冬瓜種子粗提物對白菜種子萌發和幼苗生長的影響及其內源抑制物分析

摘要：探究內源抑制物對冬瓜種子萌發的影響，為揭示冬瓜種子的休眠原因及解除種子休眠的方法具有重要意義。以冬瓜種子為材料，采用系統溶劑分離法對冬瓜種子種皮和種胚的甲醇粗提液進行分離得到不同有機相（石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相）和水相，測定各分離相的浸提液對白菜種子萌發及幼苗生長的影響；結合氣質聯用（GC-MS）技術和模擬研究法，分析冬瓜種子內源抑制物種類、含量及有機化合物的抑制活性。采用55～75 ℃熱水浸泡30 min或250～1 000 mg/L GA3浸泡20～120 min，能有效解除冬瓜種子休眠。冬瓜種子的種皮和種胚分離得到的各分離相對白菜種子萌發和幼苗生長均有不同程度的抑制作用，其中乙酸乙酯相、甲醇相和乙醚相抑制作用最強。采用GC-MS技術檢測到冬瓜種皮、種胚分別存在34、39種有機化合物，主要為有機酸類、醇類等物質，其中相對含量較高的有機化合物包括2-羥基吡啶、棕櫚酸、十八烷酸、2-羥基丙酸等物質，研究結果可為冬瓜種子的休眠解除和休眠機制提供理論依據。

關鍵詞：冬瓜；休眠特性；內源抑制物；GC-MS

中圖分類號：S642.301文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0141-09

冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）為葫蘆科冬瓜屬的一年生草本植物，原產于我國南部地區，是調節蔬菜淡季供應的重要蔬菜，具有貨架期長、耐貯藏等優點。冬瓜種子由種皮和種胚2個部分構成，種皮堅硬且厚，表面富含角質層，泡水后不易下沉［1］。根據種皮形狀和結構，可分為有棱扁籽和無棱光籽2種類型。

冬瓜繁殖方式主要是種子繁殖，但由于種子休眠或休眠解除不徹底，導致冬瓜育種過程中存在發芽率低、出苗不齊等問題，直接影響冬瓜的繁種與育種工作。種子休眠是指完整的具有生活力的種子在適宜的環境條件下不能正常萌發的現象［2］。種子休眠的原因復雜多樣，大體上可以分為外部因素和內部因素。外部因素包括溫度、濕度、光、水分等。內部因素包括種殼障礙、內源抑制物等。內源抑制物是由植物種子產生的某些化學物質，通過影響種子生理活動或代謝，從而抑制種子萌發。近年來，關于內源抑制物的研究報道不斷增多。謝朋等研究發現，假色槭種子的種皮和種胚中存在內源抑制物，種胚的抑制活性最強，是導致種子休眠期長、不易發芽的主要原因［3］。張躍進等對黃精種子存在內源抑制物的部位進行研究發現，種皮的抑制作用高于胚乳［4］。宋會興等的研究表明，四川省牡丹種皮和胚乳內存在抑制物，隨著該物質濃度增加，抑制作用增強［5］。另外，采用系統溶劑法對種子內源抑制物進行研究也有大量報道［6-8］。通過測定不同溶劑提取的斧形沙芥種子浸提液的活性，發現甲醇和乙酸乙酯抑制性較強［9］。返魂草種子中也存在內源抑制物，不同浸提液抑制作用為甲醇浸提液依次強于乙醚浸提液和水浸提液［10］。GC-MS技術可用于對內源抑制物進行定性定量分析。Blake等利用GC-MS技術對歐洲白蠟種子內源抑制物進行鑒定，推測脫落酸（ABA）、吲哚乙酸（IAA）等物質可能影響種子休眠［11］。朱銘瑋等通過GC-MS檢測油用牡丹品種鳳丹的種子生物活性，推測鳳丹種皮和種胚主要的抑制物是酚類物質和有機酸類物質［12］。

