對萼獼猴桃多樣性分析及其性別鑒定

摘" " "要：【目的】對萼獼猴桃是一種新型耐澇營養系砧木，生產中發現雄株作為砧木效果更好，其種質多樣性分析可為選育雄性耐澇對萼獼猴桃砧木提供參考。【方法】以62份對萼獼猴桃種質為材料，根據表型性狀及7個簡單重復序列標記（SSR）基因型進行多樣性分析；同時使用性別相關分子標記進行性別鑒定，并觀察其中開花的34份對萼獼猴桃的花朵形態以驗證標記鑒定結果。【結果】所用62份對萼獼猴桃種質在7個SSR標記位點上共擴增出69個等位基因，平均等位基因數為9.86，有效等位基因數為2～18，平均多態性信息含量（PIC）為0.626，平均觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）值分別為0.994和0.686。性別相關標記共鑒定出雌株18份，雄株43份；根據34份單株的花器官形態鑒定，發現有13份雌株和21份雄株（標記鑒定結果為9份雌株和25份雄株），標記與表型鑒定的一致性為79.14%。【結論】62份對萼獼猴桃種質多樣性豐富，結合植株表型性狀和DNA標記基因型可有效地鑒定對萼獼猴桃種質，可為進一步選育優良對萼獼猴桃雄性營養系砧木提供工具和材料。

關鍵詞：對萼獼猴桃；SSR；毛細管電泳；聚類分析；性別鑒定

中圖分類號：S663.4 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）11-2182-13

Study on diversity and sex determination of Actinidia valvata

MO Sha， SHI Shenshen， TIAN Jie， ZHU Jiahui， WANG Rencai*， LUO Feixiong*

（College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： 【Objective】 Actinidia species are native to China， which provide rich germplasm resources for rootstock breeding. Kiwifruit is one of the most successful wild fruit trees domesticated in the 20th century and is increasingly popular among consumers because of its unique taste and high vitamin content. Grafting is an asexual plant propagation technique that combines desired traits from both rootstock and scion. This technique has been used extensively in fruit crops. The current kiwifruit industry relies on a few rootstock cultivars from seedlings of Actinidia chinensis and A. deliciosa. The rootstocks selected from A. valvata are much more tolerant to waterlogging stress than those from A. deliciosa， and are commonly used in kiwifruit production. However， supposed consistent clonal rootstocks of A. valvata accessions are mixed and their genetic backgrounds are various. The genetic diversity analysis of plant germplasm resources could lay a solid foundation for kiwifruit breeding and utilization. To clarify the relationship among different A. valvata accessions， the diversity of 62 A. valvata accessions was analyzed using seven microsatellite DNA markers and 36 phenotypic traits. The plant sex determination for cultivars and accessions within species is the first step towards the correct classification of kiwifruit germplasm. The present study used sex-related DNA markers to identify plant gender at its juvenile stage and these plants could be maintained as male and female plant populations separately. The performance of male individuals of A. valvata rootstock is found better than the female ones in kiwifruit production. The aim of this study was to identify plant genders of these 62 accessions with sex-related DNA markers for better utilization of the male A. valvata germplasm. 【Methods】 The sixty-two A. valvata accessions were used as materials. The diversity of these studied accessions was evaluated based on their phenotypic characters and genotypes of seven Simple Repeat Sequence （SSR）. The sex-related DNA markers were used to identify plant gender， and 34 flower-related attributes were evaluated to verify genotyping results. 【Results】 Among all the 36 phenotypic traits， except for the lenticel color （grayish white）， leaf texture （membranous）， leaf tip shape （caudiform）， flatness of leaf surface blade （green）， flatness of leaf pubescence （none）， petal shape （ovate）， the main color of the interior of the petal （white）， clutch condition base of the petal （reunion）， calyx color （green）， female style posture （oblique growth）， style color （ivory）， female ovary shape （bottle）， male filament color （white）， anther shape （oblong）， anther color （yellow）， petal color gradient（none）， the remaining 20 traits showed different degrees of phenotypic variation， of them 16 traits were descriptive traits and 10 traits were quantitative traits. There were 25 various types for 10 descriptive traits， according to the characteristics of shoots and leaves， these 62 accessions could be clustered into five groups. The first group had the most diverse twig and leaf traits， and the petioles were mostly purple red. The second group only had one individual--A11 and its internode length and annual branch thickness were lower than the average of all individuals. The internode length of the annual branches of the individuals in third group was higher than the average of the all samples， and the thickness of the annual branches was lower than the average of the all samples and the leaf shape was oval. The leaf length of the fourth group was higher than the average of the all samples. The fifth group only had two individuals， A43 and A27. The internode length of the annual branches in this group was the largest among the all samples， and the thickness of the annual branches was higher than the average of the all samples. The color of the annual branches was grayish brown， the pores were all elliptical， the leaf shape was oval， the leaf edge was all wavy， the leaf base was all circular， the petiole length was lower than the average of the all samples， the petiole color was all greenish yellow， and the leaf length was higher than the average of the all samples. The used seven SSR markers amplified a total of 69 alleles， with an average number of alleles 9.86 on each marker locus， the effective alleles were 2-18， the average polymorphism information content （PIC） was 0.626， and the average observed heterozygosity （Ho） and expected heterozygosity （He） values was 0.994 and 0.686， respectively. According to the SSR marker polymorphism， the 62 individuals could be clustered into four groups. The gender-related markers had identified 18 female plants and 43 male plants; the 34 individuals of flowering had been identified， 13 individuals were female plants and 21 individuals were male plants， while result of the gender-related marker identification showed that there were 9 female individuals and 25 male ones. The consistency between the morphological sex determination and the sex-related DNA marker identification was 79.14%. 【Conclusion】 A total of 62 accessions of A. valvata showed abundant phenotypic diversity， especially for twig and leaf traits. Combined with plant phenotypic characters and DNA marker genotypes could effectively characterize the A. valvata germplasm， which could provide tools and materials for further breeding clonal male A. valvata rootstock.

