基于代謝組學分析LED光質對山丹組培苗的生長代謝調控

摘要：以山丹（Lilium pumilum Redouté）組培苗為試驗材料，使用5種不同光質LED燈（R、B、R1B1、R1B2、R2B1）處理，以白熾燈為對照（CK），探究光質影響下山丹組培苗生長發育差異，并采用超高效液相色譜與質譜（UHPLC-MS/MS）聯用技術對其進行代謝組學分析，明確差異代謝物質種類含量和相關通路變化，為山丹組培產業化生產中的光質選擇提供重要的科學參考依據。結果表明，不同光質處理對山丹組培苗增殖及生長發育情況有顯著影響，其中以R1B2處理綜合指標較好，增殖系數為3.14、葉片為4.96張、葉片長度為1.81 cm、鱗莖直徑達0.37 cm，葉色嫩綠，葉片粗厚，并有少量粗壯根生成。基于UHPLC-MS/MS非靶向代謝組學，山丹組培苗正負離子模式下共鑒定出1 406種代謝物質；比較組間共33種差異代謝物，包括8種脂類及類脂分子、9種苯丙素和聚酮類化合物、2種有機酸及其衍生物等；KEGG富集分析，比較組間共顯著富集到類黃酮生物合成、新陳代謝途徑2條通路。本試驗闡明了光質不僅影響山丹組培苗的生長發育情況，還調控其代謝物的積累，其中R1B2處理下，山丹組培苗增殖效率更高、生長更為健壯；黃酮類物質為山丹組培苗光質脅迫下的主要差異代謝物，且R2B1處理下影響較為顯著。

關鍵詞：山丹；組培苗；光質；生長發育；代謝組學分析

中圖分類號：S682.2+65.01文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0150-10

山丹（Lilium pumilum Redouté），別稱細葉百合，為百合科百合屬多年生球根花卉，廣泛分布于我國秦嶺淮河以北地區［1］。山丹食用和藥用價值豐富，其不僅含有豐富的淀粉、蛋白質、脂肪和膳食纖維［2］，亦富含生物堿、多糖、甾體皂苷及多酚類等［3］多種對人體有益的活性成分，具有止咳祛痰［4］、抗炎抗氧化［5-6］、抗癌抗抑郁［7］等功效。

發光二極管（LED）較普通光源有著耗能低、光質光強可調節、使用壽命長等優點，能更好地調控植物生長［8］。光在植物高效再生體系構建過程中，主要影響植物形態結構建立［9-10］和代謝產物積累［11-12］等2個方面。通過LED光質處理，可以影響山丹組培苗內部代謝物質含量變化，獲取更多人體所需的代謝物質。

近年來，代謝組學技術在植物環境脅迫研究方面應用廣泛，其主要通過測定分析生物在特定環境刺激前后代謝物組分變化，進而表現出生物體系的整體代謝特征［13］。目前在組織培養中，光質調控在影響內源激素［14］、色素［15］、皂苷［16］、酚酸類物質［17］含量等方面均有研究，從代謝組學角度系統研究山丹組培苗代謝物差異的報道較少。

本研究利用不同光質調控山丹組培苗生長代謝發育，探究比較其增殖生長情況；運用UHPLC-MS/MS技術對其進行代謝組學分析，篩選光質影響下代謝物質與代謝途徑的差異，明確代謝物質含量和代謝的通路變化，為山丹組培產業化生產中光質的選擇提供充分的科學參考依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2022年10月，取內蒙古農業大學薩拉齊校區科技園區組培繁育實訓室內健壯無污染的山丹組培苗作為試驗材料。

1.2 培養條件及光質設計

將山丹組培苗切分成單株，葉片修剪至1 cm內，進行不定芽增殖生長培養，培養基配方選擇 MS+KT（激動素） 2.00 mg/L+2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸） 0.10 mg/L+IAA（吲哚-3-乙酸） 050 mg/L，試驗在內蒙古農業大學薩拉齊校區科技園區組培繁育實訓室內進行。

培養期間，以白熾燈為對照（CK），對山丹組培苗進行不同光質的LED燈照射，試驗共設計6個處理，每個處理3次重復。LED光質配比及主要參數如表1所示，控制各處理光通量密度保持一致，光照時間為15 h/d、培養溫度為（25±2） ℃。

1.3 不同光質對山丹組培苗生長發育的影響

培養30 d左右，觀察記錄組培苗的增殖生長情況，統計比較各處理增殖芽數及增殖系數；記錄其生根情況及葉片數量，并用螺旋測微尺測量其葉片長度、鱗莖直徑，并對其進行質量性狀描述。

