木薯氰苷合成關鍵酶基因MeCYP79D2的克隆及表達分析

摘""要：氰苷含量是木薯改良的重要靶標性狀，MeCYP79D2是木薯氰苷合成的限速酶基因之一。本研究以食用木薯品種SC9為材料，克隆木薯細胞色素P450酶家族中的MeCYP79D2基因，通過生物信息學軟件對其進行分析，利用實時熒光定量PCR檢測其在不同木薯種質塊根中的表達特性，采用高效液相色譜儀測定氰化物的含量，并分析其與MeCYP79D2基因表達量的相關性。研究結果顯示：MeCYP79D2基因編碼區序列長度為1625"bp，編碼528個氨基酸，屬于不穩定脂溶性親水蛋白，具有38個磷酸化位點；序列比對表明該基因保守性較高；系統進化分析顯示MeCYP79D2與橡膠及麻風樹關系較近；氰苷含量不同的木薯種質資源塊根中MeCYP79D2基因表達量與氰苷含量存在極顯著正相關；茉莉酸甲酯處理后，根中MeCYP79D2基因的表達顯著上調且氰苷含量顯著升高。本研究結果表明MeCYP79D2參與氰苷合成，為解析木薯氰苷生物合成的分子機制研究提供理論基礎。

關鍵詞：木薯；細胞色素P450單加氧酶；氰苷；基因克隆

中圖分類號：S533""""""文獻標志碼：A

Cloning"and"Expression"Analysis"of"Key"Enzyme"Gene"MeCYP79D2"for"Cyanoside"Synthesis"in"Cassava

XIAO"Xinhui1，"YU"Xiaoling2，"ZHANG"Jie1，"FU"Naifang1，"XUE"Maofu1，"WEI"Zhuowen1，"YE"Jianqiu1，"WANG"Ming1*

1."Tropical"Crops"Genetic"Resources"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Germplasm"Resources"Conservation"and"Utilization"of"Cassava，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："The"level"of"cyanogenic"glucosides"content"is"an"important"trait"for"the"edible"quality"of"cassava，"and"MeCYP79D2"is"one"of"the"key"enzyme"genes"regulating"cassava"cyanogenic"glucosides"synthesis."This"study"used"the"edible"variety"SC9"as"the"material，"cloned"the"MeCYP79D2"gene"in"the"cytochrome"P450"enzyme"family"of"cassava，"analyzed"it"using"bioinformatics"software，"and"detected"its"expression"characteristics"in"different"cassava"germplasm"tubers"using"real-time"quantitative"PCR."The"cyanogenic"glucosides"content"was"measured"using"HPLC，"and"its"correlation"with"the"expression"level"of"MeCYP79D2"genenbsp;was"analyzed."The"results"showed"that"the"length"of"the"coding"region"sequence"of"MeCYP79D2"gene"was"1625"bp，"encoding"528"amino"acids."It"belonged"to"an"unstable"lipophilic"hydrophilic"protein"with"38"phosphorylation"sites."Sequence"alignment"indicated"that"the"gene"was"highly"conserved，"and"phylogenetic"analysis"showed"that"MeCYP79D2"was"closely"related"to"rubber"and"leprosy"trees."There"was"a"significant"positive"correlation"between"the"expression"of"MeCYPD2"gene"and"the"content"of"cyanogen"glycosides"in"cassava"roots"of"germplasms"with"different"levels"of"cyanogen"glycosides."After"treatment"with"methyl"jasmonate，"the"expression"of"MeCYP79D2"gene"in"roots"was"significantly"upregulated"and"the"content"of"cyanogenic"glucosides"was"significantly"increased."The"results"of"this"study"indicates"that"MeCYP79D2"is"involved"in"cyanogenic"glucosides"synthesis，"providing"a"theoretical"basis"for"studying"the"molecular"mechanism"of"cassava"cyanogenic"glucosides"biosynthesis.

