基于轉錄組學的牦牛不同部位嫩度差異研究

摘要：為比較牦牛肉不同部位嫩度的差異，以及研究嫩度涉及的基因和途徑的運輸與合成之間的平衡，以牦牛外脊肉（WJR）、肩肉（JR）、黃瓜條（HGT）3個部位為模型，利用Illumina Hiseq 4000高通量轉錄組測序技術，分析3個部位中的共同高表達基因及顯著差異基因。結果顯示，JR/HGT/WJR中共同高表達基因為131個，JR/HGT、WJR/HGT和WJR/JR等3組中差異表達基因分別為607、713、295個。通過對3個部位的共同高表達基因聚類分析，初步篩選出11種與嫩度相關候選的基因：肌球蛋白輕鏈（MYL1、MYL2），肌凝蛋白家族（TPM1、TPM2），編碼橫紋肌凝蛋白輕鏈亞基（MYLPF），肌球蛋白重鏈（MYH1、MYH2、MYH7），肌球蛋白結合蛋白（MYBPC2）、肌結蛋白（MYOT），Cal-sarcin-2基因（MYOZ1）。通過對3個部位差異基因的生物信息學分析，發現 6 種與嫩度相關的基因：肌凝蛋白β基因（TPM2）、肌凝蛋白γ基因（TPM3），肌球蛋白輕鏈2（MYL2），肌球蛋白輕鏈激酶（MYLK3、MYLK4），肌球蛋白重鏈（MYH6）。最終從3個不同部位中共挖掘出15 種影響嫩度的候選基因，這些基因主要通過氧化磷酸化、MAPK信號通路和氮代謝等途徑調控嫩度。

關鍵詞：青海牦牛；轉錄組學；不同部位；嫩度品質；生物信息學分析

中圖分類號：S823.8+51文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0172-08

牦牛主要分布在我國海拔3 000～5 000 m的青藏高原上［1］，因其高蛋白、低脂肪而長期受到消費者的喜愛。然而，牦牛的肉卻不如安格斯牛、赫里福德牛、夏洛萊牛、西門塔爾牛和和牛嫩［2-3］，牦牛品質的提高受到肌纖維粗、嫩度差等問題的限制［4-5］。

影響牛肉嫩度的主要因素有3個。首先，肌肉中肌纖維的類型和比例可顯著影響肌肉嫩度，嫩度與肌肉中快速氧化糖酵解纖維的比例呈負相關［6］；其次，與葡萄糖代謝途徑和肌內的脂肪酸合成有關，直接影響肌肉嫩度［7］；最后，無氧糖酵解和產生相關的乳酸可改變屠宰后的肌肉張力和體積變化，從而影響其嫩度［8］。骨骼肌的基本成分是肌纖維，它會直接影響骨骼肌的質量［9］，動物出生后骨骼肌肌纖維數量基本不變，但肌纖維類型在生長過程中可發生轉化，受物種、遺傳、環境等因素的影響。目前，人們認為肌肉纖維的有限降解是影響肉嫩度的主要原因［10］。骨骼肌是由多種功能性肌纖維組成的、復雜而多功能的組織，肌肉的整體特征在很大程度上是由其不同肌纖維類型及其比例的個體特征組成的。骨骼肌纖維類型可用各種參數來描述，如肌球蛋白亞型、代謝酶特性、結構和收縮特性，它們不是固定的單位，而能夠根據功能需求和各種信號的變化而改變其表型。以牦牛為例，生牛肉由粗纖維組成［11］，成熟過程中的嫩度變化一般與死后早期肌肉代謝和肌原纖維蛋白降解有關。目前，關于影響牛肉成熟和嫩度的研究多集中在背最長肌、腰肌大肌、半腱肌等部位，對其他部位的研究鮮少。因此，有必要從其他部位取外脊肉（WJR）、肩肉（JR）、黃瓜條（HGT）來研究牦牛肉嫩度的差異，探討形成差異的機制。

本研究通過高通量轉錄組測序分析青海牦牛WJR、HGT和JR等3個部位嫩度的差異，并通過共同高表達基因的聚類分析和差異基因的GO功能注釋及KEGG通路分析，研究嫩度涉及的基因和途徑的運輸與合成之間的平衡，為改善牦牛肉嫩度提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