1.4 代謝組學分析

培養40 d左右，將各處理樣品液氮冷凍后送至深圳微科盟科技集團有限公司進行UHPLC-MS/MS代謝組學分析，每個處理設置3個生物學重復。

1.4.1 代謝物提取

將冷凍干燥的樣品經液氮研磨成粉末，稱取100 mg置于EP管中，加入500 μL的80%甲醇水溶液；渦旋振蕩提取液后，將其靜置于冰浴中5 min，后在4 ℃離心機離心20 min，最高轉速為15 000 r/min；取一定量的上清液加質譜級水稀釋至甲醇含量為53%，置于4 ℃離心機離心 20 min，收集上清液，轉移進樣，進行LC-MS分析。

1.4.2 分析儀器條件

本試驗液質聯用系統由德國賽默飛Vanquish UHPLC超高效液相色譜儀和德國賽默飛Orbitrap Q ExactiveTM HF-X質譜儀組成。

色譜柱：Hypesil Gold column（100×2.1 mm，19 μm）；注溫：40 ℃；正模式流動相：A-0.1%甲酸、B-甲醇，負模式流動相：A-5 mmol/L醋酸銨（pH值9.0）、B-甲醇；流速：0.2 mL/min；色譜梯度洗脫程序如表2所示。

質譜離子源：ESI；樣本質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式；質荷比掃描范圍：100～1 500 m/z；噴霧電壓：3.5 kV；鞘氣流速：35 psi；輔助氣流速：10 L/min；離子傳輸管溫度：320 ℃；輔助氣加熱器溫度：350 ℃；極性：positive，negative；MS/MS二級掃描為數據依賴性掃描。

1.4.3 數據處理及代謝物鑒定

將下機的原始數據文件導入Compound Discoverer 3.1（CD3.1）搜庫軟件中進行處理。篩選保留時間、質荷比等簡單參數；設置保留時間偏差、質量偏差、信號強度偏差及信噪比等信息對樣品進行峰對齊、峰提取和峰面積定量。

整合目標離子，對分子離子峰和碎片離子進行分子式預測；通過比對高分辨二級譜圖數據庫mzCloud和mzVault以及MassList一級數據庫檢索（搜庫），得到各代謝物的鑒定結果。

用blank樣本去除背景離子，并對原始定量結果進行標準化處理，得到代謝物的相對定量結果，用于后續分析。

1.5 數據分析

將5種光質處理分別與對照組進行兩兩比較，分別記為R.VS.CK、B.VS.CK、R1B1.VS.CK、R1B2.VS.CK和R2B1.VS.CK。通過多元統計分析法初步分析比較組間代謝物表達差異；根據OPLS-DA模型，結合多種篩選條件，篩選出差異代謝物。根據KEGG數據庫對相應差異代謝物進行相關通路富集分析。

使用Excel 2021對相關數據進行整理；相關分析通過微科盟生科云（https：//www.bioincloud.tech）和Origin 2023軟件進行。

2 結果與分析

2.1 不同光質對山丹組培苗生長發育的影響

由圖1、表3可知，30 d時，不同光質處理下，山丹組培苗的增殖和生長情況有顯著差異。增殖方面，各處理增殖系數為R1B2＞CK＞R2B1＞R1B1＞R＞B；R1B2處理與CK、R1B1、R2B1差異不顯著，但較CK增加21.71%；R、B處理下的增殖系數較CK處理明顯降低。

在生長情況方面，不同指標在不同光質下表現有所差異。葉片數量上，R處理顯著多于B處理，為5.91個，且較CK增加19.88%；葉片長度上，B處理顯著長于R2B1處理，為2.10 cm，且較CK增加11.11%；葉片顏色和厚度上，CK處理葉色嫩綠且葉片粗厚，表現最好，相反R處理表現最差。各處理鱗莖長勢情況也不盡相同，R處理顯著優于CK、R1B1、R2B1處理，較CK增加20.00%，但與B、R1B2處理無顯著性差異。R2B1處理在根系生長方面表現最為突出，有大量粗壯根生成；B處理則無明顯根，反而產生大量愈傷組織。

2.2 不同光質處理山丹組培苗代謝組成分分析

在不同光質下的山丹組培苗中共鑒定出1 406個代謝物，其中正離子有914個，負離子有492個。所有代謝物共分成15類，包括315種脂質及類脂分子、158種苯丙烷和聚酮類化合物、142種有機酸及其衍生物、108種有機雜環化合物、91種有機氧化合物、83種苯環類化合物、52種核苷及核苷酸類似物、18種生物堿及其衍生物、18種木脂素及相關化合物、9種有機氮化合物、1種有機金屬化合物、1種均質非金屬化合物、1種有機硫化合物、1種混合金屬/非金屬化合物、1種烴類化合物、407種未分類物質。其中脂類及類脂分子數量最多，占比22.40%；苯丙烷和聚酮類化合物、有機酸及其衍生物次之，分別占11.24%、10.10%（圖2）。