Key words： Actinidia valvata; Simple sequence repeat; Capillary electrophoresis; Cluster analysis; Sex determination

獼猴桃為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）果樹，起源于中國，因其果實營養價值高和口感豐富而深受消費者喜愛[1]，該屬共有54個種，21個變種，共約75個分類單元[2]，獼猴桃的馴化栽培歷史僅百余年，是近代由野生到商品化栽培最成功的植物馴化案例[3]。獼猴桃的繁育主要通過嫁接繁育、扦插繁育和組織培養等方式，其中嫁接繁育是獼猴桃商品生產、保持品種一致性的最主要和最常規的方式，選擇品種特性不同且親和的砧木不僅可以利用砧木的優勢，調節接穗品種的長勢、開花結果習性、果實產量和品質等，還可以提高接穗品種的抗逆性和適應性，提高生產效率[4]。生產上主要使用的砧木為美味獼猴桃（A. chinensis var. deliciosa）實生苗[5]。實生砧木遺傳變異較大，對接穗樹勢、果實品質和果實產量等均有影響[6]，通過營養系砧木繁育可以保證苗木的一致性，有利于苗期管理，同時可以提高接穗果實品質的整齊度和均一性[7]，而對萼獼猴桃扦插極易成活。獼猴桃根為肉質須根系，土壤中分布較淺，對水分敏感，極其不耐澇，易受澇害脅迫。澇害已成為制約許多獼猴桃產區品質和規模的重要因素之一[8]。常用的美味實生砧木，雖然出苗率高且整齊粗壯，但根系對旱澇鹽堿抗性差，不耐貧瘠[9]。因此，選育獼猴桃耐澇砧木成為獼猴桃產業發展的關鍵環節。湖南省湘西永順縣的獼猴桃種植戶于2003年率先使用野生的“水楊桃”作為砧木，以對萼獼猴桃為主，嫁接獼猴桃優良品種，提高了接穗品種耐澇性[10]。“水楊桃”是湘西地區對軟棗獼猴桃（A. arguta）、對萼獼猴桃（A. valvata）、大籽獼猴桃（A. macrosperma）和四萼獼猴桃（A. tetramera）等的俗稱，因其扦插易生根，且與中華系獼猴桃品種嫁接親和性較好[11]，可以作為良好的營養系砧木。“水楊桃”常見的4個種作砧木的表現各異，在生產實踐應用中也有不同的表現，不同基因型個體能顯著影響接穗品種[12]。對萼獼猴桃為砧木耐澇性強[13]，在淹水條件下的抗缺氧能力優于其他獼猴桃種[14]；用對萼獼猴桃作砧木嫁接中華系或美味系獼猴桃，不僅可以提高植株的長勢和耐澇性，還可使果實提前成熟，促進果實膨大、提高產量等[15]。目前對于“水楊桃”的應用并沒有明確的分類，因此生產上常用的對萼獼猴桃種質遺傳背景混亂，種植戶自育的砧木來源復雜，沒有達到營養系砧木遺傳背景一致的要求。因此，明晰生產上常用的對萼獼猴桃資源遺傳背景，可為選擇優良且遺傳背景清晰的砧木奠定基礎。