Keywords："cassava;"cytochrome"P450;"cyanogenic"glucosides;"gene"cloning

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.11.003

木薯（Manihot"esculenta"Crantz）是世界熱帶地區的主要糧食作物，是重要的淀粉、能源及飼料加工原料，全球以木薯為原料的食品多達上千種[1-2]。因木薯中含有氰苷化合物，人們在食用時要經過一定的處理，費工費時，極大限制了木薯食用化的發展。氰苷是一種廣泛存在于高粱、木薯、雜糧雜豆（利馬豆和野生蕎麥等）、牧草（白三葉和百脈根等）等植物中的代謝產物，其被水解酶水解后能釋放有毒化合物氰氫酸，可抵抗病原微生物的侵害和昆蟲啃食，也能在植物體內被分解作為氮源[3-4]。木薯中含有1種或2種氰苷化合物，為亞麻苦苷和百脈根苷，其中亞麻苦苷含量占95%以上[5]。木薯分為甜木薯和苦木薯，主要差別在于塊根中氰苷類化合物含量的高低，低于50"mg/kg為甜木薯，反之則為苦木薯，甜木薯主要用于食用和飼用，苦木薯主要用于加工利用[6]。

細胞色素P450單加氧酶（cytochrome"P450，"CYP450）是一類普遍存在于動植物和真菌中的超大酶類家族，約占植物基因組編碼蛋白質的1%[7]。它作為一種末端加氧酶，可以催化各類羥基化、環氧化、脫烷基化反應，參與植物激素、萜類、生物堿類、黃酮類等次生代謝產物的合成與代謝，在生物過程中發揮重要作用[8-9]，廣泛分布在玉米[10]、水稻[11]、小麥[12]、番茄[13]、茶樹[14]等作物中。氰苷生物合成途徑中涉及三大類酶，其中兩類均屬于細胞色素CYP450單加氧酶家族，為CYP79和CYP71亞族成員，另一類為葡萄糖轉移酶。氰苷生成過程中首先通過CYP450，將α-氨基酸羥基化形成N-羥基氨基酸，然后形成醛肟，進一步形成腈，最后一步是由糖基轉移酶催化的半氰醇的糖基化反應生成氰苷[15]。CYP450作為氰苷合成途徑中的第一步關鍵酶，在調控植物氰苷含量方面發揮著重要作用。前人研究表明，抑制CYP79D1與CYP79D2基因的表達會降低木薯中氰苷含量，從而降低木薯毒性[16]。因此，解析木薯氰苷類化合物代謝的分子機制，選育氰化物含量低的木薯品種，是木薯食用化利用的重要研究方向。

本研究以食用木薯品種SC9為材料，克隆MeCYP79D2基因并進行生物信息學分析，研究其在氰苷含量不同的木薯種質資源塊根中的表達情況，并對其在MeJA誘導下的表達量進行分析，初步分析氰苷代謝關鍵調控酶基因MeCYP79D2的序列及表達差異，以期為后續相關基因功能和調控機理研究奠定基礎。

1""材料與方法

1.1""材料

MeCYP79D2基因克隆供試材料為SC9木薯品種的葉片和塊根，基因熒光定量檢測供試材料為國家木薯種質資源圃保存的16份種質資源。主要試劑：與凝膠電泳有關試劑購自北京擎科生物科技有限公司；乙腈、甲酸購自海南冷港科技有限公司。主要儀器設備：基因擴增儀（TaKaRa，日本）、超微量分光光度計（Implen"N60，德國）、實時熒光定量PCR儀（Thermo，美國）和液相色譜儀（Agilent"1260，美國）。PCR引物合成和DNA測序由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2""方法

1.2.1""總RNA提取及cDNA合成""采用RNAprep"Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen）提取樣品總RNA，并用核酸檢測儀檢測其濃度和質量。待RNA質量檢測合格后，按照RevertAid"RT逆轉錄試劑盒（Thermo）說明書將總RNA反轉錄合成cDNA。

1.2.2""基因克隆""在NCBI數據庫（https：//www."ncbi.nlm.nih.gov/）中下載MeCYP79D2基因序列，利用Primer3Plus（https：//www.bioinformatics."nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi）在線軟件設計特異性擴增MeCYP79D2基因編碼區（CDS）序列的引物（5￠-ATGGCCATGAACGTCTCCAC-3￠和5￠-TCAAGGTGAAGTGGGGTAGA-3￠）。擴增體系為：cDNA模板2"μL、MeCYP79D2-F（10"μmol/L）0.5"μL、MeCYP79D2-R（10"umol/L）0.5"μL、Phanta"Max"Master"Mix（2×）23.5"μL、無菌水補足至50"μL。擴增程序：95"℃預變性5"min；95"℃"30"s，56"℃"30"s，72"℃"1"min，35個循環；72"℃"10"min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.3""生物信息學分析""對MeCYP79D2的同源序列、進化關系、蛋白理化性質、結構和功能等方面進行生物信息學分析，使用的數據庫和軟件見表1。

