白細胞介素22對肝星狀細胞活化的影響及其機制

摘要：目的探討肝星狀細胞活化過程中白細胞介素（IL）22發揮的作用及影響機制。方法選取人肝星狀細胞系LX-2細胞為研究對象，以轉化生長因子（TGF）β1誘導LX-2細胞構建肝星狀細胞活化模型，以梯度濃度的IL-22處理LX-2細胞，通過Western Blot、qRT-PCR檢測活化標志物Ⅰ型膠原蛋白（COL1A1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達水平以確定適宜的藥物工作濃度、時間；通過Western Blot、qRT-PCR及免疫熒光方法檢測經IL-22處理的活化肝星狀細胞中成纖維細胞因子誘導早期反應蛋白14（Fn14）、內質網應激（ERS）及其活化標志物水平；以衣霉素（TM）誘導LX-2細胞ERS，通過Western Blot、qRT-PCR檢測經IL-22處理后LX-2細胞ERS及其活化標志物水平；使用腫瘤壞死因子樣細胞凋亡弱誘導劑（TWEAK）、小干擾RNA分別上/下調Fn14，再檢測磷酸化肌醇需求蛋白1α（p-IRE1α）、肌醇需求蛋白1α（IRE1α）、轉錄因子剪接型X-盒結合蛋白1（XBP1s）、COL1A1和α-SMA基因及蛋白水平；在IL-22處理TGF-β1誘導的LX-2細胞的基礎上加用TWEAK上調Fn14，通過Western Blot、免疫熒光方法檢測Fn14、ERS及其活化標志物水平。計量資料兩組間比較采用成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Sidak’s多重比較檢驗。結果與TGF-β1組相比，TGFβ1+IL-22組COL1A1、α-SMA的蛋白和mRNA表達水平均下降，且在IL-22濃度為10 ng/mL以上作用24小時時效果更加顯著（P值均lt;0.01）；與TGF-β1組相比，TGF-β1+IL-22組Fn14、p-IRE1α、XBP1s表達水平均下降（P值均lt;0.05）；與TM組相比，TM+IL-22組p-IRE1α、XBP1s、COL1A1和α-SMA表達水平均下降（P值均lt;0.05）；與沉默對照（NC）組相比，Fn14 siRNA組p-IRE1α、XBP1s、COL1A1和α-SMA表達水平均下降（P值均lt;0.05）；與正常對照組相比，TWEAK組Fn14、p-IRE1α、XBP1s、COL1A1和α-SMA表達水平均上升（P值均lt;0.01）；與TGF-β1+IL-22組相比，TGF-β1+IL-22+TWEAK組Fn14、p-IRE1α、XBP1s、COL1A1和α-SMA表達水平均上升（P值均lt;0.05）。結論IL-22通過抑制Fn14負調控肝星狀細胞ERS進而抑制其活化增殖。

關鍵詞：肝纖維化；白細胞介素22；肝星狀細胞；內質網應激

基金項目：國家自然科學基金（81900552）；南京市衛生科技發展專項資金項目-杰出青年基金項目（JQX20005）

Effect of interleukin-22 on hepatic stellate cell activation and its mechanism

GAO Jun，CHEN Huan，LIU Yan，ZHANG Feng，ZHUGE Yuzheng.（Department of Gastroenterology，Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing Medical University，Nanjing 210008，China）

Corresponding author：ZHUGE Yuzheng，yuzheng9111963@aliyun.com（ORCID：0000-0002-3829-5831）