選取青海省環湖牦牛（36±2） 月齡的健康放牧公牛9頭，活體重（248.6±16.7）kg/頭。以清真屠宰后放血處理開始計時，宰后1 h內取肩肉（前肩胛部，前腿上部；用JR表示）、外脊肉（第12～13肋至最后腰椎處；采用WJR表示）、黃瓜條（股骨后部，坐骨外側；采用HGT表示）各200 g，置于-80 ℃液氮儲存，帶回實驗室測定。本試驗于2022年12月至2023年2月在青海省畜牧獸醫科學院高原特色動物產品加工實驗室進行。

1.2 儀器與設備

設備：CT-3質構儀，美國博勒飛；Thermo Fisher冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司；UV 1900紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；Agilent 2100生物分析儀，德國安捷倫；Sonics超聲破碎儀，美國SONICS公司；Themomixer熱混合儀，德國艾本股份公司；Bio-rad PCR儀，美國BIO-RAD；3100 ABI基因測序儀，美國；Illumina Hi Seq 2000測序系統；Bio-rad凝膠成像儀，美國BIO-RAD。

試劑：RNA 提取試劑盒；RNA 純化試劑盒；DNALadderMark（100 bp）；RNAse-free；aPCR 試劑盒；RNA-seq試劑盒；其他試劑等。

1.3 試驗方法

1.3.1 蒸煮損失的測定 參考Zhang等的方法［11］，并稍作修改。取牦牛肉樣稱重（ma），采用蒸煮袋密封，在80 ℃水浴中蒸煮，當中心溫度達到 70 ℃ 后，解袋，擦拭表面水，冷卻后測重（mb），重復3次。蒸煮損失計算如下：

式中：ma為蒸煮前牦牛肉樣品重；mb為蒸煮后牦牛肉樣品重。

1.3.2 剪切力的測定 參考Zhang等的方法［11-12］，蒸煮條件與“1.3.1”節相同。將蒸煮后冷卻的樣品沿肌肉纖維切成20 mm×10 mm×10 mm的肉柱，采用CT3質構分析儀TA-SBA燕尾剪切探頭測定剪切力，重復3次。

1.3.3 TPA分析 參考Zhang等的方法［11-12］，蒸煮條件與“1.3.1”節相同，將蒸煮后的冷卻樣品修剪至20 mm×10 mm×10 mm的長方體，使用CT3質構分析儀的P50探頭，測量前速度2.0 mm/s，測量時1.0 mm/s，測量后10.0 mm/s。壓縮比為50%，2次按壓間隔為5 s。測定樣品的硬度、彈性和咀嚼性，重復3次。

1.4 總RNA提取及轉錄組測序的文庫構建

轉錄組測序文庫構建均參考Yu等的方法［13］，采用總RNA提取試劑盒按照提取方法說明從牦牛肉不同部位中提取RNA，并采用瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis）分析不同部位牦牛肉RNA完整性和是否存在DNA污染；采用Nano Photometer spectrophotometer方法檢測；采用總RNA提取試劑盒提取的RNA純度是否合格（D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm）；采用Agilent 2100 Bioanalyzer方法檢測其完整性。

1.5 數據分析

采用SPSS 22.0比較重復測定3次的牦牛肉不同部位的剪切力、TPA值和蒸煮損失的差異。采用LSD法檢驗顯著性，數據以“平均值±標準差”表示。對牦牛肉不同部位樣本比較組合間的差異表達基因的分析使用DESeq2軟件，為了調整P值和控制精度，使用Benjamini和Hochberg法。采用校正后的Plt;0.05和| log2Fold Change |gt;1.0作為顯著差異表達的閾值。利用聚類分析器軟件進行GO差異表達基因功能富集分析（http：//www.geneontology.org），以及差異表達基因在KEGG通路分析通路（http：//www.genome.jp/kegg/）中的功能，得到基因注釋列表。

