刺梨果酒發酵工藝優化及揮發性風味物質分析

摘 要：以刺梨為原料，通過正交實驗確定出刺梨果酒酒精發酵的最優工藝條件，并利用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用技術（Headspace Solid Phase Micro Extraction Gas Chromatography Mass Spectrometry，HS-SPME-GC/MS）測定刺梨果酒中的揮發性風味物質。結果表明，刺梨果酒的最佳工藝條件為干酵母添加量0.10%、發酵溫度28 ℃、發酵時間8 d，由此工藝條件發酵的刺梨果酒在酒精度和感官品質上都表現優異。用氣相色譜-質譜聯用技術（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）共鑒定出了40種揮發性風味物質，其中酯類20種、醇類10種、醛類7種、其他類3種。本研究為工業化液態發酵刺梨果酒以及刺梨果酒的特征香氣物質研究提供一定的理論參考。

關鍵詞：刺梨；發酵；頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用技術（HS-SPME-GC/MS）；揮發性風味物質

Fermentation Process Optimization and Volatile Flavor Substances Analysis of Rosa roxburghii Wine

ZHANG Lifang， YANG Rui， YE Xin， MOU Rang*

（Inspection and Testing Center of Lichuan， Enshi 445400， China）

Abstract： Using Rosa roxburghii as the raw material， the optimal process conditions for alcohol fermentation of Rosa roxburghii fruit wine were determined through orthogonal experiments， and the volatile flavor compounds in Rosa roxburghii fruit wine were determined using headspace solid phase micro extraction gas chromatography mass spectrometry （HS-SPME-GC/MS） technology. The results showed that the optimal process conditions for Rosa roxburghii fruit wine were a dry yeast addition of 0.10%， a fermentation temperature of 28 ℃， and a fermentation time of 8 days. The Rosa roxburghii fruit wine fermented under these process conditions exhibited excellent alcohol content and sensory quality. 40 volatile flavor compounds， including 20 esters， 10 types of alcohols， 7 types of aldehydes， and three other categories were identified using gaschromatography-mass spectrometry （GC-MS） technology. This study provides a theoretical reference for the industrial liquid fermentation of Rosa roxburghii fruit wine and the study of characteristic aroma compounds in Rosa roxburghii fruit wine.

Keywords： Rosa roxburghii; fermentation; headspace solid phase micro extraction gas chromatography mass spectrometry（HS-SPME-GC/MS）; volatile flavor substances

刺梨（Rosa roxburghii）為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實[1]，這種果實的成熟果皮上生長著小肉刺，并且包裹著種子，故稱為“刺梨”。刺梨營養豐富，富含多糖、黃酮、氨基酸等，其中果實內含有豐富的維生素C，被稱為“維C之王”[2]。在低酒精度環境中，刺梨中的一些營養物質，如維生素、礦物質等仍能得到保留[3]。同時，刺梨具有多種保健作用，包括調節人體新陳代謝、促進血液循環、控制膽固醇水平、抗衰老及增強抵抗力等[4]。

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高以及健康意識的增強，對于飲酒的選擇逐漸從高度酒向低度酒轉移，而具有保健作用的果酒更是受到越來越多消費者的青睞。果酒是以人工種植或野生的果品為原料，經過一系列工序進行發酵的一種低酒精度飲料。大部分常見水果，如葡萄、蘋果、桑葚、藍莓等，都能夠用于果酒釀造[5]。由于刺梨汁中的單寧、總酸含量較高，使得其在發酵過程中存在發酵周期長，產品酒精度偏低，糖度高以及易氧化褐變并產生氧化味等問題，這在一定程度上阻礙了刺梨果酒的發展[6]。目前利用刺梨進行果酒釀造過程中，研究人員主要關注發酵過程中各類功能性營養物質等的變化情況[7]，以及微生物對發酵底物的利用程度[8]，而缺乏對整個酒體協調性和香氣物質的研究。目前研究風味物質最常用的方法是頂空固相微萃取與氣質聯用技術。該方法操作簡單、靈敏度高、萃取效率高以及樣品預處理步驟少，且能高效地提取出風味物質并進行鑒定，被廣泛應用于葡萄酒、果酒等風味的研究[9]。

