冠菌素提高番茄對番茄黃化曲葉病毒抗性的分析

摘要：番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）在生產上是一種毀滅性病害，而目前針對該病害尚無有效的防治措施。冠菌素可在植物抗逆反應中發揮一定作用，然而冠菌素提高番茄對TYLCV抗性的研究還鮮有報道。為探究冠菌素提高番茄抗番茄黃化曲葉病的機制，以番茄感病品種浦粉一號為試驗材料，在盆栽試驗中，通過qPCR的方法來檢測葉片中TYLCV病毒含量，分別采用氮藍四唑還原法、愈創木酚比色法和紫外吸收法測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性，通過實時熒光定量PCR測定抗性相關基因表達量。在田間試驗中，利用卷尺、游標卡尺等測定番茄植株葉片數、莖粗、開展度，并統計病情指數和植株發病率。結果表明，冠菌素處理顯著降低TYLCV含量約83.5%（Plt;0.000 1），顯著增加了POD、SOD的活性（Plt;0.0001、Plt;0.05），上調編碼葉綠素a/b結合蛋白基因Cab-1A和Cab-1D，誘導番茄抗病信號通路上FLS2和PR-1a1上調表達。田間試驗結果表明，冠菌素處理降低了植株平均病情指數和發病率，并顯著增加了番茄植株的開展度（Plt;0.000 1）。綜上所述，冠菌素可以降低番茄植株葉片中TYLCV含量，影響番茄抗氧化酶活性并增加抗性相關基因的表達量。研究結果可為冠菌素在番茄抗TYLCV過程中的應用提供理論依據。

關鍵詞：冠菌素；番茄；番茄黃化曲葉病毒；基因表達；抗性反應

中圖分類號：S436.412.1+1文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0116-06

番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）屬雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），該病毒侵染植物初期可以引起植株葉片變黃、變小、變脆并向上卷曲，感病后期植株整體變形、焦枯，果實成熟慢且多畸形果，嚴重影響番茄果實的產量和品質。該病毒在自然界由煙粉虱傳播，在生產上是一種毀滅性病害，因此受到廣泛研究和關注［1-2］。目前，生產中采用多種農業措施防治TYLCV，但是防治效果較差，且化學防治容易造成農藥濫用和環境污染。

冠菌素（COR）是丁香假單胞菌分泌的次生代謝物，分子式為C18H25NO4，相對分子質量為319，具有與茉莉酸相似的結構和生理功能［3］。一方面，病原菌分泌的冠菌素可以通過激活植物體NAC轉錄因子，抑制與水楊酸代謝相關的基因，并進一步降低水楊酸的積累，增強病原體的致病性［4-5］。另一方面，冠菌素可以提高植物在非生物逆境下的抗性，緩解高溫、干旱和低溫等環境脅迫對植物造成的不利影響。例如，冠菌素通過調控氮代謝和葉綠體中的光合蛋白，維持小麥植株在熱脅迫下的光合作用，降低熱脅迫對小麥產量的影響［6］；濃度為 1 μmol/L 的冠菌素處理玉米植株可以提高植株的根干質量和根面積，從而提高玉米植株應對干旱脅迫的能力［7］。冠菌素還可以調控棉花幼苗的抗壞血酸-谷胱甘肽循環系統，增加棉花幼苗營養器官中抗壞血酸含量并清除過多的過氧化氫，以提高棉花幼苗抗低溫的能力［8］。上述研究表明，冠菌素在植物抗逆反應中發揮一定作用，然而冠菌素提高番茄對TYLCV抗性的影響還鮮有報道。

本試驗以番茄感病品種浦粉一號作為試驗材料，以去離子水處理的感病品種作為對照組，通過盆栽試驗檢測冠菌素處理后接種TYLCV的各種抗性指標，通過田間試驗統計冠菌素處理番茄后各組植株的葉片數、莖粗、開展度和病級，并計算病情指數和發病率，以期為冠菌素在番茄抗TYLCV中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄感病品種為浦粉一號，由上海富農種業有限公司提供。