2.3 多元統計分析

2.3.1 主成分分析

對不同處理下山丹組培苗代謝物進行主成分分析，所得PCA散點圖如圖3所示，CK、R1B1、R1B2處理組內樣本基本重合，R、B、R2B1處理組內樣本距離稍遠，但均集中在95%的置信區間中，說明各處理組內聚集較好，數據重復性高，可進行后續分析。5種光質處理均與CK處理界限明顯，表明光質處理對代謝物結構差異影響較大，其中R處理與CK處理在主成分1（29.3%）上分離最大，R1B1處理與CK處理在主成分2（189%）上分離最大。

2.3.2 正交偏最小二乘法判別分析

正交偏最小二乘法判別分析是一種有監督的判別分析統計法。OPLS-DA模型驗證發現，R.VS.CK比較組中"R2Y=1、Q2=0.99；B.VS.CK比較組中R2Y=1、Q2=0.97；R1B1.VS.CK比較組中R2Y=1、Q2=099；R1B2.VS.CK比較組中R2Y=1、Q2=0.99；R2B1.VS.CK比較組中R2Y=1、Q2=0.82。各比較組中R2Y、Q2這2個參數均接近于1，表明模型穩定可靠，預測有效。由圖4可知，CK和光質處理明顯分開且均勻分布于PC1左右兩側，說明山丹組培苗受到光質影響后，代謝產物存在顯著差異。

以Q2作為檢驗統計量，用置換的方法求得Q2的隨機分布，得到OPLS-DA模型置換檢驗結果（圖5），各比較組的實際觀測Q2值明顯大于隨機值，說明模型預測可信，有意義，比較組樣品間代謝物存在顯著差異，后續可根據VIP值來進行差異代謝物的篩選。

2.4 不同光質處理山丹組培苗差異代謝物篩選

由圖6火山圖可知，黃色區域為結合t檢驗（P＜0.05）和差異倍數（FC＞2.0或＜0.5）分析的全部差異代謝物，其中左側下調表達，右側上調表達。

在此基礎上，依據OPLS-DA 模型，以模型變量權重值（VIPgt;1）為標準進行差異代謝物的篩選。R.VS.CK共篩選出497種差異代謝物，且上調278種，下調219種；B.VS.CK共篩選出235種差異代謝物，且上調113種，下調122種；R1B1.VS.CK共篩選出538種差異代謝物，且上調277種，下調261種；R1B2.VS.CK共篩選出481種差異代謝物，且上調256種，下調225種；R2B1.VS.CK共篩選出254種差異代謝物，且上調102種，下調152種。

2.5 不同光質處理山丹組培苗差異代謝物分析

根據韋恩圖（圖7）分析，R.VS.CK、B.VS.CK、R1B1.VS.CK、R1B2.VS.CK 和 R2B1.VS.CK間存在33種共有差異代謝物，包括 8種脂類及類脂分子、9種苯丙烷和聚酮類化合物、2種有機酸及其衍生物、1種有機雜環化合物、2種苯環類化合物、5種有機氧化合物、1種木脂素及相關化合物、1種有機氮化合物和4種未分類化合物（表4）。

由組間共有差異代謝物熱圖（圖8）可知，細葉遠志苷 A等18種代謝物受光質影響呈現下調趨勢；兒茶素等15種代謝物則在光質調控下表現出上調趨勢。

2.6 不同光質處理山丹組培苗代謝通路分析

對于分組間的差異代謝物（t檢驗，P＜0.05），基于KEGG數據庫進行代謝通路富集分析，其中代謝通路的 ORA，P＜0.05，則差異代謝物顯著富集。

由圖9可知，R與CK處理組間差異代謝物富集到了83條代謝通路，有18條顯著富集；其中核苷酸代謝、氨基酸的生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成3條最為顯著，分別參與了6、8、4種差異代謝物。B.VS.CK差異代謝物富集到了49條代謝通路，有11條顯著富集；其中β-丙氨酸代謝、嘧啶代謝、黃酮和黃酮醇生物合成3條最為顯著，分別參與了3、4、3種差異代謝物。R1B1.VS.CK 差異代謝物富集到了110條代謝通路，有39條顯著富集；其中代謝途徑、氨基酸生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成3條最為顯著，分別參與了96、15、6種差異代謝物。R1B2.VS.CK差異代謝物富集到了108條代謝通路，有26條顯著富集；其中氨基酸的生物合成、代謝途徑、苯丙素生物合成3條最為顯著，分別參與了13、84、8種差異代謝物。R2B1.VS.CK差異代謝物富集到了38條代謝通路，有9條顯著富集。其中不飽和脂肪酸的生物合成、壁酸生物合成、類黃酮生物合成3條最為顯著，分別參與了3、3、3種差異代謝物。