Abstract：Objective To investigate the effect of interleukin-22（IL-22）on the activation of hepatic stellate cells（HSCs）and its mechanism.Methods The human HSC LX-2 cells were selected for the study，and the LX-2 cells induced by TGF-β1 were used to establish a model of HSC activation.LX-2 cells were treated with IL-22 at gradient concentrations，and Western blot and qRT-PCR were used to measure the expression levels of the activation markers COL1A1 andα-SMA and determine the appropriate working concentration and time of the drug.Western blot，qRT-PCR，and immunofluorescence assay were used to determine the levels of Fn14 and the markers for endoplasmic reticulum stress（ERS）and activation in activated HSCs treated by IL-22.ERS in LX-2 cells was induced by tunicamycin（TM），and Western blot and qRT-PCR were used to measure the levels of markers for ERS and activation in LX-2 cells treated by IL-22.TNF-like weak inducer of apoptosis（TWEAK）and small interfering RNA were used to upregulate and downregulate Fn14，and then the mRNA and protein expression levels of p-IRE1α，IRE1α，XBP1s，COL1A1，andα-SMA were measured.After LX-2 cells induced by TGF-β1 were treated by IL-22，TWEAK was used to upregulate Fn14，and Western blot and immunofluorescence assay were used to measure the levels of Fn14 and the markers for ERS and activation.The independent-samples t-test was used for comparison of continuous data between two groups；a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups，and the Sidak’s multiple comparison test was used for further comparison between two groups.Results Compared with the TGF-β1 group，the TGF-β1+IL-22 group had significant reductions in the protein and mRNA expression levels of COL1A1 andα-SMA，with a more significant effect after treatment with 10 ng/mL IL-22 for 24 hours（all Plt;0.01）.Compared with the TGF-β1 group，the TGF-β1+IL-22 group had significant reductions in the expression levels of Fn14，p-IRE1α，and XBP1s（all Plt;0.05）.Compared with the TM group，the TM+IL-22 group had significant reductions in the expression levels of p-IRE1α，XBP1s，COL1A1，andα-SMA（all Plt;0.05）.Compared with the silenced control group，the Fn14 siRNA group had significant reductions in the expression levels of p-IRE1α，XBP1s，COL1A1，andα-SMA（all Plt;0.05）.Compared with the normal control group，the TWEAK group had significant increases in the expression levels of Fn14，p-IRE1α，XBP1s，COL1A1，andα-SMA（all Plt;0.01）.Compared with the TGFβ1+IL-22 group，the TGF-β1+IL-22+TWEAK group had significant increases in the expression levels of Fn14，p-IRE1α，XBP1s，COL1A1，andα-SMA（all Plt;0.05）.Conclusion IL-22 negatively regulates ERS in HSCs by inhibiting Fn14，thereby inhibiting the activation of HSCs.

Key words：Hepatic Fibrosis；Interleukin-22；Hepatic Stellate Cells；Endoplasmic Reticulum Stress

Research funding：National Natural Science Foundation of China（81900552）；Nanjing Health Science and Technology Development Special Fund Project-Outstanding Youth Fund（JQX20005）

肝纖維化是肝硬化的必經階段，目前尚缺乏有效的治療方法［1-2］。肝纖維化發生的核心機制是肝星狀細胞活化導致細胞外基質過度沉積［3］。因此，以活化的肝星狀細胞為治療靶點，進一步探索纖維化發展和逆轉的新機制具有重要意義。

成纖維細胞生長因子誘導早期反應蛋白14（fibroblast growth factor-inducible 14，Fn14）是腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑（TWEAK）的主要受體，TWEAK啟動細胞內信號通路，如NF-κB和MAPK［4］。Fn14具有重要的病理生理作用，參與組織損傷修復、血管生成、炎癥反應、細胞存活和死亡等［5］。本課題組先前研究以Fn14為中心，相繼發現Fn14的上調通過激活經典的NF-κB/MMP9信號通路促進細胞遷移［6］；Fn14還能抑制活化肝星狀細胞的凋亡并促進炎癥因子的分泌，下調Fn14則會增加細胞凋亡［7］。本研究繼續以Fn14為靶標，進一步探討其促進纖維化的機制及可能逆轉的新方法。

研究［8-10］表明，白細胞介素（IL）22可促進活化的肝星狀細胞衰老，還可通過抑制肝星狀細胞的活化和下調炎癥因子的表達來逆轉纖維化。相反，也有研究［11-12］表明，IL-22在HBV感染小鼠模型中具有促纖維化作用，IL-22的高表達與HCV感染患者的纖維化進展相關。這表明IL-22可能在不同的肝病中發揮不同的作用。

內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是細胞為應對內質網腔內錯誤折疊與未折疊蛋白聚集，以及鈣離子平衡紊亂等狀況，而激活未折疊蛋白反應等信號途徑的反應過程［13］。ERS促進肝星狀細胞活化在相關研究中被證實：ERS引起的氧化應激可促進肝星狀細胞的活化［14］；丹酚酸A通過SIRT1介導的HSF1脫乙?；瘻p輕ERS，從而緩解肝纖維化［15］；在體外，用衣霉素（tunicamycin，TM）化學誘導未折疊蛋白反應可促進肝星狀細胞活化［16］。IL-22可以調節INS-1細胞中棕櫚酸酯誘導的ERS［17］；IL-22可以逆轉高脂飲食誘導的結腸上皮細胞ERS的影響［18］。但目前未見有IL-22對肝星狀細胞ERS具有調控作用的研究報道。