目前，關于冬瓜種子的研究主要集中在打破種子休眠［13-17］、種子純度［18-19］等方面，對種子內源抑制物種類、相對含量等方面研究甚少。本研究以冬瓜種子為材料，對種子內源抑制物進行分離與鑒定，測定不同分離相的生物活性指標，結合氣質聯用（GC-MS）技術和模擬研究法探究冬瓜種子種皮和種胚中提取的內源抑制物種類、含量及有機化合物的抑制活性，以期為冬瓜種子休眠機制的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年8—12月在福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室中進行。供試冬瓜種子取自福建省農業科學院作物研究所蔬菜研究中心，4 ℃儲藏備用。白菜種子品種為君川美格，購自福州農嘉種子科技有限公司，純度≥95％，凈度≥98％，發芽率≥85％，含水量≤7％。

1.2 冬瓜形態指標

隨機選取206粒成熟的冬瓜種子，使用游標卡尺測量種子的長、寬、厚，取平均值。隨機選取冬瓜種子1 000粒，用1/1 000電子天平測定千粒重，3次重復。

1.3 冬瓜種子休眠解除方法

1.3.1 熱水對種子發芽的影響 隨機選取3組種子，每組50粒，分別用55、65、75 ℃熱水浸泡 30 min，蒸餾水處理的種子為對照，30 ℃培養箱培養，3次重復。于培養9 d后統計種子發芽率。

1.3.2 GA3處理對種子發芽的影響 隨機選取50粒種子，分別配制濃度為250、500、1 000 mg/L赤霉素（GA3）溶液，分別浸泡20、30、60、120 min，蒸餾水處理的種子為對照，30 ℃培養箱培養，3次重復。于培養9 d后統計種子發芽率。

發芽率=發芽種子數/種子總數×100％。

1.4 冬瓜種子內源抑制物提取

選取飽滿的冬瓜種子，分別將種皮和種胚研磨成粉末。稱取種皮、種胚各10 g置于錐形瓶中，加入100 mL 體積分數為80%的甲醇，4 ℃密閉浸提，浸提24 h，每隔24 h過濾上清液，重復3次，混合所有濾液。將粗提液利用旋轉蒸發儀減壓濃縮，最終定容至100 mL。

1.5 冬瓜種子內源抑制物分離

采用系統溶劑法對“1.4”節提取的冬瓜種子種皮和種胚甲醇粗提液進行提取分離，粗提液分離為石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相5個組分。將分離后所得的冬瓜種子各部分的有機相溶液置于旋轉蒸發儀進行濃縮蒸發，最后將上述有機相溶液用蒸餾水定容至100 mL，置于4 ℃保存備用。

1.6 冬瓜種子分離相生物活性測定

以白菜種子為內源抑制物活性測定材料，其無休眠特性，易萌發。取“1.5”節提取的各有機相浸提液3 mL加入培養皿中進行生物活性測定，每皿50粒白菜種子，待有機溶液完全蒸發后（除水相外），再向培養皿加入3 mL蒸餾水，以蒸餾水作為對照，3次重復。將培養皿于恒溫培養箱中（設置條件：溫度25 ℃、相對濕度70％、12 h光照/12 h黑暗），于培養48 h后統計發芽率（以露出子葉為標準），72 h用直尺測量根長。

1.7 冬瓜種子分離相的GC-MS法鑒定

分別取冬瓜種子各有機相浸提液原液60 mL，濃縮蒸干，得到干物質，再用相應的有機溶劑溶解定容至2 mL，即得到濃縮樣品，樣品送至蘇州帕諾米克生物醫藥科技有限公司，鑒定條件：代謝物提取：移取樣本300 μL于2 mL EP管中，濃縮儀濃縮至盡干；在濃縮盡干的樣品中，加入80 μL甲氧胺吡啶溶液復溶，渦旋振蕩30 s，60 ℃孵育60 min；加100 μL BSTFA-TMCS衍生化試劑，渦旋振蕩30 s，70 ℃條件下孵育90 min，14 000 r/min 離心3 min，取上清液90～100 μL加入到檢測瓶中，并于24 h內完成上機檢測。氣質檢測：毛細管柱：DB-5MS；樣品分流比為1 ∶10；進樣口溫度：280 ℃；傳輸線和離子源溫度：320 ℃和230 ℃；升溫程序：50 ℃為初始溫度，持續0.5 min，以15 ℃/min 的速率上升到320 ℃，并在320 ℃停留9 min。

