西老陳醋（川芎嗪本底值19.25 mg·L-1）；鹽酸川芎嗪標準品（批號110817-201608，含量以83.4%計，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，上海星可高純溶劑有限公司）；三氯甲烷（優級純，山東金嶺化工股份有限公司）；鹽酸（優級純，成都市科隆化學品有限公司）；氫氧化鈉（優級純，天津市凱通化學試劑有限公司）；磷酸二氫銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

LC2030-D高效液相色譜儀（配DAD檢測器），日本島津公司；AUW120D電子天平（精度0.01 mg），梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；HC-3016R高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；WH-861旋渦混合器，華利達實驗設備有限公司；PHS-3E pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理方法

使用單標線移液管準確移取待測醋樣10.00 mL于50 mL的離心管中，用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節pH值，加入一定量的三氯甲烷，渦旋混合2 min，使三氯甲烷與樣品充分混勻，置于高速冷凍離心機中離心一定時間，轉移三氯甲烷層；重復加入三氯甲烷提取，合并2次三氯甲烷層。然后加入4.5 mL鹽酸溶液（0.2 mol·L-1）萃取，重復1次，合并水相，用一級水定容至10.00 mL，過0.45 μm濾膜待測。

1.3.2 方法條件優化單因素試驗

（1）準確移取4份待測醋樣，分別使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節pH值至8.5、9.0、10.0和11.0，加入5 mL三氯甲烷，于4 000 r·min下離心5 min，其他操作同1.3.1中，篩選適宜的溶液體系pH值。

（2）準確移取4份待測醋樣，使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節至最適宜pH值，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次、加入10 mL三氯甲烷萃取1次、加入5 mL三氯甲烷萃取3次以及加入10 mL三氯甲烷萃取2次，于4 000 r·min-1下離心15 min，其他操作同1.3.1中，篩選適宜的三氯甲烷用量及萃取次數。

（3）準確移取4份待測醋樣，使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節至最適宜pH值，一次或多次加入適宜的三氯甲烷，離心條件分別設置為4 000 r·min-1下離心5 min、4 000 r·min-1下離心15 min、6 000 r·min-1下離心5 min以及8 000 r·min-1下離心5 min，其他操作同1.3.1中，篩選最佳的離心條件。

1.3.3 方法條件優化正交試驗

在單因素實驗結果的基礎上，以品牌山西老陳醋（川芎嗪本底值19.25 mg·L-1）為加標樣品，每份樣品加入300 μL濃度為1.0 mg·mL-1的川芎嗪標準溶液，按照3因素3水平正交試驗表（見表1）中的方法條件進行處理，每個水平樣品平行測定6次，計算6次平均測定結果的加標回收率。

1.4 液相色譜測定條件

色譜柱：GL Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：20 ℃；流動相：磷酸二氫銨（0.2 mmol·L-1）∶甲醇=6∶4；流速：0.8 mL·min-1；進樣量：10 μL；DAD檢測器波長：λ=279 nm。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 溶液體系pH值篩選

由圖1可知，使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節醋樣pH值至8.5，加入5 mL三氯甲烷，于4 000 r·min-1下離心15 min條件下，發現三氯甲烷與醋樣無明顯分層，故無法轉移三氯甲烷層。使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節醋樣pH值至9.0時，其他操作同上，發現三氯甲烷與醋樣有分層，但有機層的體積約為0.5 mL。使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節醋樣pH值＞10.0時，其他操作同上，發現三氯甲烷與醋樣明顯分層，有機層體積約3.0 mL，由此確定溶液體系的最佳pH值為10.0～11.0，正交試驗中溶液體系pH值的3個水平選9.0、10.0、11.0。

2.1.2 三氯甲烷用量的確定

使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節醋樣pH值至10.0，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次、加入10 mL三氯甲烷萃取1次、加入5 mL三氯甲烷萃取3次、加入10 mL三氯甲烷萃取2次，4份醋樣均在4 000 r·min-1下離心15 min。經測試并計算得，山西老陳醋（本底值19.25 mg·L-1）中川芎嗪含量分別為16.14 mg·L-1、16.23 mg·L-1、16.24 mg·L-1、