目前的研究主要揭示Fn14促進肝纖維化的現象，對機制的研究仍有欠缺。研究發現，Fn14能夠調控肝星狀細胞ERS相關分子表達，同時IL-22能夠抑制活化肝星狀細胞Fn14的表達。本研究通過觀察IL-22對肝星狀細胞活化的影響，探討可能通過Fn14調控ERS的可能機制。為臨床治療肝纖維化提供新的理論和實驗依據。

1材料方法

1.1細胞培養和處理人肝星狀細胞LX-2購自中國武漢普諾賽生物公司，在混合有10%胎牛血清的1640培養基中培養，溫度為37℃，培養條件為5%CO2加濕空氣。培養基定期更換，直至細胞生長至覆蓋培養瓶底部的70%～80%。然后根據不同實驗需求將細胞接種到6/12孔板中，貼壁12～24 h后，根據不同分組需要予以TGF-β1 5 ng/mL、IL-22 10 ng/mL、TM 2 ug/mL、TWEAK 100 ng/mL處理，24 h后收取細胞。

1.2試劑和抗體胎牛血清、RPMI 1640培養基、胰蛋白酶-EDTA溶液和磷酸鹽緩沖液（PBS）購自南京森貝伽生物公司；IL-22（貨號：HY-P7039）、TGF-β1（貨號：HY-P）購自美國MCE公司；TWEAK（貨號：RP01446）購自武漢愛博泰克生物公司；Tunicamycin（N-連接的糖基化抑制劑）（貨號：SC0393）購自碧云天公司；Fn14（貨號：ab109365）、p-IRE1α（貨號：ab124945）、XBP1s（貨號：ab220783）、ATF6（貨號：ab227830）、PERK（貨號：ab229912）一抗購自英國Abcam公司；IRE1α（貨號：A21021）購自武漢愛博泰克生物公司；α-SMA（貨號：1E9A11）、COL1A1（貨號：1E9A7）和β-actin（貨號：4H1）購自武漢三鷹生物公司。

1.3 Fn14小干擾RNA轉染Hs-Fn14-si1、Hs-Fn14-si2、Hs-Fn14-si3和陰性對照模擬物（NC組）由上海漢恒生物公司合成。細胞轉染采用Lipofectamine 2000試劑（上海賽默飛公司），按照供應商提供的方案進行。轉染后48 h收取細胞進行下一步實驗。

1.4 Western Blot檢測取經藥物干預處理的LX-2細胞，用預冷的PBS沖洗6孔板中的LX-2細胞3次，用含有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液裂解30 min，提取細胞內總蛋白，用BCA蛋白檢測試劑盒（碧云天）測定總蛋白濃度。將等濃度的總蛋白在10%SDS-PAGE凝膠上分離，然后轉移到Immobilon?-PSQ PVDF膜上，用甲醇激活，與Fn14（1∶5 000）、IRE1a（1∶1 000）、p-IRE1a（1∶5 000）、XBP1s（1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）、COL1A1（1∶1 000）的一抗在4℃冰箱中孵育過夜。然后用HRP結合的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）或山羊抗鼠IgG二抗在室溫下孵育1 h，ECL顯影，曝光時間1～2 min，并使用Tanon 5200 Multi圖像分析系統收集和分析印跡產物的圖像。

1.5定量實時PCR取經藥物干預處理的LX-2細胞，用預冷的PBS沖洗加藥的LX-2細胞，根據生產商的說明使用TRIzol試劑從LX-2細胞中提取總RNA，并使用分光光度計進行定量。使用HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR將1μg RNA反轉錄為cDNA，然后使用qPCR Master Mix和相應引物進行實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）。目標mRNA的表達量與人β-肌動蛋白mRNA的表達量進行比較，并采用?ΔΔCt法對數據進行量化，使用GraphPad Prism 8對數據進行統計分析做圖。所用引物序列見表1。

1.6免疫熒光檢測在帶有無菌載玻片的12孔板中培養LX-2細胞，每孔約4×104個。經藥物處理后，用冷PBS沖洗載玻片上的LX-2細胞3次，室溫下用4%多聚甲醛固定20 min，室溫下用0.5%Triton-100通透20 min，室溫下用5%BSA封閉30 min，然后用稀釋為1∶100的一抗孵育過夜。最后，用PBST沖洗載玻片3次，并用稀釋為1∶100的FITC結合物山羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h。滴加DAPI進行再染色。然后使用Leica DMi8倒置熒光顯微鏡觀察玻片，并存取圖片。