2 結果與分析

2.1 冬瓜種子形態指標

冬瓜為一年生草本植物，莖上有茸毛，葉片寬大。花期時，花軸開出8 cm左右黃色花朵，雌雄同株。果實大小因品種而異，從數斤到數十斤均有。果實肉質柔軟，味道清淡，可作蔬菜食用。果實成熟后，表皮變硬，具有極好的耐貯性。種子在果實中發育成熟，為黃色（圖1）。本試驗所用種子為有棱扁籽，呈水滴狀。冬瓜種子形態基本統一，長約1.15 cm，寬約0.69 cm，厚約0.23 cm。

2.2 種子休眠解除方法

根據筆者所在課題組前期研究發現，冬瓜種子屬于綜合性休眠，種皮機械束縛和內源抑制物是造成休眠的重要原因。對于種皮束縛引起的休眠，通過熱水處理可以軟化種皮，增強種皮透性并浸出部分種內萌發抑制物。內源抑制物是由植物種子生產的化學物質，它會阻礙種子的生理活動，通過GA3處理可以平衡種子的內源抑制物，刺激種子發育。通過休眠解除方法的試驗進一步驗證前期研究結果，為后續內源抑制物的研究提供理論依據。

2.2.1 熱水對種子萌發的影響 由表1可知，55 ℃ 和65 ℃處理的冬瓜種子發芽率顯著高于對照。55 ℃處理后，種子發芽率最高，達81.11％。之后依次為65 ℃處理和75 ℃處理，發芽率分別為80.00％和43.33％。

2.2.2 GA3處理對種子發芽的影響 由表2可知，冬瓜種子經不同濃度GA3和不同時間處理后，種子發芽率均有提升。種子經過250 mg/L GA3不同時間處理后，發芽率均達到70％以上。250 mg/L GA3處理種子20 min和60 min后，發芽率分別達到7111％和80.00％。當GA3濃度達到500 mg/L時，處理種子30 min和120 min后，發芽率較對照分別提高5002％和72.22％。1 000 mg/L GA3處理的種子發芽率隨浸種時間的增加整體呈升高趨勢，其中，1 000 mg/L GA3浸種120 min后發芽率最高，達9444％。

2.3 冬瓜種子不同分離相生物活性測定

2.3.1 各有機相對白菜種子萌發的影響 冬瓜種子的種皮和種胚各有機相對白菜種子萌發的影響結果如表3所示。種皮的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相、水相的浸提液分別使白菜種皮發芽率較對照降低3.29、36.63、98.85、26.63、13.29百分點，只有石油醚相浸提液處理與對照無顯著差異；種胚的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相、水相的浸提液使發芽率降低6.67、64.41、98.85、7577、7.60百分點，石油醚相浸提液處理、水相浸提液處理與對照相比差異不顯著，乙酸乙酯相浸提液處理的白菜種子發芽率為0。綜上，冬瓜種子的種皮浸提液各分離相的敏感性表現為乙酸乙酯相＞乙醚相＞甲醇相＞水相＞石油醚相，種胚浸提液各分離相的敏感性表現為乙酸乙酯相＞甲醇相＞乙醚相＞水相＞石油醚相。

2.3.2 各有機相對白菜生長的影響

2.3.2.1 各有機相對白菜根長的影響 由表4可知，各有機相對白菜根長抑制作用不同，冬瓜種子的種皮乙酸乙酯相浸提液對白菜根長抑制作用最強，達到100％。與對照相比，種皮的石油醚相、乙醚相、甲醇相、水相浸提液處理的白菜根長分別降低50.89％、55.38％、46.53％、33.06％。綜上，種皮浸提液各分離相的敏感性表現為乙酸乙酯相＞乙醚相＞石油醚相＞甲醇相＞水相。種胚同樣也是乙酸乙酯相浸提液處理的白菜根長抑制作用最為顯著，其次是甲醇相和石油醚相，白菜根長較對照分別降低62.29％、53.63％，而抑制作用最弱的是水相。對比相同分離相不同部位浸提液可以發現，除乙醚相外，其余各相的種胚浸提液抑制作用強于種皮浸提液。

