實驗生物種質資源的保護和應用研究

關鍵詞：松滋青皮豆；致突變性；種質資源保護

前言

蠶豆是經典的遺傳實驗生物，蠶豆根尖是理想的遺傳毒性測試材料，它首先應用于染色體畸變試驗，隨后擴展到微核試驗。1959年，放射生物學家就開始用蠶豆的根尖細胞來進行X-射線的遺傳損傷研究，Degrassi和Rizzoni研究X-射線、絲裂霉素C等多種誘變劑對蠶豆根尖（次生根）微核的效應。1983年陳光榮等在國內首先建立蠶豆根尖微核試驗法，并選3種農藥對14種蠶豆的敏感性進行篩選和統計學分析，松滋青皮豆是理想的高敏感性品種，并對青山湖的水質污染進行了檢測。《環境監測技術規范》（生物監測（水環境）部分）規范方法，《水生生物監測手冊》，《水和廢水監測分析方法》（第四版）均有編人。

《水質致突變的鑒別蠶豆根尖微核試驗法》（HJ 1016-2019），適用于環境樣品地表水、地下水、生活污水和工業廢水的致突變性鑒別。標準采用的松滋青皮豆來源均有可靠證明，可溯源至華中師范大學原生物系，以初生根為受試器官，經長期純化保種，遺傳特性相對穩定。葛成巖、張倩等對蠶豆根尖微核試驗的質量保證如受試物種、參比毒物等進行了研究。為更好地保護種質資源和維持試驗穩定性，從松滋青皮豆的種植、豆種挑揀到微核試驗受試豆粒選擇等全流程做了質量控制研究。

1種質資源保種場的周邊環境調查

松滋青皮豆原產于湖北省松滋縣，是一種中粒（千粒重600g～1100g之間為中粒蠶豆）綠色蠶豆，對水胺硫磷40%乳劑1：800稀釋倍數微核率為89.33 +9.73，1：1600稀釋倍數微核率為59±7.37敏感性高，對藥劑耐受率較強，可在較廣泛的濃度范圍檢測誘變劑活力。2013年后，松滋青皮豆的保種傳代由江蘇省常州環境監測中心負責，隨后通過實地踏勘和篩選，在自然環境較好的溧陽大溪水庫邊建立了專門的保種場，灌溉水和土壤質量分別符合《農田灌溉水質標準》（GB/T 5084-2005）和《土壤環境質量標準》（GB/T 15618-1995）中的二級標準，每年種植一季。

2019年后種植面積擴大，種植中不得使用農藥、化肥及其他化學物質，手工除草、除蟲，周邊田地不得種植其他品種蠶豆。收獲后曬干，并挑選無蟲眼、種皮完整的松滋青皮豆，并對收獲的松滋青皮豆進一步進行精選，區分等級后，進行低溫保存。

周邊環境的變化有可能會影響種質資源的穩定性，定期對溧陽保種場周邊進行實地踏勘，2023年踏勘了毛尖村、彭家村、彭東村、東山岕和小山岕等幾個村莊的種植田地狀況，并同時調查了農戶種植情況。具體踏勘情況見表1。

2種質資源的保護

2.1種質資源種植和保存

松滋青皮豆在中國大部分地區均可引種繁殖，可根據當地氣候條件合理安排種植時間。但實驗用豆種對種植土壤和周邊環境有較高要求：種植地應選擇生態條件較好，無工業“三廢”、農藥和放射性污染的場地；為保持品系純正，避免與其他品種雜交，種植地周邊1km2范圍內不得混種其他蠶豆品種，最好每年輪作種植，維持土壤肥力和生產力．減少土地疲勞，控制病蟲害；注意保持較寬行距，避免過密導致植株相互遮蔭，影響光照，導致植株生長過高、發生倒伏；為保持較低的本底微核率，種植期間不施用化肥農藥，手工除草除蟲，對種植人員要求較高。豆種的保存技術難點：當豆莢變黃、籽粒飽滿時，選擇在晴天進行收獲，及時晾曬、脫粒，剛收獲的豆種含有較多的水分，而潮濕的豆種的呼吸作用比較旺盛，消耗的有機物較多，同時還會釋放大量的熱，容易使豆種發熱發霉影響種子的壽命，曬干后可抑制呼吸作用，從而延長豆種的保存時間；曬干后需人工挑選，因豆種種植中未施藥，病蟲豆種較多，挑選中需要技術人員耐心細致，選擇大小均一、顆粒飽滿、無明顯缺損、無病蟲害、表皮青綠或青棕色的豆種；挑選好的豆種裝入透氣的牛皮紙袋或大信封內于專用冰箱4℃以下冷藏，不建議儲存在塑料袋或密閉容器內，存儲環境避免濕度過大，定期檢查豆種存儲狀態；豆種保存期不超過2年，如保存年限過長等原因導致豆種出根率偏低時，可挑選經催根后生長情況良好的豆種栽培復壯。