番茄黃化曲葉病毒毒株侵染性克隆TYLCV-SH2，由浙江大學周雪平教授所在實驗室提供。

1.2 盆栽試驗和田間試驗設計

盆栽試驗：將種子置于25 ℃的環境中催芽，經過大約48 h后，將出芽種子播種到基質體積比為草炭 ∶蛭石 ∶珍珠巖=3 ∶1 ∶1的穴盤中。待番茄長大到2張真葉時，把番茄幼苗移栽到花盆中繼續生長。生長大約3周后，番茄植株的地上部長到3～4張真葉，然后隨機分成2組，分別用混合有助劑（004%Silwet L-77）的0.1 μmol/L冠菌素［西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］和去離子水對番茄葉片進行外源噴施處理。處理24 h后，使用 1.0 mL 的醫用注射器將農桿菌濃度為5 000萬CFU/mL（D600 nm=0.5）的GV3101（TYLCV-SH2）接種于供試番茄幼苗地上部子葉以下1～2 cm莖桿處，進行韌皮部注射接種，每株接種0.5 mL農桿菌菌液。對照植株接種農桿菌空載體GV3101。病毒侵染后7 d，從處理的番茄植株頂部向下數第3張真葉上采集幼嫩葉片，用于本試驗中病毒含量、抗氧化酶活性和基因表達量的測定。盆栽試驗均進行3次生物學重復。

田間試驗：試驗于2022年6—10月進行。試驗棚室位于上海市浦東新區上海富農種業有限公司（121.54°E，31.22°N）的塑料大棚，試驗棚室長50 m，矢高4.2 m，跨度12 m。灌溉方式為滴灌。試驗采用單因素完全隨機區組設計，以去離子水處理的植株作為對照（CK），以冠菌素噴施的植株作為處理組。利用噴壺噴施混合有助劑（0.04%Silwet L-77）的0.1 μmol/L冠菌素到植株葉片表面，直至葉片表面出現凝珠。處理后18 d進行病情指數和性狀指標采集。處理組番茄在生長期間不施殺蟲劑和病毒防控藥劑，其他田間管理按照當地常規栽培措施進行。

1.3 抗性指標測定與分析

1.3.1 番茄葉片中病毒含量的測定

通過qPCR的方法來檢測葉片中TYLCV病毒的含量。將采集到的葉片樣本迅速放入液氮速凍保存。使用DNA提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］對采集的葉片進行DNA提取。qPCR檢測使用SYBR熒光染料（TaKaRa公司）在實時熒光PCR系統（Bio-Rad公司，美國）上完成。選用Actin基因（LOC101260631）作為內參基因，qPCR儀的設定程序如下：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，設置40個循環。采用CFX ManagerTM軟件（version 3.0，Bio-Rad，CA，United States）分析溶解曲線數據。SlACTIN基因的引物序列見表1中Actin的引物序列。將CK中TYLCV含量設定為1。檢測TYLCV所用的引物序列正向引物為：5′-CACTCAATTCAGGCAGTAAATCC-3′，反向引物為：5′-GACCCACTCTTCAAGTTCATCTG-3′。

1.3.2 番茄葉片中抗氧化酶活性的測定

稱取03 g液氮研磨后的葉片樣品，分別置于10 mL離心管中，加入50 mmol/L pH值為7.8的磷酸緩沖液 6 mL，搖勻后冰浴30 min。然后將離心管置于 4 ℃、10 000 r/min 的離心機中離心10 min，上清液即為提取的粗酶液，置于4 ℃冰箱中保存備用，用于超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的活性測定［9］。