本研究對刺梨在液態發酵過程中的發酵工藝進行優化，并采用頂空固相微萃取與氣質聯用相結合的方法，分析果酒的揮發性風味物質，以期為工業化液態發酵刺梨果酒研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨，無霉變腐爛的野生鮮果，購自貴州省；酵母，安琪葡萄酒果酒專用酵母，湖北安琪酵母股份有限公司；液體型果膠酶（酶活≥30 000 U·mL-1），寧夏和氏璧生物技術有限公司；蔗糖、偏重亞硫酸鈉、乳酸等，均為分析純，國藥集團；2-辛醇，色譜純，Sigma公司。

1.2 儀器與設備

TSQ9610三重四極桿氣相質譜聯用儀，Thermo Fisher Scientific公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國Supelco公司；MJX-100B-Z恒溫培養箱，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 刺梨果酒釀造工藝流程

選用成熟、完好的刺梨果進行酒精發酵，具體工藝路線如圖1所示。

1.3.2 刺梨果酒釀造主要操作要點

（1）去核。去掉刺梨果前端的宿存花萼，將果實對半剖開，刮掉內部種子，只留果肉備用。

（2）打漿。定量稱取處理好的刺梨果，置于粉碎機中打碎，然后將粉碎后的刺梨漿置于2 L干凈燒杯中，攪拌均勻。

（3）酶解。向裝有刺梨漿的燒杯中加入適量無菌水，充分攪拌，然后加入100 mg·L-1偏重亞硫酸鈉，并用食品級乳酸調節pH值在4.5～5.0，加入0.05%刺梨質量的果膠酶，在50 ℃下酶解40 min，過濾。

（4）調配。向過濾得到的刺梨汁中加入蔗糖，用乳酸調整pH值在4.0左右，然后分裝到三角瓶中。

（5）發酵。稱取一定量干酵母，用含2%糖的38 ℃溫開水活化20 min，將活化的酵母接種到刺梨汁中，用紗布將發酵瓶封口，放置于恒溫培養箱中，于28 ℃下進行酒精發酵。

1.3.3 酒精發酵正交實驗設計

根據前期實驗，以酒精含量為判定指標，選擇酵母添加量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）3個因素，進行3因素3水平的正交實驗，對刺梨酒精發酵工藝條件進行優化，正交實驗因素水平見表1。

1.3.4 理化指標測定

酒精度的測定參照《食品安全國家標準 酒和食用酒精中乙醇濃度的測定》（GB 5009.225—2023）的測定方法進行[10]。

1.3.5 刺梨果酒感官評價

刺梨果酒的感官鑒評方法參考賀紅早等[11]的方法，略有改動。選擇5名實驗室人員對刺梨果酒進行感官評定，主要從外觀、色澤、香氣、口味和風格5個方面對刺梨果酒進行綜合評價并打分，感官評價標準見表2。

1.3.6 刺梨果酒揮發性風味物質測定

按照黃桂東等[12]的提取和測定方法，略有變動。

（1）頂空固相微萃取處理條件。取4 mL過濾后的澄清發酵液，加入到20 mL頂空瓶中，再加入1.0 g NaCl和20 μL內標（2-辛醇，調整濃度為8 800 μg·L-1），使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在50 ℃下預熱15 min，萃取吸附40 min，250 ℃解吸7 min，用于上機分析。

（2）氣相色譜-質譜聯用儀處理條件。①氣相色譜條件。色譜柱：TG-WAXMS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣（純度＞99.999%），不分流；流速：1.0 mL·min-1；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min，以6 ℃·min-1升溫至100 ℃，然后以10 ℃·min-1升溫至230 ℃，保持7 min。②質譜條件。離子源：EI源；發射電流：50 μA；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；掃描質量范圍：33～400 amu。