2 結果與分析

2.1 牦牛肉不同部位的嫩度分析

剪切力和蒸煮損失可反映牦牛肉的嫩度、保水性等特征，是分析和評價牦牛肉品質的重要指標［14］。研究表明，肌纖維的直徑與肌肉的硬度、咀嚼性和剪切力呈正相關［15］。由表1可知牦牛肉嫩度品質的差異。在蒸煮損失方面，JR顯著高于WJR和HGT（Plt;0.05），HGT顯著低于WJR和JR（Plt;0.05），但HGT的剪切力、硬度和彈性高于WJR。JR的剪切力和彈性顯著低于WJR和HGT（Plt;005），但咀嚼性顯著高于WJR和HGT（Plt;0.05）；HGT的蒸煮損失明顯低于WJR和JR（Plt;0.05），但剪切力、硬度和彈性均高于WJR和JR。 以上結果表明，JR嫩度優于WJR和HGT，其中HGT的嫩度最較差。

2.2 共同高表達基因

為深入研究牦牛肉不同部位嫩度差異中基因的特定表達，在每個樣本比較組的高表達含量前150個基因中篩選出131個共同基因，采用層次聚類對131個共同高表達基因的FPKM值進行層次聚類分析。由圖1可知，3個部位之間的共同高表達基因存在明顯不同，其中JR和WJR的差異最大。在熱圖中，不同的顏色代表不同的表達水平。紅色代表較高的表達，綠色代表較低的表達。通過3個部位的共同高表達基因，初步篩選出與嫩度相關的共同高表達基因：肌球蛋白輕鏈（MYL1、MYL2）、肌凝蛋白家族（TPM1、TPM2），編碼橫紋肌凝蛋白輕鏈亞基（MYLPF）、肌球蛋白重鏈（MYH1、MYH2、MYH7）、肌球蛋白結合蛋白（MYBPC2）、肌結蛋白（MYOT）、Cal-sarcin-2基因（MYOZ1）。

2.3 差異基因的分析

2.3.1 差異基因 利用DESeq2軟件對牦牛肉不同部位樣品間比較組間的差異表達基因進行分析，利用Benjamini和Hochberg方法調整P值，控制準確率。對比較組間的差異表達分析采用edgeR軟件包進行分析，采用Benjamini和Hochberg方法調整P值，控制準確率。校正后的P值（Padj）lt;0.05和 |log2Fold Change|gt;1.0作為顯著差異表達的閾值，具體結果見表2。

在3個牦牛肉不同部位中共檢測到差異基因1 261個（含16個共有差異基因）。由表3可知，WJR和JR相比共檢測到差異基因295個，其上調、下調差異基因分別為132、163個；WJR和HGT相比共檢測到差異基因713個，其上調、下調差異基因分別為445、268個；JR和HGT相比共檢測到差異基因607個，其上調、下調差異基因分別為419、188個。

2.3.2 差異基因的生物信息學分析 為了確定差異基因的功能，對上述差異基因根據細胞成分、分子功能和生物學過程進行GO功能注釋分類，以矯正P值（Padj值）作為顯著性富集的閥門。由圖2可知，牦牛肉不同部位的差異表達基因的生物學功能不同，不同生物學功能所包含的差異表達基因數量和表達方式也不同。由圖2-a可知，在JR/HGT比較組差異基因主要GO條目有28種，其中，GO功能富集的差異基因多數為上調基因，重要的差異功能有離子轉運、細胞質部分、胞內非膜結合的細胞器和非膜有界細胞器。由圖2-b可知，在WJR/HGT比較組差異基因主要GO條目有29種，其中，GO功能富集的差異基因上調基因居多，重要的GO功能有細胞骨架、胞外區和核。由圖2-c可知，在WJR/HGT比較組差異基因主要GO條目有30種，其中，GO功能富集的差異基因上調基因居多，重要的GO功能有胞外區、核、生長因子活性、金屬羧肽酶活性和受體結合。以上分析表明，牦牛肉不同部位的生物學功能有一定差異，對牦牛肉品質有不同的影響。因此，不同部位嫩度的差異可能是由于差異基因信號轉導的生物學功能和轉錄調控基因的表達發生了變化。

