檢測活性氧近紅外熒光探針研究進展

摘""""" 要：活性氧（ROS）在化學、生物學和醫學上引起了許多研究人員的注意，它在許多關鍵的生理過程中起著重要的作用，活性氧在體內的過量產生和積累會損害一些生物分子，直接或間接導致多種疾病，因此它們被認為與各種病理條件有關。探究活性氧在體內的具體致病機理，并且在了解該致病機理的基礎上研發相關藥物，變得尤為重要。檢測活性氧的近紅外熒光探針是一個新的有前途的工具，可以無創的情況下檢測體內細胞系統中目標生物分子的空間和時間信息，并在此基礎上提供一個較好的治療方案。

關" 鍵" 詞：活性氧；近紅外；熒光探針；生物成像

中圖分類號：O657.3"""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1004-0935（2024）11-1761-03

活性氧（ROS）是一系列高活性氧物種，包括羥基自由基（·OH）、過氧化氫（H₂O₂）、次氯酸鹽（OCl^-）、單線態氧（¹ O₂）、過氧亞硝酸鹽（ONOO^?）、一氧化氮（NO）、超氧自由基（O₂^?）等^[1-2]。傳統上，ROS被認為是主要在宿主防御機制中產生的抗菌劑，如中性粒細胞的氧化爆發^[3]。這些不同種類的活性氧也對機體代謝產生至關重要的作用^[4]。他們可以降解環境中的各種化學物質^[5]，也可以降解生物體內的有機小分子等^[6-7]，可以防止病毒入侵，參與機體修復，還可以作為反映炎癥等的信號^[8]。當然有的活性氧也會釋放有害物質對生物體造成損害，例如生物體中的白細胞產生的氧化劑中，毒性最大和含量最高的是次氯酸，它可以快速攻擊多種與生理相關的分子，包括核苷酸、抗壞血酸、硫醇、胺、氨基酸、多烯酸、硫醚等，同時次氯酸在某些條件下可以產生其他具有很高反應性的氧化劑^[9]。生物體細胞內的過氧化氫主要來自線粒體。它對細胞分化、增殖等許多生理過程具有一定的調節作用。然而，當生物體內過氧化氫含量異常時候可能導致心血管疾病、阿爾茨海默病等疾病。所以，快速檢測生物體內細胞中活性氧的含量水平以對身體健康做出判斷變得尤為重要。

光譜熒光探針具有無侵入性、高靈敏度和優越的時空采樣能力^[10-13]。熒光探針可以在體內細胞系統中實時地檢測小分子目標的具體信息。熒光探針是揭示生物分子生物學作用的很有前途的工具。考慮到ROS的壽命短、快速轉化率高、反應活性高、濃度低，能夠實時原位檢測和監測的探針對研究ROS的生物學功能具有重要意義，尤其是具有獨特設計策略和特殊識別組的熒光探針來區分不同的ROS是更可取的^[14-18]。

1" 過氧化氫的檢測

過氧化氫（H₂O₂）作為活性氧（ROS）的一種，對細胞增殖、遷移、分化等許多代謝過程具有一定的調節作用。其物理化學過程會導致各種疾病的發生，如癌癥和阿茲海默癥等，目前檢測過氧化氫的主要方法為分光光度法、熒光法等^[19-20]。

線粒體是細胞的引擎，是細胞的能量來源^[21]。" 最常見的方法是傳遞分子探針到細胞線粒體，如三苯基膦（TPP），還有比如花菁染料和羅丹明，這些帶有陽離子的熒光團也可以用來靶向線粒體。這些基團在進入機體后，通過血液循環進入各個細胞，最終因為帶有正電荷的原因，在線粒體中逐步積累。具有靶向性的熒光探針由3部分組成，分別是熒光團、識別單元和靶向基團。當反應位點滿足過氧化氫時，探針的熒光強度會增強或減弱，從而實現對過氧化氫的檢測。

MASANTA等^[22]合成了可以靶向線粒體的雙光子熒光探針，此探針是以6-（苯并[d]噻唑-2-酰基）-2-（N，N-二甲基胺）萘為熒光團，過氧化氫的響應位點為硼酸基氨基甲酸酯，線粒體靶向基團為三苯基膦鹽（TPP）。氨基甲酸鍵硼酸基會降低熒光團的電子云密度，而H₂O₂可以在探針中硼酸鹽位置導致裂解，然后探針斷裂釋放熒光團更豐富的電子，熒光發射產生紅移。探針1與過氧化氫相互作用后的熒光發射光譜從 470 nm紅移到 545 nm。在pH為7.4的MOPS緩沖液中，隨著過氧化氫濃度的逐漸增加，熒光強度在470 nm處逐漸降低，并且在 545 nm處逐漸增加。探針1在接觸過氧化氫前后，熒光強度增強了67倍，被認為探針1對過氧化氫檢測能取得較好的效果，檢測限可達到4.6 μmol·L^-1。他們還評估了靶向選擇性，熒光檢測圖結果顯示探針1對過氧化氫的選擇性最高。此外評估了在生物學中不同pH時探針1的活性，檢測顯示在不同pH范圍下，探針1具有良好的熒光發射強度，結果表明此探針可以用于活體生物的線粒體中過氧化氫檢測。以上結果表明，探針1對線粒體中過氧化氫有較高的檢測性能。