獼猴桃的遺傳多樣性主要體現在形態性狀多樣性、營養成分及風味多樣性、染色體倍性變異、同工酶水平遺傳多樣性和DNA序列遺傳多樣性方面[16]。對表型性狀多樣性的研究是衡量物種多樣性和檢測遺傳變異最主要且最直觀的重要指標[17-18]。DNA分子標記是DNA序列水平遺傳變異的直接反映，它既不受環境和其他因素的影響，也不受基因表達的限制，多態性高且遺傳相對穩定[17]。簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）是研究植物遺傳多樣性的優異的分子標記之一，已被用于多種植物的遺傳多樣性研究[19]。研究發現黑龍江野生軟棗獼猴桃遺傳多樣性豐富，具有很大的育種選擇潛力[20]。獼猴桃絕大多數是雌雄異株果樹，必須通過授粉才能實現獼猴桃果實的高產優質，尋求早期鑒定性別的方法以達到人為控制植物性別分化的目的，在農業生產上具有重要的應用價值[21]，生產實踐表明用對萼獼猴桃雄株作砧木嫁接美味獼猴桃，親和力最好[11]，對萼獼猴桃的雄性優系有望成為獼猴桃嫁接砧木首選[22]。獼猴桃雌雄的形態特征只能通過觀察花器官進行識別，而獼猴桃實生播種至開花結果需4 a（年）以上[23]。因此，使用DNA分子標記早期鑒定獼猴桃植株性別是必要的。

筆者在本研究中以62份對萼獼猴桃種質為試材，結合分析其表型性狀多樣性和使用SSR標記技術，對研究的對萼獼猴桃種質進行遺傳多樣性分析，以明晰這些種質的遺傳背景和種內遺傳關系，同時使用性別相關標記鑒定這些種質的植株性別，為選育優良對萼獼猴桃雄性營養性砧木提供材料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年10月至2024年5月在湖南省湖南農業大學長安基地進行，所用的62份對萼獼猴桃種質均從湖南省湘西土家族苗族自治州鳳凰縣收集而來，均通過扦插繁育保存在湖南農業大學長安基地獼猴桃資源圃中，分別對這62份材料進行編號。

1.2 表型性狀觀測

按照中華人民共和國行業標準（NY/T 2933—2016）《獼猴桃種質資源描述規范》[24]共選取36個表型性狀進行觀測和記錄。同時在對萼獼猴桃花期通過觀察花器官狀態對花性進行形態性別鑒定，雄蕊敗育則判定為雌株；雌蕊敗育不形成胚珠則判定為雄株[25-26]（圖1）。在2023年先對其中19個枝葉性狀進行觀測與記錄，62份對萼獼猴桃種質中有34份于2024年4月開花，在花期對這34份對萼獼猴桃的17個花器官性狀進行觀測與記錄。共觀測了36種表型性狀，其中26個描述性性狀根據分級標準進行觀測并賦值（表1）。10種數值型性狀包括1年生枝節間長度、1年生枝粗度、葉片長度、葉片寬度、葉柄長度、花冠直徑、花瓣數量、花萼數量、花柱數和雄蕊數。