通過分析，5個比較組共有類黃酮生物合成、新陳代謝途徑2條顯著富集通路，其中槲皮素、兒茶素等11種差異代謝物（P＜0.05）顯著富集到了類黃酮生物合成通路中，且R2B1處理下整體差異更大。結果表明，光質處理影響山丹組培苗代謝產物的積累，以黃酮類化合物為主。

3 討論

光質在組織培養中具有重要的調控作用，相關研究發現，在植物生長發育階段，相較于紅光、藍光，紅藍復合光更能促進植物生長及形態建立［18］。

本試驗結果發現，單色光處理抑制山丹組培苗增殖情況，紅藍復合光處理則明顯促進其增殖，與楊曉芬等的結論［19］不同，推測原因是品種不同導致對光質敏感度不同。生長發育方面，紅色光質更能促進葉片數增加，藍色光質則能提高組培苗葉片生長，整體而言藍色光質處理組培苗生長效果最好，R1B2處理次之，結果與王玉英等的研究［20］一致。單色光質處理有利于山丹組培苗形成愈傷組織，紅藍復合光質處理則利于山丹組培苗生根壯根。B處理下組培苗形成愈傷組織量優于其他處理，與任躍英等對人參愈傷組織的研究結果［16］一致。R2B1處理下組培苗生根情況優于其他處理，與廖多思等探究黃杯杜鵑生根情況的結論［21］一致。

光質作為影響植物生長發育的重要環境因素，不單單表現在影響植物外部形態方面，更重要表現在調控內部代謝物質的積累。非靶向代謝組學技術可以較系統地檢測出樣本中所有能檢測到的代謝物分子，進而通過生物信息學分析，尋找環境脅迫[CM（21]下植物體特異表達代謝物。田凱莉基于多種代謝組學手段，分析發現藍色光質處理更有利于鐵皮石斛組培苗初級代謝產物（糖類、脂類、有機酸等）的積累，而 R2B1 光質配比處理則對次級代謝產物（酚類物質為主）含量有顯著促進作用［22］。李琪通過代謝組學分析LED光質對金線蘭組培苗代謝物的影響，發現各處理間相對含量變化明顯的物質主要包括氨基酸類、有機酸類、酚類等次生代謝物，紅藍復合光更利于代謝物積累，其中R1B1組最佳［23］。本研究發現復合光質處理下差異代謝物數更多、含量更高，和前者試驗結果一致。

黃酮類化合物具有抗炎抗癌、抗氧化等功效，百合屬植物中含量豐富。焦灝琳等對卷丹鱗莖進行酚類物質鑒定，發現表兒茶素、蕓香苷和二氫槲皮素為主要成分［24］；靳磊等比較分析岷江百合與蘭州百合酚類物質組成，分析兒茶素、蕓香苷等在岷江百合中占比較大，蘭州百合中則沒食子酸含量相對較高，山丹組培苗中山柰酚、槲皮素等含量占比較大［25］。王珺儒等對苦蕎芽在不同光質下的黃酮含量進行測定，發現蕓香苷、槲皮苷、槲皮素在藍光處理下含量較高［26］。郭佩瑤等以紅花檵木愈傷組織為材料，發現藍光更有利于黃酮總含量的增加［27］。本試驗通過光質處理發現，大部分黃酮類物質較白熾燈處理呈現出明顯上調趨勢，且顯著影響黃酮類合成途徑，以R2B1處理最佳。

綜上所述，光質調控山丹組培苗生長發育過程中，R1B2處理下，增殖系數最大，為3.14；R處理下，葉片數量最多，為5.91張；B處理下，葉片平均長度最大，為2.10 cm；鱗莖則無明顯差異；R2B1處理下，組培苗生根情況最好。R1B2處理綜合指標較好，增殖系數為3.14、葉片為4.96張、葉片長度為 1.81 cm、鱗莖直徑達0.37 cm，葉色嫩綠，葉片粗厚，并有少量粗壯根生成。本試驗利用非靶向代謝組學技術，對不同光質處理下山丹組培苗中的代謝產物進行差異變化分析，共鑒定出1 406種代謝物；其中山柰酚等33種為不同光質處理下山丹組培苗中穩定表達且有顯著差異的代謝物質；差異代謝物則顯著富集到類黃酮生物合成、新陳代謝途徑2條代謝通路，以R2B1處理差異表達更顯著。研究表明，R2B1光質處理會對山丹組培苗次生代謝產物（黃酮類物質為主）積累影響更顯著，可為后續山丹工廠化生產提供理論基礎。

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