2.3.2.2 各有機相對白菜苗的高影響 由表4可知，冬瓜不同部位有機相浸提液對白菜苗高生長作用效果不同。然而，各有機相浸提液較對照均有不同幅度的下降。冬瓜種子種皮的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相浸提液處理的白菜種子，它們的苗高較對照分別降低33.52％、4378％、100％、34.65％、27.83％，種皮浸提液各分離相的敏感性表現為乙酸乙酯相＞乙醚相＞甲醇相＞石油醚相＞水相。

對于冬瓜種子種胚的浸提液來說，乙酸乙酯相和甲醇相的浸提液顯著抑制白菜苗高生長，白菜苗高較對照分別降低100％和47.34％。與種皮對白菜苗高的影響相比，種胚對白菜苗高的抑制強度高于種皮，說明種胚中的物質可能對苗高具有更強的抑制效果。同時，種皮和種胚浸提液均為乙酸乙酯相抑制作用最強，說明可能含有更多的抑制物存在于乙酸乙酯相中。

在冬瓜種子的種皮和種胚浸提液中，抑制白菜發芽率、根長和苗高生長排名前3的有機相主要為乙酸乙酯相、乙醚相和甲醇相，說明這3個有機相中的抑制物對植物生長有較強的抑制作用，而抑制物種類和含量則需要進行進一步驗證。

2.4 冬瓜種子各分離相浸提液的GC-MS鑒定

2.4.1 種皮相關有機相代謝產物分析 表5為冬瓜種皮中各有機相提取物的檢測分析結果。冬瓜種子的種皮乙酸乙酯相抑制作用最強，利用GC-MS技術，對種皮乙酸乙酯相中的提取物進行檢測分析，相對含量較高的有機化合物有15種。冬瓜種皮乙酸乙酯相中鑒定的有機化合物種類主要有酮類物質1種，仲辛酮（1.15％）；有機酸類物質6種，包括棕櫚酸（12.83％）、十八烷酸（10.62％）、2-羥基丙酸（7.70％）、磷酸鹽（4.12％）、2-羥基戊酸（1.95％）、磷酸（1.29％）；醇類物質5種，包括2-羥基吡啶（13.69％）、1，3-丙二醇（6.88％）、丙三醇（4.12％）、正辛醇（1.60％）、麥芽糖醇（1.13％）；脂類物質1種，為單硬脂酸甘油酯（2.73％）；烷類物質2種，包括十三烷（1.78％）和二十二烷（121％），含量為總峰面積的72.81％。

按照相同的方法對剩下的不同有機相的提取物進行檢測分析。冬瓜種皮石油醚相中鑒定出的化合物以有機酸類化合物和醇類化合物為主，相對含量最高的6種物質為2-羥基吡啶、棕櫚酸、十八烷酸、2-羥基丙酸、磷酸鹽、丙三醇。

冬瓜種皮乙醚相中鑒定的有機化合物包含有機酸類物質7種、烷類物質5種、醇類物質5種、酮類物質1種、脂類物質1種，其中有機酸類物質為棕櫚酸、十八烷酸、2-羥基丙酸、磷酸鹽、2-羥基戊酸等，相對含量39.28％，而脂類物質含量僅占2％左右。

冬瓜種皮甲醇相鑒定出有機化合物22種，主要是有機酸類物質，包括棕櫚酸、十八烷酸、2-羥基丙酸等物質，相對含量合計20.67％。

2.4.2 種胚相關有機相代謝產物分析 表6為冬瓜種胚中各有機相提取物的檢測分析結果。冬瓜種子的種胚石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相和甲醇相鑒定出相對含量較高的有機物分別為20、21、16、24種。種胚石油醚相中鑒定的有機化合物相對含量較高的主要是有機酸類物質（36.91％）和醇類物質（24.46％）。其中，酮類物質2-羥基吡啶含量最高，占14.60％；其次是棕櫚酸、十八烷酸和2-羥基丙酸，分別占13.37％、11.28％、7.19％。

冬瓜種胚乙醚相中以有機酸類物質和醇類物質為主，有機酸類物質主要以棕櫚酸和十八烷酸為主，分別占12.74％、11.11％；醇類物質主要以2-羥基吡啶、1，3-丙二醇和丙三醇為主，分別占1086％、4.80％和4.32％。冬瓜種胚乙醚相中提取的有機物數量多于種皮。與其他有機相相比，乙醚相有機化合物種類有所不同，它對白菜種子發芽起到的抑制作用僅次于乙酸乙酯相。