采用游標卡尺測量1年生枝節間長度、1年生枝粗度、葉片長度、葉片寬度、葉柄長度和花冠直徑，花瓣數量、花萼數量、花柱數和雄蕊數則直接計數，10次重復。

1.3 基因組DNA的提取

分別采取對萼獼猴桃幼嫩葉3～4枚，置于冰盒帶回實驗室，將葉片保存于-80 ℃冰箱。采用試劑盒（北京奧博來科技有限責任公司）提取DNA。所提取DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質量和濃度，-20 ℃保存備用，DNA提取同時用于SSR分析和性別鑒定。

1.4 PCR體系與毛細管電泳檢測

參照Lai等[27]篩選出的15個SSR標記，根據多態性等信息從中選擇多態性較好且擴增效率高的7對SSR引物進行PCR（表2）。7對引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增反應總體積為10 μL，包含 5 μL Mix酶、上下游引物各0.35 μL、1 μL 30 ng·mL-1 DNA模板，3.3 μL ddH2O。PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 40 s；72 ℃ 7 min，共35個循環，10 ℃保存。取PCR產物0.3 μL、分子質量內標0.5 μL和去離子甲酰胺9.5 μL混合加入PCR板，95 ℃變性5 min，4 ℃冷卻后離心，1×Buffer緩沖液上機進行毛細管電泳檢測。具體操作步驟和流程參考儀器操作說明。

1.5 性別分子標記鑒定

利用SyGI和FrBy基因設計引物進行性別分子鑒定，區分對萼獼猴桃雌雄株，以Ank marker作為對照，以測試PCR擴增是否成功。通過存在/不存在來區分雌株和雄株，雄株能擴增出3種PCR產物，而雌性植物僅擴增出對照[28]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取PCR產物0.3 μL、分子質量內標0.5 μL和去離子甲酰胺9.5 μL混合加入PCR板，95 ℃變性5 min，4 ℃冷卻后離心，1×Buffer緩沖液上機檢測（表3）。

1.6 數據處理

根據描述性性狀的分級標準，使用Microsoft Excel 2010對枝葉性狀進行頻率和變異系數分析。使用SPSS 23.0軟件對數值型性狀進行相關性分析。使用R語言[29]計算表型歐式距離并用非加權組配對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析；用GenAlex[30]計算擴增后的等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）；用Power Marker V 3.25[31]計算引物多態信息含量（PIC）。根據遺傳距離利用R語言進行UPGMA聚類分析。

2 結果與分析

2.1 對萼獼猴桃表型性狀多樣性分析

2.1.1 對萼獼猴桃描述性性狀的頻率分布和多樣性 對萼獼猴桃的表型多樣性豐富，種內變異較大。觀察的26種描述性性狀中，共有10種性狀有變異幅度，共檢測到25個變異類型。分別是1年生枝顏色、皮孔形狀、皮孔密度、葉片形狀、葉緣鋸齒形狀、葉基形狀、葉柄顏色、葉表面顏色、葉面平展度和花序類型，其中花序類型的變異系數最高（42.74%），而葉片形狀的變異系數最小（12.80%）。其余的16種描述性性狀都沒有變異，皮孔顏色都為灰白色；葉片都是膜質；葉尖均為急尖；葉背顏色都為綠色；葉背均無茸毛；花瓣都是卵圓形；花瓣內側主色均為白色；花瓣基部都是重疊；花萼都是綠色；雌花花柱都是斜生、乳白色；子房瓶形；雄花花絲均為白色；花藥長橢圓形、黃色；花瓣均無顏色梯度（表4）。

1年生枝顏色有4種，即灰白色、褐色、灰褐色和黃褐色。其中灰褐色的1年生枝最多，占74.19%，其次是褐色，占22.58%，灰白色和黃褐色最少，均僅占1.61%。皮孔形狀多為橢圓形，占82.26%；其余17.74%均為短梭形。皮孔密度都較高，其中66.13%皮孔多數，33.87%皮孔密度中等。葉片形狀93.55%是卵圓形，僅6.45%為披針形。葉緣鋸齒形狀有3類，細鋸齒葉緣占1.61%，波浪狀和粗鋸齒分別占48.39%和50.00%。葉基形狀為圓形的個體最多，占95.16%，少數為心形。葉柄顏色有綠色、綠黃色和紫紅色，分別占4.84%、53.23%和41.93%。葉表面91.93%是綠色，淺綠和深綠分別占4.84%和3.23%。葉面多數平展，僅9.68%具褶皺，花序類型有94.12%是單花，其余5.88%是多岐聚傘花序（表4）。