2.2種質資源篩選和預處理

松滋青皮豆收獲后，對有蟲洞、霉變的及時挑揀，并剔除過大過小的豆粒。通過隨機抽取1000粒松滋青皮豆進行18組稱重測定，每千粒重一般為706g～787g，檢測結果見表2。

經浸種、催根后，統計總豆種數，及霉變、不出根、根尖枯死的豆種數，出根率=（總豆種數一霉變、不出根、根尖枯死的豆種數）／總豆種數×100%，一般應≥90%（《糧食作物種子第2部分：豆類》（GB/T4404.2-2010）中要求蠶豆種子發芽率≥90%），試驗前將松滋青皮豆自然晾曬2～3天有利于出根。

2.3種質資源試驗要求

試驗用松滋青皮豆，須挑選顆粒飽滿、豆皮青綠或青棕色、大小一致、無病蟲害、表面無明顯缺損的豆種。同時，受試生物質量應滿足試驗的要求，主要指標見表3。

3種質資源的應用

以松滋青皮豆為實驗材料的方法標準已頒布，用于對水質致突變效應進行鑒別，可作為有關水環境、垃圾填埋場風險評估指南、規范等管理標準的檢測技術方法支撐。作為表征環境綜合遺傳毒性效應的技術方法可應用于農灌水、淡水湖泊及農藥、金屬冶煉、印染、化工等污染風險較高的行業污水等環境污染監測，對地表水可能存在的風險和污水排放的綜合毒性及致突變性進行監管。張茂榮等應用根尖細胞微核實驗分析了武漢市城區9個自然水體的致突變性。許霞等對常州市某廢棄農藥廠污染場地6個不同區域的土壤樣品進行了蠶豆根尖微核遺傳毒性試驗，其中2個點位土壤浸出液毒性最高，該研究為污染場地進行綜合評價與風險評估提供依據。各地環境監測中心、澳門自來水等均有購置或申請松滋青皮豆進行水質致突變試驗。因此，以松滋青皮豆為實驗材料的蠶豆微核試驗法對水環境風險評估、污水排放等管理過程的環境介質致突變性監管具有較大的應用價值。

該方法標準適用范圍較廣，測試材料易獲得，成本低，方法簡易、快速，對監測硬件條件的要求不高，基層環境監測站均可開展此項工作，各級監測站在該項目能力的形成上應更注重人員和管理，積累監測人員的實際操作經驗，不斷提高分析測試水平，控制受試生物的質量，強調陽性、陰性等對照試驗的過程控制，確保監測質量，有效服務環境管理。

4結論

蠶豆根尖是較理想的遺傳毒性測試材料，松滋青皮豆是國內廣泛接受用于致突變性測試的敏感受試生物。為確保實驗性狀的穩定性，對種植環境、過程及豆種收獲均需進行質量控制：定期檢測保種場地的周邊環境變化及污染狀況，避免增高微核本底值；栽種期間應避免其他蠶豆品種花粉污染，為避免不施用化肥農藥連作種植帶來的蟲害，最好輪作種植；種質收獲后應及時曬干，并挑揀出合適大小，無病斑蟲害的完整健康豆種；實驗前進行浸種、催根，出根率一般應≥90%，偏低時，挑選催更后生長良好的豆種栽培復壯；實驗用豆種有絲分裂指數應gt;20%，空白微核率≤10.0%，參比微核率（參比試樣陽性對照，p=20.0mg/L環磷酰胺溶液）微核率15.8%～30.8%，2個平行測試相對偏差≤36%。對實驗生物的質量控制，可有效保障監測結果的準確性，為環境管理提供可靠數據。