1.7統計學方法采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。計量資料兩組間比較采用成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Sidak’s多重比較檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 IL-22對肝星狀細胞活化的影響用TGF-β1（5 ng/mL）處理LX-2細胞24 h，同時予以不同濃度的IL-22（0、1、10、50和100 ng/mL）分組處理，Western Blot結果顯示，與TGF-β1組相比，隨著IL-22濃度升高，其抑制α-SMA和COL1A1表達的作用越強（圖1a、b）。同樣用TGF-β1（5 ng/mL）誘導LX-2細胞24 h，同時用不同濃度的IL-22（0.1、0.5、1、10、100 ng/mL）分組處理，qRT-PCR結果顯示，與TGF-β1組相比，IL-22處理的LX-2組中α-SMA和COL1A1的表達水平也呈劑量依賴性（圖1c）。用TGF-β1（5 ng/mL）誘導LX-2細胞24 h后分別用IL-22處理12 h和24 h，對α-SMA和COL1A1 mRNA的qRT-PCR檢測顯示，IL-22在處理12 h和24 h均表現出抑制效應，且TGF-β1在24 h時誘導活化效應更顯著（圖1d）。

2.2 IL-22抑制肝星狀細胞中Fn14的表達和ERS按對照組、TGF-β1組、TGF-β1+IL-22組不同分組對應藥物處理LX-2細胞24 h，Western Blot結果顯示，TGF-β1促進Fn14及ERS相關蛋白磷酸化的IRE1α和XBP1s的表達。加入IL-22后上述蛋白表達受到抑制，而未折疊蛋白反應另外兩個通路蛋白ATF6、PERK的表達不受影響（圖2a），后續試驗將主要聚焦于IRE1α-XBP1s信號通路。Fn14和XBP1s的免疫熒光染色結果與Western Blot和qRT-PCR結果一致（圖2b～d）。為進一步研究IL-22是否通過抑制LX-2的ERS發揮作用，加入ERS誘導劑TM激活LX-2，將細胞分為對照組、TM組、TM+IL-22組。Western Blot結果顯示，TM處理的LX-2中IRE1α和XBP1s的表達明顯增加。此外，TM還上調了α-SMA和COL1A1的表達，IL-22處理可抑制這種現象（圖2e）。qRT-PCR結果顯示，XBP1、COL1A1和α-SMA的mRNA表達與Western Blot檢測結果一致（圖2f）。

2.3 Fn14調控IRE1α-XBP1s信號通路首先，使用小干擾RNA下調肝星狀細胞Fn14的表達，并通過Western Blot和qRT-PCR驗證其下調效率（圖3a～b）。成功下調Fn14表達后，檢測IRE1α-XBP1s通路的表達情況，隨著Fn14的下調，XBP1s、α-SMA和COL1A1的mRNA表達均有所降低（P值均lt;0.01），蛋白表達的變化也一致，總的IRE1a蛋白變化不明顯，但磷酸化的IRE1a減少（圖3c、d），結果表明，Fn14是通過IRE1α-XBP1s途徑激活肝星狀細胞。為了進一步說明兩者之間的關系，在先前研究的基礎上，使用TWEAK上調Fn14的表達，然后檢測相關蛋白的表達。將細胞分為NC組和TWEAK組，使用TWEAK處理細胞24 h后，TWEAK組Western Blot結果顯示，Fn14上調后，p-IRE1α、XBP1s、α-SMA和COL1A1的表達量增加（圖3e）。qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，TWEAK處理的LX-2中Fn14、XBP1s和α-SMA的mRNA表達明顯增加（P值均lt;0.01）（圖3f）。Fn14和XBP1s的免疫熒光染色結果與Western Blot和qRT-PCR結果一致（圖3g）。

2.4 IL-22通過抑制Fn14/ERS信號通路抑制肝星狀細胞活化將細胞分為對照組、TGF-β1組、IL-22+TGF-β1組、IL-22+TGF-β1+TWEAK組，使用對應藥物處理LX-2細胞24 h，前三組Western Blot結果與之前實驗結果一致，IL-22抑制TGF-β1誘導的Fn14、p-IRE1α、XBP1s、α-SMA和COL1A1蛋白表達。不同的是，在此基礎上加入TWEAK上調Fn14后，這種抑制作用反被抵消，Fn14和XBP1s的免疫熒光結果與Western Blot結果相一致（圖4）。