（3）定量分析方法。采用內標法進行。該方法基于被檢測物質與內標物濃度與吸收峰面積對應的比例關系，計算被檢測組分的含量。計算公式為

（1）

式中：Cx代表被檢測物質濃度，mg·L-1；Cs代表內標物濃度，mg·L-1；Ax代表被檢測物質峰面積；As代表內標物的峰面積。

未知化合物通過與NIST20譜庫和化學結構式庫進行比對，并通過計算保留指數（Retention Index，RI）確認。

1.3.7 數據處理

采用Excel 2016、SPSS Statistics 21.0等軟件對實驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 發酵工藝優化

酒精發酵過程中，酵母在厭氧環境下可以直接利用糖分產生乙醇。酵母的濃度對發酵液中糖的利用度以及乙醇的產生有影響，主要體現在濃度越高，產生的乙醇越快。然而，當乙醇濃度達到一定水平后，它又會抑制酵母的生長；在一定溫度范圍內，微生物的生長速率隨著溫度的升高而加快，但超過最適溫度則會抑制微生物的生長；隨著發酵時間的進行，糖分的減少、乙醇濃度的增加，導致酒精含量變化速率呈現先升高后變緩趨勢。因此，酵母添加量、發酵溫度和發酵時間對刺梨果酒酒精發酵過程有著重要的影響作用。本研究根據前期實驗結果進行3因素3水平的正交實驗。由表3可知，影響刺梨發酵產酒精的因素主次順序為酵母添加量＞發酵溫度＞發酵時間（A＞B＞C）。刺梨果酒的最佳釀造條件為A2B3C1，即在干酵母添加量為0.10%、發酵溫度為28 ℃、發酵時間為8 d條件下，刺梨果酒的酒精度最高。將同批次的鮮刺梨果經打漿、過濾、調配等處理后得到預發酵液，然后在發酵液中添加0.10%干酵母，并于28 ℃溫度下發酵8 d，發酵結束后測得酒精含量為8.7%vol，與預測值基本一致。

2.2 刺梨果酒產品感官鑒評

將最佳釀造條件下得到的發酵果酒進行感官評價。結果見表4。從感官評價結果來看，刺梨果酒平均得分為87分，發酵結束后的果酒外觀澄清透明、晶亮，有極少量沉淀，顏色呈琥珀色，與刺梨果實特有的顏色相似，酒香和水果香突出，口味較為醇和，具有刺梨果酒產品特有的風味。

2.3 刺梨果酒揮發性風味物質分析

揮發性風味物質對果酒的風味和風格等起著決定性的作用。本研究采用氣相色譜-質譜聯用技術（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）對刺梨果酒中揮發性風味物質進行鑒定。由表5可知，在刺梨果酒發酵液中共檢測出40種揮發性風味物質，其中酯類20種、醇類10種、醛類7種、其他類3種。酯類中主要的香氣物質為亞油酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸乙酯和辛酸乙酯，酯類多是具有芳香和水果香氣的物質，賦予果酒特有的香氣風格；醇類中主要香氣物質為異戊醇、苯乙醇和異丁醇等，這幾種都屬于高級醇，也是果酒中重要的風味物質，能夠增加果酒的醇香味，如果缺失則會導致酒味淡薄，酒體不豐滿，這與用其他水果釀造的發酵果酒較為一致[13]。

3 結論

本研究通過正交實驗優化了刺梨果酒發酵工藝，得出的最佳工藝條件為干酵母添加量0.10%，發酵溫度28 ℃，發酵時間8 d，此時果酒的酒精度達到最高，為8.8%vol。采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用技術對刺梨果酒發酵液中的揮發性風味物質進行測定，共檢測出40種揮發性風味物質，其中酯類20種、醇類10種、醛類7種、其他類3種。其中，主要香氣物質為異戊醇和苯乙醇。未來，研究人員還需繼續優化儀器的分析條件，以便能夠對刺梨果酒的風味物質進行更加準確的分析。

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