1.3.2.1 SOD活性測定

測定方法采用氮藍四唑（NBT）還原法。反應體系為50 mmol/L pH值7.8磷酸緩沖液、130 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液、750 μmol/L 氮藍四唑（NBT）溶液，20 μmol/L核黃素和100 μmol/L EDTA-Na2溶液［10］。其中一支管作對照管，將其加入核黃素后立即用雙層錫箔紙包裹放置于黑暗處。然后，把其他各管置于光照處 30 min，黑暗終止反應。以空白管調零，測定反應液在560 nm處的吸光度（D560 nm）。

1.3.2.2 POD活性測定

POD活性測定采用愈創木酚比色法。酶反應體系：50 mmol/L磷酸緩沖液（pH值為5.5）50 mL，加入28 μL愈創木酚加熱攪拌均勻，待到冷卻后加入19 μL 30%過氧化氫制成愈創木酚反應液，混勻后倒入棕色瓶（現配現用）。取0.1 mL磷酸緩沖液和3 mL反應液混合調零，0.1 mL 酶液和3 mL反應液于470 nm處測定 3 min 內吸光度的變化［10］。以3 min內平均每分鐘D470 nm變化值表示酶活性大小，并換算成U/（g·min）。

1.3.2.3 CAT活性測定

CAT活性測定采用紫外吸收法。反應體系：1.5 mL 50 mmol/L pH值為7.8的磷酸緩沖液、20 μL酶液或沸水浴煮死的酶液、1 mL 蒸餾水，最后加入0.3 mL 0.1 mol/L H2O2啟動液混合均勻，用石英比色皿于240 nm處，每隔 10 s 讀數1次，測定3 min內吸光度的變化［10］。酶活力以1 min內D240 nm減少0.1的酶量為1個酶活單位，并換算成U/（g·min）。

1.3.3 實時熒光定量PCR（Real-Time qPCR）基因差異表達分析

將采集到各組樣本葉片至于液氮中研磨，然后取100 mg混合均勻的樣品，采用Trizol法提取總RNA。利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄得到cDNA。利用Primer 5設計5對引物（表1），測定不同樣本中基因包括Cab-1D、Cab-1A、FLS2和PR-1a1的表達量，選用Actin（LOC101260631）作為內參基因。在CFX96實時熒光定量分析儀（Bio-Rad上海有限公司）上進行 RT-qPCR反應。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 變性5 s，60℃退火延伸30 s，共設置40個循環。對得到的數據采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量，試驗設置3次生物學重復。

1.4 田間試驗調查方法

利用卷尺、游標卡尺等測定番茄植株葉片數、莖粗和開展度，在處理后18 d記錄不同處理組的各項性狀指標，調查5株后取平均值。

病情調查分級：0級，無病毒癥狀，全株無病；1級，1%～25%的植株出現病毒癥狀（矮小、葉片畸形等），心葉出現花葉癥狀；3級，26%～50%的植株出現病毒癥狀（矮小、葉片畸形等），植株有1/3左右的葉片呈現花葉等癥狀；5級，51%～75%的植株出現病毒癥狀（矮小、葉片畸形等），全株葉片出現花葉癥狀，全株株型是健株的1/3～1/2；7級，76%～100%的植株出現病毒癥狀（矮小、葉片畸形等；全株葉片萎縮，畸形）。計算病情指數。

番茄黃化曲葉病發病率=發病株數/總株數×100%。

1.5 數據統計與分析

測得的數據通過GraphPad Prism version 9.0.0 for Windows（www.graphpad.com）分析，在單因素方差分析后執行Tukey多項比較檢驗，并通過該軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 COR處理抑制葉片中TYLCV的含量

前人的研究表明，茉莉酸可以誘導植物的系統性抗性［11］，而冠菌素（COR）結構與茉莉酸結構類似，有必要檢測冠菌素是否也具有誘導番茄增強抗性達到抑制病毒積累的功能。由圖1可知，冠菌素處理后接種TYLCV，7 d后檢測病毒相對含量比對照病毒含量顯著減少（Plt;0.000 1），冠菌素處理后的番茄植株葉片中TYLCV相對含量相比對照（CK）下降83.5%。說明冠菌素處理可以誘導提高番茄植株的抗性，顯著降低番茄葉片中TYLCV的含量。