15.51 mg·L-1，由于三氯甲烷為有毒有害試劑，綜合考慮用量及回收率得出三氯甲烷最適宜用量為用5 mL三氯甲烷萃取2次，正交試驗中三氯甲烷用量的3個水平為加入5 mL萃取2次、加入10 mL萃取1次、加入5 mL萃取3次。

2.1.3 離心條件的確定

使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節醋樣pH值至10.0，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次，分別在離心條件為4 000 r·min-1下離心5 min、4 000 r·min-1下離心15 min、6 000 r·min-1下離心5 min、8 000 r·min-1的條件下離心5 min，發現三氯甲烷與醋樣均明顯分層，有機層體積分別為0.5 mL、3.0 mL、3.5 mL和3.0 mL，且8 000 r·min-1下離心5 min出現乳化。將處理過的4份醋樣分別上機測定，計算得山西老陳醋（本底值19.25 mg·L-1）中川芎嗪含量分別為14.04 mg·L-1、16.24 mg·L-1、16.43 mg·L-1和15.88 mg·L-1，綜合考慮萃取后分層狀態及回收率得出最佳離心條件為6 000 r·min-1下離心5 min，正交試驗中離心條件的3個水平為4 000 r·min-1下離心15 min、6 000 r·min-1下離心5 min、8 000 r·min-1下離心5 min。

2.2 正交試驗結果分析

由表2中正交試驗的結果可知，溶液體系pH值對測定結果的影響最大，其次為三氯甲烷用量，離心條件的影響較小。由k值得，正交試驗的最優水平組合為A3B1C2，即使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節pH值至11.0，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次、于6 000 r·min-1下離心5 min的處理條件下加標回收效果最優。

2.3 優化方法的準確度與精密度測試

選擇不同品牌、不同度數的3種山西老陳醋樣品，分別加入200 μL濃度為1.0 mg·mL-1的川芎嗪標準溶液，采用2.2中正交試驗篩選出的條件處理醋樣，在1.4液相色譜條件下進行6次平行測定，計算6次平均測定結果的加標回收率及精密度（以相對標準偏差表示）。由表3可知，使用優化的方法條件進行醋樣前處理，加標回收率為90.9%～93.8%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.47%～1.19%，準確度與精密度均可以滿足山西老陳醋中川芎嗪測定的需求。

3 結論

本試驗針對GB/T 19777—2013附錄B中高效液相色譜法測定山西老陳醋中川芎嗪方法回收率較差的問題，使用單因素試驗和正交試驗對前處理條件進行優化，并使用優化后的方法條件對3種不同品牌、不同度數的山西老陳醋樣品進行加標回收與精密度驗證，得出使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調節醋液pH值至11.0，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次、6 000 r·min-1下離心5 min，加標回收率為90.9%～93.8%，相對標準偏差為0.47%～1.19%。優化后的方法可將日常檢驗中川芎嗪的加標回收率由65%提升至90%以上，大大提高了山西老陳醋中川芎嗪測定的準確度，可以滿足食醋企業和食品檢驗檢測機構對山西老陳醋中川芎嗪的檢測需求。

參考文獻

[1]胡紅娟.山西老陳醋釀造技藝[J].食品工程，2015（3）：18-20.

[2]朱麗，樊垚，曾泳艇，等.山西老陳醋中川芎嗪測定及特征分析研究[J].食品科技，2014，39（12）：294-298.

[3]王瑞，彭曉光，黃登宇.食醋中川芎嗪成分研究進展[J].中國調味品，2015，40（6）：137-140.

[4]鞏麗青，韓順林，趙芳，等.山西老陳醋釀造過程中川芎嗪的分析測定[J].中國調味品，2018，43（8）：135-138.

[5]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.地理標志產品 山西老陳醋：GB/T 19777—2013[S].北京：中國標準出版社，2013.