KEGG通路富集采用Padj低于0.05為顯著性富集閾值，選擇最顯著的20個KEGG通路繪制散點圖，若lt;20個則繪制出全部通路。牦牛肉不同部位差異表達基因KEGG通路分析，由圖3可知，不同牦牛肉部位中差異表達基因的KEGG通路差異較大，在JR/HGT比較組中KEGG富集主要的代謝通路中具有顯著差異的有8 個，在WJR/HGT比較組中KEGG富集的通路均不顯著，差異也較小，在WJR/JR比較組中KEGG富集的通路差異均不顯著，但差異較大。由圖3-a可知，氧化磷酸化、帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、熱生成、非乙醇性脂肪肝疾病（NAFLD）、逆行內源性大麻素信號傳導和心肌收縮通路是造成JR和HGT品質差異的主要通路，其中氧化磷酸化和熱生成對JR和HGT品質的影響最大。由圖3-b可知，富集差異表達基因較多的重要通路有心肌細胞中的腎上腺素能信號通路、癌癥中的蛋白多糖、細胞因子與細胞因子受體的相互作用和MAPK信號通路，其中MAPK信號通路對WJR和HGT品質的影響較大。由圖3-c可知，細胞因子與細胞因子受體的相互作用、氮代謝和氧化磷酸化造成WJR和JR品質的影響較大。綜上表明，牦牛肉不同部位的差異表達基因的代謝通路不同，這種代謝通路可能是造成差異表達基因生物學功能不同和肉品質不同的重要因素，其中熱生成、氧化磷酸化、MAPK信號通路、細胞因子與細胞因子受體的相互作用和氮代謝對不同部位肉品質的影響較大。

在所有比較中，本試驗選取3個比較組中影響較大的KEGG通路，將重點放在如圖3所示的KEGG通路途徑，以進行下一步研究，結果發現了6 個與嫩度相關的差異基因，即肌凝蛋白家族TPM2（β基因）、TPM3（γ基因），肌球蛋白輕鏈2（MYL2），肌球蛋白輕鏈激酶（MYLK3、MYLK4），肌球蛋白重鏈（MYH6）。通過共同高表達基因聚類分析以及差異基因的生物信息學分析發現，TPM2與MYL2重復出現。

2.4 RT-qPCR定量驗證

為了驗證RNA-Seq數據的可靠性，隨機選擇4個DEGs進行RT-qPCR進行表達檢測，包括2個上調基因和2個下調基因。由圖4可知，RT-qPCR的結果與RNA-Seq數據的結果一致，WJR中HOXC8和LOC112446667的表達水平高于JR和HGT，JR中BARX2、HOXA13和HOXA11的表達水平高于WJR和HGT，HGT中LOC112441511的表達水平高于WJR和JR。這些結果證實了RNA-Seq結果的可靠性和重復性。