冬瓜種胚乙酸乙酯相含量較高的為2-羥基吡啶（12.89％）、棕櫚酸（12.52％）、十八烷酸（1050％）、2-羥基丙酸（7.49％）、1，3-丙二醇（5.63％）、丙三醇（4.50％）、磷酸鹽（4.48％）等。冬瓜種胚乙酸乙酯相含有的有機化合物種類不多，但對種子萌發的抑制作用最強，說明影響種子發芽和植物幼苗生長的抑制物可能多存在于乙酸乙酯相中。

冬瓜種胚甲醇相測定出的抑制物種類略高于其他有機相，其有機化合物主要為有機酸類物質（24.98％），還包含糖類物質、醇類物質和酮類物質等。

3 討論與結論

根據筆者所在課題組前期研究發現，冬瓜種子屬于綜合性休眠，種皮機械束縛和內源抑制物是造成休眠的重要原因。本研究發現，分別用55 ℃和65 ℃熱水浸泡冬瓜種子30 min，可提高種子發芽率，這與昌正興等的研究結果［16］相似。施加GA3會改變種子內部物質平衡，從而促進種子萌發。本研究用250、500、1 000 mg/L GA3對冬瓜種子進行不同時間的處理后，種子發芽率顯著提高，其中 1 000 mg/L GA3浸種120 min后種子發芽率最高。

系統溶劑分離法是常用于內源抑制物研究的方法。鄒雨婷等采用該方法分離出綠山楂種子5個有機相并對其生物活性進行測定，發現乙醚相和甲醇相的抑制效果大于其他各有機相［20］。朱銘瑋等對丹鳳牡丹種皮和種胚的浸提液進行分離，發現種皮和種胚的乙醚相、甲醇相及種皮的乙酸乙酯相對白菜抑制效果最強［12］。楊治華等研究發現，內源抑制物是導致池杉種子休眠的主要原因，種皮的抑制物主要存在于石油醚相中［21］。本研究對冬瓜種子各部位甲醇粗提液進一步分離后得到石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相5個分離相，發現各有機相浸提液對白菜種子萌發和幼苗生長存在不同程度的抑制作用。綜合白菜發芽率和幼苗生長結果，認為種皮和種胚的乙酸乙酯相、甲醇相和乙醚相的浸提液存在顯著的抑制作用，種胚甲醇相和乙醚相浸提液的抑制效果強于種皮，且3種浸提液對白菜幼苗根長的抑制效應大于苗高，這與李櫻花等的研究結果［22-23］相似。

13世紀初，Albertus Magus發現種子延遲發芽與內源抑制物有關。此后，國內外學者對植物萌發抑制物展開了多方面的研究。Hoffmamn第1次從歐洲花楸果實中分離出有較強萌發抑制作用的花楸酸。王艷華在大山櫻的研究中發現，棕櫚酸、苯甲酸等是抑制種子休眠的重要物質［24］。王浩宇等在關于加拿大紫荊種子內源抑制物的研究中發現，鄰苯三酚可能是引起種子休眠的主要抑制物［25］。本研究在冬瓜種子的種皮、種胚分離出的不同有機相中分別發現34、39種有機化合物，包含有機酸類、醇類等較多種類的物質。在抑制作用較強的乙酸乙酯相、甲醇相和乙醚相中，有機酸類物質相對含量較高，而有機酸類也是已知的內源抑制物質。如韓寶瑞等對西洋參果肉中發芽抑制物的研究發現，乙酸等6種物質對白菜發芽具有抑制作用［26］。張艷杰在南方紅豆杉種子休眠機制的研究中發現，十八烷酸、庚酸等物質的抑制作用隨著濃度增大而增強［27］。

本研究表明，冬瓜種子具有內源抑制物，各部位的分離相對白菜種子萌發和幼苗生長均產生了抑制作用，其中乙酸乙酯相、甲醇相和乙醚相3個有機相的抑制作用較強。經GC-MS分析發現，冬瓜種子的種皮和種胚中存在不同種類的有機化合物，主要為有機酸類、醇類等物質。

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