2.2 COR處理后接種TYLCV影響番茄抗氧化酶活性

為進一步揭示冠菌素促進番茄提高對TYLCV抗性的機制，對冠菌素處理后番茄葉片中抗氧化酶的活性進行檢測。SOD、POD和CAT是植物體內重要的清除活性氧的酶系。SOD能催化O-2·轉化為H2O2和O2，清除細胞中多余的O-2·。CAT和POD可進一步將H2O2轉化為O2和H2O。抗氧化酶活性測定結果（圖2）表明，當番茄植株用冠菌素處理后接種TYLCV，植株葉片中POD、SOD的活性顯著增加（Plt;0.000 1、Plt;0.05），而CAT的活性顯著降低（Plt;0.000 1），表明冠菌素處理可以顯著影響番茄植株葉片中的抗氧化酶活性。其中，冠菌素處理后番茄葉片的POD活性增幅最大，相較于CK增加168.22%，SOD活性增加8.15%，而CAT活性降低60.59%。上述結果表明，冠菌素處理可以顯著影響番茄葉片中抗氧化酶活性，并對POD活性的影響最大。

2.3 施用COR后接種TYLCV對葉片光合作用相關基因表達的影響

植物光合作用是植物賴以生存的基礎，植物光合色素是光合作用的重要參與者，在植物轉化光能成為化學能的過程中發揮著重要作用。在光合作用中，捕光色素葉綠素a/b結合蛋白具有吸收光能和推動電子傳遞鏈的作用。通過檢測編碼葉綠素a/b結合蛋白的基因Cab-1A和Cab-1D的表達量，結果表明，在冠菌素處理后接種TYLCV組的Cab-1A和Cab-1D相對表達量分別上調約2.57倍和3.33倍（圖3）。上述結果表明，冠菌素處理后接種TYLCV番茄植株可通過上調合成葉綠素a/b結合蛋白基因的表達來影響植物光合作用。

2.4 施用COR后接種TYLCV對番茄抗病信號通路相關基因表達的影響

植物抗病信號途徑在植物抵御病原微生物侵染中起著非常重要的作用。本研究分別選取了植物中編碼上游抗病信號途徑中的模式識別受體FLS2（flagellin-sensing 2）的基因［12］和編碼下游抗性植物病程相關蛋白PR1（pathogenesis-related protein 1）的基因［13-14］進行檢測。研究結果（圖4）顯示，COR處理與CK相比，PR-1a1和FLS2的表達量均增加，其中PR-1a1的相對表達量增加7583倍。上述結果暗示COR可能通過誘導植物抗病信號通路相關基因的表達以促進對TYLCV的抗性。

2.5 不同處理的番茄病級指數統計分析

為進一步驗證冠菌素是否在田間也具有提高番茄對TYLCV抗性的效果，本研究通過田間試驗進行驗證。通過施用濃度為0.5 mmol/L的冠菌素處理感病番茄品種，18 d后對田間番茄植株進行病級指數統計，結果（表2）表明，未經冠菌素處理的番茄植株平均病情指數為7.63，平均發病率為30.95%；冠菌素處理后番茄植株的平均病情指數為1.74，平均發病率為12.21%。上述結果表明，冠菌素對番茄黃化曲葉病具有一定防效，可以降低植株平均病情指數和平均發病率。

2.6 不同處理間性狀指標統計分析

試驗隨機抽選各組處理的番茄植株，對開展度、莖粗和葉片數進行性狀指標檢測，結果（圖5）顯示，冠菌素處理后番茄植株的葉片數比未經冠菌素處理組顯著增加（Plt;0.05）；2個處理的莖粗指標沒有顯著差異。在開展度指標方面，冠菌素處理番茄植株的開展度較CK顯著增加（Plt;0.000 1），約為CK的2倍。