2" 次氯酸的檢測

在生物機體中，次氯酸作為氧化劑，使得中性粒細胞和單核細胞等白細胞產生毒性，并快速攻擊生物分子，如胺、氨基酸、抗壞血酸、多烯酸、硫醇、硫醚等。因此，實現對生物體中次氯酸的實時監測和準確檢測具有重要意義。傳統的檢測次氯酸方法有很多，如比色法、化學發光法、庫侖滴定法、碘量滴定法、放射分解法等。然而，熒光探針檢測次氯酸具有較快的響應時間、高的選擇性、低的檢測限等，并且能做到無創檢測，對生物體的傷害微乎其微^[23-24]。羅丹明被認為是一種可以檢測次氯酸的熒光染料，由于它具有獨特的螺旋結構特性，因此在沒有與外界發生反應時沒有熒光發射。在與次氯酸反應后，其螺旋環結構發生裂解被打開，會發出強烈的熒光，這一過程并伴有明顯的顏色變化。其熒光發射波長通常在500 nm以上，并且由于其具有較高的量子產率，光穩定性能較好，是一種良好的熒光染料。

ZHU等^[25]設計了一種基于羅丹明的熒光探針2。該探針以1，8-萘酰亞胺熒光團作為供體、羅丹明熒光團作為受體。與傳統意義上的單一熒光傳感器相比，比率熒光化學傳感器在探測器的靈敏度等方面都有較大程度上的提升，甚至可以通過自校準兩個熒光發射來實現定量檢測。在360 nm光譜激發下1，8-萘酰亞胺熒光團在477 nm處的藍色熒光發射減少，因為供體的能量轉移到受體，所以羅丹明熒光團在618 nm處的橙色熒光發射增強。在此探針中次氯酸誘導氨基硫脲脫硫，使得羅丹明開環，并在開環的過程中釋放熒光。該羅丹明探針對次氯酸的檢測限低至4.5 nmol·L^-1，是一種有前景的熒光探針。

3" 過氧亞硝酸鹽的檢測

作為活性氧的重要成員，過氧亞硝酸鹽的半衰期極短，只有10～20 ms。過氧亞硝酸鹽對生物機體中的新陳代謝起著至關重要的作用，它可以傳遞信號，但是當它的濃度升高的時候，會產生有害影響，例如氧化DNA、蛋白質等。因此，研發一種可以快速檢測過氧亞硝酸鹽選擇性熒光分子探針尤為重要。經過近20年的發展，目前已經有用于檢測過氧亞硝酸鹽的探針，包括羥基苯基熒光素（HPF）和氨基苯基熒光素（APF）等。

LI等^[26]開發了一種新型的熒光探針3，用于利用缺血誘導的神經血管損傷跟蹤細胞和小鼠中過氧亞硝酸鹽的原位生成。苯并噻唑是一種良好的熒光探針，具有對過氧亞硝酸鹽的高選擇性。其正常形式（中間狀態）是弱熒光，但當激發時，它可以通過激發態分子內質子轉移（ESIPT）異構化，導致熒光大幅增加。

4" 結束語

綜述了目前關于熒光探針檢測體內過氧化氫、次氯酸鹽、過氧亞硝酸鹽的研究進展，并且敘述了相關探針對于檢測不同活性氧時的設計機理，包括光電子轉移（PET）、分子內電荷轉移（ICT）、熒光共振能量轉移（FRET）等，探討了相關活性氧在生物體內的積極、消極的作用，分析了探針的設計策略、光學性能等。這些探針各有自己的優異性能，如選擇性極高、反應時間短、光物理性質穩定等。但是，也迫切需要研發適用于更加復雜條件、檢測限更低、建立多通道同時檢測的熒光探針。

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Research Progress in Near-Infrared Fluorescence Probes

for Detecting Reactive Oxygen Species

XIAO Bin， WANG Chunmei， HAN Zhenghao

（College of Chemistry amp; Chemical Engineering， Yunnan Normal University， Kunming Yunnan 650500， China）

Abstract： Reactive oxygen species （ROS） have attracted the attention of many researchers in chemistry， biology and medicine， it plays important role in many key physiological processes， the excessive production and accumulation of ROS in the body can damage some biomolecules， directly or indirectly cause a variety of diseases， so they are considered to be related to various pathological conditions. it is important to explore the specific pathogenic mechanism of reactive oxygen species in the body to develop related drugs based on the understanding of this pathogenic mechanism. Near-infrared fluorescent probes for the detection of reactive oxygen species is a promising tool for non-invasive detection of spatial and temporal information of target biomolecules in vivo cellular systems， providing a more promising treatment based on this.

Key words： Reactive oxygen species; Near-infrared spectroscopy; Fluorescent probes; Biological imaging