2.1.2 數值型性狀的多樣性和相關性分析 觀測對萼獼猴桃的10個數值型性狀變異系數范圍為7.96%～40.47%，平均變異系數為21.27%，表明其數值型性狀多樣性較豐富。葉柄長度的變異系數最大，為40.47%，雄蕊數的變異系數最小，為7.96%，枝葉數值型性狀平均變異系數為30.26%，花器官數值型性狀平均變異系數為12.29%（表5）。

對對萼獼猴桃枝葉的5個數值型性狀進行相關性分析，5個數值型性狀間均呈現極顯著正相關（p＜0.01）。其中葉片長度與葉片寬度的相關系數最高（0.860），1年生枝粗度與葉柄長度的相關系數最小（0.678）（表6）。

2.1.3 基于枝葉性狀的聚類分析 根據62份對萼獼猴桃枝葉性狀間的歐式距離，采用 UPGMA 法進行聚類分析，在歐式距離為7.5處可將62份對萼獼猴桃種質分為5組（圖2）。

第一組包括：B63、A59、B49、B3、B26等共27個單株，該組枝葉性狀遺傳變異最豐富。1年生枝顏色灰褐和褐色，葉片形狀卵圓形和闊卵形，葉緣波浪狀、粗鋸齒和細鋸齒，葉基圓形和心形，葉柄顏色紫紅色、黃綠色和綠色，葉表面顏色淺綠、綠和黃綠，葉面多平展少數具褶皺，1年生枝節間長度均低于總樣本平均值。

第二組僅A11一個單株，該組1年生枝節間長度和1年生枝粗度均低于總樣本平均值，1年生枝顏色褐色，皮孔數量中，皮孔形狀短梭形，葉片形狀卵圓形，葉緣粗鋸齒，葉基圓形，葉柄黃綠色，葉表面綠色，葉面平展，葉背綠色，葉柄長度是所有樣本中最高的。

第三組包括A49、A4、A23、B1、A50等15個單株，該組1年生枝節間長度均高于總樣本平均值，1年生枝粗度均低于總樣本平均值，1年生枝顏色多灰褐，少數褐色；皮孔橢圓或短梭，皮孔密度中或多，葉片形狀均為卵圓形，葉緣波浪狀或粗鋸齒，葉基除A26是心形外，其余均為圓形；葉柄紫紅或黃綠色，葉表面均為綠色。

第四組包括A35、A6、A7、A30、B48等17個單株。該組1年生枝節間長度僅次于第三組，1年生枝顏色灰褐和褐色，葉片多卵圓形、少數披針形，葉緣波浪狀和粗鋸齒，葉柄長度多數高于平均值，葉柄多紫紅色，少數黃綠色；葉表面均為綠色，葉片長度均高于總樣本平均值，葉片寬度大多數高于平均值。

第五組只有A43和A27兩個單株。該組1年生枝節間長度是所有樣本中最大的，1年生枝粗度均高于總樣本平均值，1年生枝顏色灰褐色，皮孔均橢圓形，葉片形狀卵圓形，葉緣均波浪狀，葉基均圓形，葉柄長度均低于總樣本平均值，葉柄顏色均黃綠色，葉片長度均高于總樣本平均值。

2.2 基于SSR標記的對萼獼猴桃多樣性分析

用篩選的7對多態性高的SSR引物分析62份對萼獼猴桃種質的多樣性，試驗所用的7對SSR標記在62份對萼獼猴桃資源中共擴增出69個等位基因，每個標記位點的平均等位基因數為9.857，變異范圍為2～18。其中等位基因數最豐富的引物是UDK-125，擴增出18個等位基因，而引物UDK-103只擴增出2個等位基因。平均有效等位基因數（Ne）為3.977；平均觀測雜合度（Ho）為0.994；平均期望雜合度（He）為0.696；SSR多態信息含量（PIC）的變化范圍為0.375～0.848，所篩選的引物中UDK-096的多態性最高（0.848），UDK-103的多態性最低（0.375），平均多態信息含量為0.626（圖3，表7）。