1.2.4""熒光定量PCR檢測""利用RNAprep"Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen）提取16份種質資源的塊根RNA。取1"μg"RNA，逆轉錄合成第一鏈cDNA，稀釋10倍后作為模板。使用Primer3Plus（https：//www.bioinformatics.nl/"cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi）在線軟件設計木薯MeCYP79D2基因的熒光定量PCR引物（正向引物：5'-ACTTCAGAGATCATTTC TCC AG CTA-3'，反向引物：5'-ACATTCTTGTT GC TC TT GTACTGGT-3'），選用MeActin為內參基因（正向引物：5'-TGATGAGTCTGGTC CATCCA-3'，反向引物：5'-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3'）。擴增體系（10"μL）：cDNA模板1"μL、10"μmol/L熒光定量PCR引物各0.2"μL、ChamQ"Universal"SYBR"qPCR"Master"Mix（2×）5"μL、ddH2O"3.6"μL。反應程序：95"℃預變性30"s；95"℃"10"s、60"℃"20"s，40個循環。每樣品設置3次重復。

1.2.5""氰化物含量的測定""參照王琴飛等[17]的方法利用高效液相色譜儀分析樣品中氰苷含量。色譜柱：Waters"Atlantic"C18，4.6"mm×150"mm，粒徑5"μm，柱溫25"℃。流動相：A為含0.1%甲酸的80%乙腈/水（V/V），B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序：起始時（0"min），A為10%，B為90%；15"min時，A和B均為50%；18"min時，A為100%，持續2"min；22"min時，A為10%，B為90%；平衡柱子5"min。流速為0.6"mL/min，漂移管溫度為95"℃，霧化溫度為80"℃，氣流速度為2.0"L/min，增益為3，進樣體積為10"μL。采用外標法計算樣品中亞麻苦苷和百脈根苷的含量。

1.3""數據處理

采用Excel"2016和SPSS"20.0軟件進行數據處理及分析。應用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，使用Tukey’s"HSD法進行顯著性測驗（Plt;0.05）。使用Graphpad（v8.0.2）繪制相基因對表達量和氰苷含量柱狀圖。

2""結果與分析

2.1""MeCYP79D2基因克隆

采用同源克隆策略，在NCBI數據庫中搜索獲得木薯品種Col22的MeCYP79D2基因cDNA全長1626"bp，編碼541個氨基酸。以木薯SC9葉片RNA為模板，擴增MeCYP79D2基因全長，將克隆得到的目的基因純化、測序后進行序列比對。MeCYP79D2基因編碼區長度為1625"bp，編碼528個氨基酸（圖1）。與Col22的MeCYP79D2基因核苷酸序列比對，在117和1560位置上存在單堿基突變，942位置上存在單堿基缺失，相似性達99.82%。蛋白質序列比對發現有192個位點存在差異，占比38.35%。

2.2""MeCYP79D2蛋白氨基酸序列比對及系統進化分析

在NCBI數據庫中對MeCYP79D2氨基酸序列保守結構域進行搜索，結果如圖2所示，MeCYP79D2包含細胞色素P450酶（cytoch ro me_"P450）結構域和CYP79結構域非特異性位點，屬于細胞色素P450酶超家族（cytochrome_P450"superfamily）。通過Blastp同源比對，發現木薯MeCYP79D2氨基酸序列（XP_021629850.1）與橡膠樹（Hevea"brasiliensis，XP_021674957.2）、麻風樹（Jatropha"curcas，AXF53803.1）、蓖麻（Ricinus"communis，XP_002534163.3）、水銀草（Mercurialis"annua，XP_050203649.1）、亞麻（Linum"usitatissimum，WAL01197.1）、雷公藤

（Tripterygium"wilfordii，XP_038697057.1）、大蒲桃（Syzygium"grande，KAI6691975.1）、蒜頭果（Malania"oleifera，XP_057972653.1）、大桉（Eucalyptus"grandis，XP_010030374.3）、番木瓜（Carica"papaya，XP_021887085.1）等的氨基酸序列相似性較高，分別為88.35%、77.45%、75.60%、70.85%、67.23%、68.74%、60.79%、62.57%、61.19%、59.47%。利用DNAMAN"7.0軟件對木薯MeCYP79D2氨基酸序列與上述10個物種進行序列比對，結果表明，不同物種的MeCYP79D2氨基酸序列具有較高的保守性，其中與橡膠樹和麻風樹相似度較高（圖3），說明MeCYP79D2基因的功能與橡膠樹和麻風樹的CYP79D2功能相似。