3 討論與結論

冠菌素是由丁香假單胞菌分泌的一種化合物，具有與茉莉酸相似的結構和生理功能。研究表明，冠菌素可以提高植株在非生物逆境下的抗性，而冠菌素對番茄抗TYLCV的影響還鮮有報道。本試驗結果表明，冠菌素處理可以降低TYLCV在番茄葉片中的含量。在植物體中，活性氧不僅可以作為直接對抗脅迫的物質，同時也作為細胞信號物質在抗性反應中發揮重要作用［15］。前人對TYLCV的番茄抗性基因MAPK3功能的研究表明，在該基因過表達的植物體中，H2O2的積累下降，同時POD、SOD和CAT的活性增加［16］。本試驗對活性氧測定的結果表明，相較于CK，冠菌素處理的POD、SOD活性呈顯著上升趨勢，CAT活性呈顯著下降趨勢。考慮到植物清除活性氧是一個動態變化過程，而在本研究中僅選取了一個時間點，結果顯示為POD、SOD及CAT活性呈不同變化趨勢，只能說明冠菌素處理影響了番茄體內的活性氧平衡，而具體機制還需要未來繼續研究。

研究表明，番茄黃化曲葉病可抑制植株的光合作用，影響植株的生長和產量。在被TYLCV侵染的植株中，與光合作用相關的基因下調表達［17］。前人的研究表明，外源冠菌素處理可通過調控氮代謝和葉綠體中的光合蛋白，維持小麥植株在熱脅迫下的光合作用，降低熱脅迫對小麥產量的影響［6］。而另一項研究表明，冠菌素處理的番茄植株中，與光合作用中光系統Ⅰ（PSⅠ）和光系統Ⅱ（PSⅡ）相關的基因表達被抑制［18］。而在本研究中，冠菌素處理可以誘導編碼葉綠素a/b結合蛋白的基因Cab-1A和Cab-1D上調表達（圖3）。光捕獲葉綠素a/b結合蛋白（LHCB）是光系統Ⅱ（PSⅡ）光捕獲復合體的脫輔基蛋白，該蛋白具有吸收光能和推動電子傳遞鏈的作用［19］。光敏色素捕捉到光能后，可以促進LHCB基因的表達，而氧脅迫等環境脅迫可以降低該基因的表達［20］。試驗結果表明，冠菌素處理接種TYLCV后，基因Cab-1D和Cab-1A上調表達，表明冠菌素可能在番茄與TYLCV互作過程中通過提高植株光合效率來減小TYLCV侵染對光合作用的影響。光合作用是非常復雜的生物化學過程，冠菌素處理可以影響與光合作用相關基因的不同表達，但是相關的機制還需要進一步探究。

PR1和FLS2是植物抗病信號途徑中的2個重要蛋白。FLS2是植物中第1個被鑒定的植物模式識別受體，可以識別細菌鞭毛蛋白N端的保守多肽（flg22），產生模式觸發的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）［21］。令人感興趣的是，接種TYLCV的冠菌素處理FLS2基因上調表達，說明FLS2可能還在植物與病毒互作的過程中具有一定的功能，但是機制需要進一步闡明。本研究發現，PR-1a1基因在冠菌素處理后相較于CK表達量顯著增加，在煙草花葉病毒侵染的植株中，PR-1b1基因被局部強烈激活［22］。在被黃瓜花葉病毒侵染的番茄植株中，PR-1a1、PR-1b1等抗性基因被激活表達［23］。這些結果說明冠菌素處理提高番茄對TYLCV的抗性與激活植物抗病信號途徑相關。

最后，通過田間試驗發現，冠菌素處理的植株病情指數降低，植株發病率降低，且植株開展度增加。再次驗證了冠菌素可提高番茄對番茄黃化曲葉病的抗性，說明冠菌素對番茄黃化曲葉病具有一定的防效。本研究結果可為進一步研究冠菌素在農業生產中的應用奠定基礎。

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