2.3 SSR遺傳距離及聚類分析

通過7對SSR引物分析，62株對萼獼猴桃單株的遺傳距離變異范圍為0.06～0.71，平均值為0.39。其中B21和B62等遺傳距離最大（0.71），而A23和B58等的遺傳距離最小（0.05）。

根據材料間的遺傳距離，采用UPGMA法對62份特異性單株進行聚類分析（圖4），最終可將62份對萼獼猴桃種質分為4個組，第Ⅰ組包括B21、A27和B11等16個單株；第Ⅱ組包括A38、A5和B52等24個單株；第Ⅲ組包括A54、B62和A7共16個單株。第Ⅳ組包括B7、B20和A1等6個單株。

2.4 性別鑒定

62株對萼獼猴桃單株中，由于A11未成活，只能對剩余61株進行性別分子鑒定，進行分子性別鑒定的61株單株中有18株為雌株，其余43株為雄株，在對萼獼猴桃盛花期（2024年4月22日—30日），61株中有34株開花，可進行形態觀察。花器官形態觀察結果表明，34份對萼獼猴桃種質中共有13份雌株，21份雄株。這34份對萼獼猴桃種質的性別分子標記鑒定結果為9份雌株和25份雄株（表8）。34份對萼獼猴桃種質分子性別鑒定和形態觀察鑒定結果一致性為79.14%。

3 討 論

生產上使用的對萼獼猴桃種質混雜，基于對萼獼猴桃枝葉性狀多樣性和SSR標記位點多態性分析，可鑒別其多樣性。根據對萼獼猴桃的36個表型性狀進行多樣性分析，有20個性狀存在變異，不同性狀間的變異系數介于7.96%～42.74%，平均變異系數為21.99%，表明對萼獼猴桃單株性狀變異類型較多、變異幅度較大，存在較豐富的多樣性。根據表型性狀也確定了收集的種質符合對萼獼猴桃的生物學特征[32]。觀測的62份種質的平均枝葉變異系數為23.98%，其中34份種質的花器性狀平均變異系數為17.36%，對萼獼猴桃種內枝條和葉片的變異幅度比花器性狀更為豐富，根據枝條和葉片表型可將62份對萼獼猴桃資源分為5組，同樣可以看出不同對萼獼猴桃單株間存在明顯的表型差異。62份對萼獼猴桃種質枝葉的5個數值型性狀間顯著相關，其中葉片長度和葉片寬度相關性最高，這與蘋果[33]和荔枝[34]中葉片長度與葉片寬度強相關的結果一致。

本研究中利用SSR分子標記技術，分析對萼獼猴桃的遺傳多樣性，研究結果表明挑選的7個SSR標記，平均多態性信息含量（PIC）為0.626。根據多態性信息含量評價體系（高：PIC≥0.5；適中：0.5＞PIC≥0.25；低：PIC＜0.25），表明本試驗所用的7對SSR引物多態性較豐富。62份對萼獼猴桃種質單株間的平均遺傳距離為0.39，高于5個毛花獼猴桃群體間的平均遺傳距離（0.25）[35]，說明對萼獼猴桃有豐富的遺傳多樣性。平均有效等位基因數（Ne）低于等位基因數（Na），說明本研究所用材料間親緣關系較近，有效等位基因較少；平均觀測雜合度（Ho）為0.994；平均期望雜合度（He）為0.686，觀測雜合度高于期望雜合度，可能是因為本試驗進行的是個體間的多樣性分析，材料間的雜合度較低。根據遺傳距離，對62份種質特異性單株進行聚類分析，共將這些材料聚為4組，其中每組材料里面的枝葉性狀有一定的多樣性，可能是在基因型相似的情況下，枝葉性狀受環境影響的結果，而SSR聚類結果表明的是遺傳背景相似度，與品種類型有一定的相關性[36]。表型是遺傳背景和環境共同作用的結果，由于62份種質中僅觀察到34份種質的花器性狀，因此，只能根據枝葉性狀進行表型聚類。表型聚類與SSR標記聚類結果相比，兩種聚類方法的結果一致性僅30.65%，這可能是本研究的表型聚類是基于枝葉形狀，而枝葉性狀更容易受環境及栽培管理的影響。將表型性狀分析與SSR分析結合起來，能更準確地反映出對萼獼猴桃的多樣性，表型和分子兩者都能作為分類依據，但DNA標記不易受環境影響，因此，可以通過表型為輔，DNA標記為主的方法對植株進行多樣性分析。