利用MEGA7.1[18]軟件中neighbor-joining法[19]將木薯MeCYP79D2氨基酸序列與其他10個物種構建同源進化樹（圖4），結果顯示，木薯與橡膠樹、麻風樹屬于同一分支，其中與橡膠樹在進化關系上最為接近，與序列比對結果一致。

2.3""MeCYP79D2蛋白理化性質預測

利用ProtParam在線軟件分析預測MeCYP79D2蛋白分子結構式為C2758H4366N742O781S27，相對分子量為61.28"kDa，理論等電點為8.90，預測該蛋白由541個氨基酸殘基組成，其中亮氨酸（Leu）比

例最高，為9.1%，半胱氨酸（Cys）比例較低，為1.3%；不穩定系數為40.40，脂肪系數為89.78，總平均親水性為?0.239，依據總平均親水性小于0為親水蛋白，推測MeCYP79D2蛋白為不穩定的脂溶性親水蛋白。

使用ProtScale在線工具對MeCYP79D2蛋白的親/疏水性進行預測分析，結果如圖5所示。第34位氨基酸得分最高，為2.100，疏水性最強，第445位氨基酸得分最低，為?2.063，親水性最強，第0～50位氨基酸有1個典型的疏水性區域，"該區域存在1個跨膜結構。通過TMHMM軟件預測發現MeCYP79D2蛋白的第1～18位氨基酸位于細胞膜內，第19～41位氨基酸之間有1個跨膜螺旋區，第42～541位氨基酸位于細胞膜外，推測MeCYP79D2蛋白是一個跨膜蛋白（圖6），與ProtScale預測的蛋白跨膜結構結果相符。SignalP預測結果顯示，MeCYP79D2蛋白不含信號肽。

采用NetPhos"3.1"Server軟件對MeCYP79D2蛋白的磷酸化修飾位點進行分析，結果如圖7所示。MeCYP79D2蛋白具有38個潛在磷酸化修飾位點，占氨基酸序列的7.0%，其中絲氨酸位點20個，蘇氨酸位點15個，酪氨酸位點3個，主要能被蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）、細胞分裂周期蛋白2（cdc2）和酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）等蛋白激酶磷酸化。

2.4""MeCYP79D2蛋白的二、三級結構分析

利用SOPMA軟件對MeCYP79D2蛋白二級結構進行預測，結果如圖8所示。MeCYP79D2蛋白主要以α-螺旋和不規則卷曲為主，分別為224個和197個，分別占氨基酸序列的45.10%和36.41%；另外還含有27個β-轉角和73個延伸鏈，分別占氨基酸序列的4.99%和13.49%。基于木薯CYP79D2的晶體結構（Q9M7B7.1A）對MeCYP79D2蛋白進行三級結構建模，結果如圖9所示，二者相似度為99.63%。

2.5""MeCYP79D2在木薯不同組織部位中的表達分析

基于前人轉錄組數據[20]，對MeCYP79D2在木薯葉片、中脈、腋芽、葉柄、莖尖、莖、體胚、脆性愈傷、塊根、須根、根尖等11個組織部位的相對表達情況進行分析，結果如圖10所示，MeCYP79D2基因在木薯腋芽、葉柄、塊根和須根中的表達量顯著高于其他組織。

2.6""不同木薯種質資源塊根中MeCYP79D2表達與氰苷含量關系分析

為探究MeCYP79D2在與氰苷含量的關系，取16份氰苷含量的不同的木薯種質資源的塊根，檢測其MeCYP79D2基因相對表達量和氰苷含量。結果表明，MeCYP79D2基因表達量與氰苷含量存在極顯著正相關，相關系數為0.692（圖11）。

2.7""MeCYP79D2基因在MeJA處理下的表達分析

用100"μmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）對SC9

木薯種莖進行水培處理，分別檢測處理0、3、6、9、12、24"h后MeCYP79D2基因在根、莖、葉中的表達情況及處理0、1、2、3"d后的氰苷含量變化。結果顯示，SC9根中MeCYP79D2基因的表達受MeJA誘導顯著上調（圖12A），且24"h后SC9根中氰苷含量極顯著升高，而莖和葉中氰苷含量分別于2～3"d后極顯著升高（圖12B），推測MeJA調控MeCYP79D2基因的表達來促進氰苷的合成。