3討論

對于慢性肝病導致的肝纖維化，目前尚無有效的療法獲得批準［19］。TGF-β1是機體常見的一種轉化生長因子，是正常肝細胞向成纖維樣細胞轉變的一個重要促進因子［20］。本研究用TGF-β1誘導肝星狀細胞活化，探索IL-22在肝纖維化發展過程中的保護作用。

IL-22是一種新發現的CD4+Th細胞因子，具有抑制或促進多種疾病的雙重功能［21］。在血吸蟲感染的小鼠肝纖維化模型中，IL-22可激活肝信號轉導和轉錄激活因子3，從而改善肝纖維化［22］。相反，在慢性病毒性肝炎患者中，IL-22水平顯著升高。IL-22在肝病中表現的雙重作用可能與疾病病因、疾病階段及機體免疫狀態相關［23］。在特異性皮炎相關研究［24］中發現，TWEAK在誘導許多與特異性皮炎發病機制相關的基因方面具有很強的炎癥活性，并且該細胞因子具有與兩種已識別的特異性皮炎特征細胞因子IL-13或IL-22相當的活性。因此可以推斷TWEAK-Fn14信號軸與IL-22之間存在一定的調控關系，本研究發現IL-22不僅能抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞活化，還首次發現IL-22能抑制TGF-β1誘導后的肝星狀細胞Fn14以及ERS相關蛋白XBP1s的表達。

在氧化應激和炎癥等應激條件下，內質網可能會不堪重負，導致錯誤折疊的蛋白質積累以及隨之而來的ERS。輕度ERS有助于錯誤折疊和未折疊蛋白正確折疊，并加強錯誤折疊蛋白的降解，從而促進細胞存活并維持細胞內環境的平衡。然而，如果應激因素持續存在，ERS將超過未折疊蛋白反應閾值，將誘導細胞凋亡［25］。在內質網中存在3個傳感器，PERK、ATF6和IRE1傳感器檢測內質網中的蛋白質錯誤折疊并觸發未折疊蛋白反應，是一個維持體內平衡的復雜系統［26］。在3條信號通路中，IRE1是最保守的，IRE1的N端區域與未折疊的蛋白質結合，而細胞質中的C端區域具有兩個激酶和RNase結構域。激活未折疊蛋白反應后，IRE1被自磷酸化，并將XBP1s mRNA與其Rnase結構域剪接，剪接的XBP1通過充當轉錄因子轉移到細胞核來參與調節蛋白質折疊、蛋白質分泌、內質網相關蛋白質降解系統和脂質代謝的基因表達［27］。在慢性肝病中很容易觀察到ERS，許多致病因素如感染、炎癥、活性氧、營養剝奪和缺氧等都會激活未折疊蛋白反應信號通路，而未折疊蛋白反應的適應性信號通路IRE1α-XBP1s可保護肝星狀細胞免受ERS誘導的凋亡［28］。研究［29］表明，IRE1α-XBP1s軸可在TGF-β處理后誘導TANGO1（一種參與膠原I分泌的蛋白質）上調。未折疊蛋白反應激活誘導TANGO1上調，從而促進肝纖維化。這與本研究的實驗結論Fn14通過調控IRE1α-XBP1s信號通路促進肝星狀細胞活化不謀而合。

Fn14的促纖維化效應已在之前的研究中得到證實［6-7］。本研究使用TWEAK上調Fn14，首次發現了Fn14的上調能夠影響IRE1α-XBP1s通路蛋白的表達。雙醋瑞因治療以劑量依賴的方式對膽管結扎誘導的肝纖維化具有保護作用，并且這種作用可能與調節HMGB1/RAGE/NF-κB/JNK和ERS信號通路有關［30］。而Fn14是否通過類似于NF-κB胞內信號通路影響IRE1α-XBP1s通路有待進一步研究。

總之，本研究表明，IL-22能有效抑制肝星狀細胞的活化，并且這一作用機制可能是通過下調Fn14以及由其介導的ERS通路抑制有關。由此表明，IL-22可能是臨床治療肝纖維化的潛在選擇。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：高君負責實驗設計與操作，起草論文；陳歡、劉燕負責實驗操作；張峰、諸葛宇征提供課題思路，指導實驗內容，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-03-03；錄用日期：2024-05-17

本文編輯：林姣

引證本文：GAO J， CHEN H， LIU Y， et al. Effect of interleukin22 on hepatic stellate cell activation and its mechanism[J]. J Clin Hepatol， 2024， 40（11）： 2229-2237.

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