獼猴桃早期性別鑒定一般用于育種群體的早期篩選，雌株的經濟價值高于雄株，但雄株在抗性等方面優于雌株，軟棗獼猴桃雄株的抗寒性強于雌株[37]，此外軟棗獼猴桃雄株平均株高顯著高于雌株[38]，對山楊的雌株和雄株進行的抗寒性差異研究同樣發現雄株更能適應低溫的變化[39]。沙棘的耐凍性研究發現，雄株對低溫的反應比雌株更強烈，雄株比雌株更抗寒[40]。目前獼猴桃性別鑒定的方法主要有形態學標記[35]、生理生化[41]、同工酶鑒定[42-43]和DNA分子標記[44]等，但生理生化和同工酶鑒定主要針對成熟植株[45]，而獼猴桃的童期長，因此可以采用DNA分子標記在童期對獼猴桃性別進行鑒定，節約育種成本。本研究中，既進行分子性別鑒定又有形態觀察的34個單株中有79.14%鑒定結果一致，其中7個分子鑒定結果與形態觀察不一致，B13的兩種性別鑒定結果不一致可能是它的SyGI-select引物沒有擴增出條帶導致分子鑒定為雌株；A2、A38、A43、A53、A54和B8分子鑒定為雄株但形態觀察表明這些植株的雌蕊可育，具有結果能力，這可能是由于所選取的引物只能鑒定穩定的雌雄之分，不能區分雄株和可結果雄株[28]，這些材料是否為可結果雄株，還需進一步授粉驗證。SyGI在61個單株中共擴增出86、88和90 bp三個等位基因片段，FrBy共擴增出289和297 bp兩個等位基因片段，但在相關研究中所用對萼獼猴桃在SyGI位點僅擴增出89 bp，FrBy僅擴增出292 bp[28]，這可能是由于兩個研究所用材料的遺傳背景不同。FrBy在雌株中會發生意外擴增，這與該標記在某些獼猴桃種如毛花獼猴桃雌株中擴增出282 bp一致[28]，61份材料中標記鑒定為雌株的18份中有17份在FrBy位點發生了意外擴增，且發生意外擴增的都是289和289這個等位基因型，這也為在早期使用標記判斷性別時提供參考。標記FrBy在不同種間擴增情況不同，在實際應用中要先進行驗證，相較于FrBy，SyGI的準確性可能更高。試驗下一步將觀察此次未完成花器官形態鑒定的植株，分析花器官形態鑒定與性別鑒定的一致性，也會進一步研究對萼獼猴桃耐澇性與性別的相關性。

4 結 論

觀測的36個表型性狀中有20個性狀發生變異。選取的7對SSR引物，平均多態性信息含量（PIC）為0.65，結合表型和分子聚類結果，發現對萼獼猴桃不同單株之間存在較大的遺傳差異，由于表型性狀受環境較大，從分子水平上進行的SSR聚類不受環境影響，更具可靠性。針對其中的34份對萼獼猴桃種質進行早期性別鑒定，形態學觀察與分子標記鑒定結果79%一致，表明選取的標記可以在獼猴桃童期對性別進行初步鑒定，若需要對性別精確鑒定還需要在花期對生殖器官進行觀察。本研究結果表明了生產上應用的對萼獼猴桃種質遺傳背景較為混亂，根據聚類分析結果，初步明確了不同類群的特征，可以依據分類結果分析每個類群的利用價值，同時應用性別分子標記和形態觀察對性別進行鑒定，為選育優質對萼獼猴桃雄性砧木提供參考和材料。

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