3 討論

通過嫩度品質差異比較發現JR嫩度最好，WJR次之，HGT最差，這與劉艷霞研究的牦牛不同部位制作肉干所得出的HGT剪切力大于JR一致［16］，也與牛蕾研究不同部位黃牛肉干時得出的剪切力結果（前肢lt;后肢）［17］一致。MYHC的亞型基因MYH1、MYH2、MYH7主要決定肌原纖維的ATP酶活性，因此肌纖維的類型與MYHC亞型有關［18］。成年家畜的骨骼肌纖維根據不同的結構、收縮、代謝和形態特征可分為Ⅰ型、ⅡA型、ⅡB型和ⅡX型等4種類型，它們分別對應MYH7、MYH2、MYH1和MYH4等4個基因編碼，其收縮速率呈現逐漸增大的趨勢［19］。MYLPF為快肌纖維的標記基因，劉瑞莉等研究證實了MYLPF是骨骼肌中的高表達基因，可能參與骨骼肌的生長發育及其他調節，是影響肉品質的候選基因［20］。TPM1、TPM2在與肌鈣蛋白復合物的結合中及在脊椎動物橫紋肌收縮的鈣依賴性調節中起關鍵作用，這與Yu等的研究結果［21］一致。肌球蛋白輕鏈（MYL）是肌小節粗肌絲的組成成分，起著維持機體不同狀態發育的肌球蛋白重鏈構想的重要作用。葉幼榮等的研究證實了MYL1與肌球蛋白重鏈的相關性均在0.970以上［22］。推測MYL1是調節肌纖維類型的重要基因。MYBPC2是與肌肉收縮相關的關鍵因子，Chang等通過研究發現MYBPC2在肌肉生長起著重要作用［23］。由此推測MYBPC2通過對肌肉生長及收縮的調控，進而影響嫩度。MYOT是參與肌肉發育的多功能基因，Adoligbe克隆了牛的MYOT基因，揭示了該基因在骨骼肌中的高表達，發現下調的MYOT顯著抑制Ⅰ型（慢速氧化型）和ⅡA型（快速氧化型）肌纖維的表達，使ⅡX型（快氧化型）肌纖維的表達增加，表明MYOT基因可能影響肌肉纖維的特性［24］。MYOZ1在肌纖維類型分化中具有不可替代的作用，通過抑制鈣調神經磷酸酶的活性，而作用于活化T細胞核因子（CaN-NFAT）信號傳導通路，從而促進快肌纖維向慢肌纖維轉化［25］。MYL2是一種屬于肌球蛋白輕鏈家族的一種調節輕鏈，在調節肌纖維活性、肌纖維類型和肌纖維生長中起著重要作用［26］。TPM主要調節ATP 酶的活性，參與肌肉收縮的調節，穩定肌細胞的骨骼結構［18］。與HGT和JR相比，MYL2、TPM3和TPM2在WJR中表達上調，這與劉吉娟等的研究結果［27］一致。MYLK及其家族成員不僅是肌肉收縮所必需的，而且可以影響細胞骨架，從而調節細胞運動性、分泌、上皮通透性和血小板形狀改變，或促進軸突生長錐伸長和細胞纖維張力發生凋亡，從而影響胞質分裂和細胞修復［28］。與WJR相比，MYLK4在HGT和JR中表達下調；與JR和HGT相比，MYLK3在WJR中表達下調。肌球蛋白重鏈（MyHC）是含量最豐富的肌肉結構蛋白，約占蛋白的35%［29］。與WJR相比，MYH2在JR中表達下調，依據JR的嫩度優于WJR，可以推斷MYLK4和MYH2對調控嫩度具有促進作用，這與Sakakibara等的研究結果［30］一致。WJR與HGT相比，MYLK4在HGT中表達下調，這與Yu研究的晉江牛早期死后肌肉特異性分子差異的結果［21］一致。與HGT相比，TPM2和MYH2在JR中表達上調，JR的嫩度也優于HGT，由此可以推斷上述基因對調控嫩度也具有促進作用。根據上述纖維類型可知，JR的纖維類型為Ⅱa。以上15 種與嫩度相關的候選基因中僅有MYLK4是在WJR、JR和HGT中存在顯著差異的基因（Plt;0.05），而CAPN1、MYL6B等與嫩度相關的基因并未在本研究結果中出現，這與CAPN1、MYL6B是影響嫩度的主要基因的說法不一致。可見，嫩度的差異可能是由不同的品種、年齡、性別、屠宰方式和飼養條件等造成的，未表達的這些基因可能在年齡、性別和品種上差異更顯著，但在WJR、JR和HGT等3個部位的表達差異并不顯著。以上15種與嫩度相關的候選基因的分子機制及作用機制尚不清楚，需要進一步研究，分析其對嫩度的具體調控。

4 結論

通過高通量轉錄組學測序，首先對共同高表達基因進行聚類分析，鑒定出高表達量的共同基因11 種；再對差異基因進行生物信息學分析，發現6 種與嫩度相關的候選基因，TPM2和MYL2重復出現，共計發現15 種與嫩度相關的候選基因：TPM1、TPM2、TPM3、MYL1、MYL2、MYH1、MYH2、MYH6、MYH7、MYLK3、MYLK4、MYLPF、MYOZ1、MYBPC2、MYO4T1，其中MYLK4表達出很高的轉錄水平。這些基因主要通過熱生成、氧化磷酸化、MAPK信號通路、細胞因子與細胞因子受體的相互作用和氮代謝的途徑調控嫩度。本試驗為改善牦牛肉嫩度提供理論依據，其具體的調控機制還需進一步探究。

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