3""討論

氰苷不僅是評判木薯能否食用的關鍵性狀，還是其塊根還原氮的重要來源，可影響氨基酸和蛋白質合成以及塊根組織損傷后，快速引發采后生理腐爛過程[16，"21-23]。植物中氰苷的合成、運輸和轉運是一個高度整合的過程，涉及不同組織和

器官中多種基因和酶的差異表達。在模式植物髙粱中發現氰苷的生物合成途徑，具體步驟如下：一是L-酪氨酸經CYP79A1催化后氮端羥基化，脫水、脫羧化生成相對應的對羥基苯乙醛肟；二是在CYP71E1的催化下，對羥基苯乙醛肟通過脫水和碳端羥基化，轉變為對羥基苯乙醛腈；三是在糖苷轉移酶UGT85B1的作用下，對羥基苯乙醛腈糖基化成為蜀黍苷[24]。不同研究表明，在木薯[25-26]、韭菜[27]、百脈根[28]中均發現了上述生物合成途徑。在不同種類的植物中，催化氰苷合成的酶不盡相同，但都是由CYP79同源基因編碼，且功能都具有相似性，木薯催化氰苷合成第一步的酶是CYP79D1和CYP79D2[22，"29]，CYP79D1和CYP79D2基因相似性為85%，與高粱CYP79A1序列具有54%的同源性。雖然CYP79D1和CYP79D2的表達相同，并且都可以使用纈氨酸和異亮氨酸作為底物，但纈氨酸的結合親和力高于異亮氨酸，因此在木薯中，亞麻苦苷是主要的氰苷成分，占95%以上[30]。且CYP79D1和CYP79D2活性被證實高于CYP71E7，在催化氰苷生物合成中具有限速作用[25]。此外參與氰苷運輸和代謝途徑的基因有多藥及毒素外排轉運蛋白MATE、硝酸鹽/肽轉運蛋白NPF、羥基腈裂解酶HNL等，在利用基因工程改造木薯氰苷含量，增強營養等方面具有重要意義[31]。

目前國內外尚未培育出葉片或塊根中完全不含氰苷的木薯品種[32]。研究表明，亞麻苦苷在葉片或部分在莖中合成，并通過莖韌皮部運輸到塊根，一部分儲存在液泡中，另一部分為氨基酸合成提供還原的氮源，塊根則不合成亞麻苦苷。MCMAHON等[31]提出基于庫源關系改良木薯品種中氰苷含量的分子策略，即通過阻斷亞麻苦苷合成的限速步驟CYP79D1和D2的催化，可將塊根中亞麻苦苷降低到安全水平。GOMEZ等[33]使用基因編輯技術對CYP79D1和CYP79D2進行敲除，得出CYP79D2的表達在亞麻苦苷合成中作用突出。本研究從食用品種SC9中克隆得到MeCYP79D2基因編碼序列，其cDNA全長1625"bp，編碼528個氨基酸，分子量為61.28"kDa，理論等電點為8.90。周偉堅等[34]克隆MeCYP79D2基因與數據庫中在核苷酸序列和氨基酸序列同源性達99%，本研究與數據庫比對，核苷酸序列相似性達99.82%，但氨基酸序列差異達38.35%，可能與克隆基因的品種差異有關。原曉龍等[35]也在蒜頭果中克隆出MoCYP79基因cDNA序列，與木薯中AAF27290.1和AAF27289.1蛋白聚為一類。本研究通過系統進化分析表明，MeCYP79D2與包括蒜頭果在內的10個物種距離相近，其中和橡膠和麻風樹關系最近。結構分析表明，MeCYP79D2基因屬于細胞色素P450酶超家族和CYP79結構域非特異性位點，含有一個保守的血紅素結合域，序列為FxxGxRxCxG[36]。生信分析結果顯示，該蛋白為為不穩定的脂溶性親水蛋白，存在一個跨膜結構，不含信號肽，具有38個潛在磷酸化修飾位點，二級結構主要以α-螺旋和不規則卷曲為主。MeCYP79D2主要在須根、葉柄、腋芽和塊根中表達。通過高氰苷含量與低氰苷含量的木薯種質資源中MeCYP79D2基因表達量與氰苷含量的相關性分析得出二者存在極顯著正相關，是否可以作為高氰和低氰品種的功能標記開發，有待進一步研究。

此外，氰苷在植物防御反應中起著重要作用，同時受外界干旱、低溫等環境及內源性激素變化的影響。茉莉酸及其衍生物茉莉酸甲酯（MeJA）是植物體內重要的脂質激素，參與調控生物脅迫和非生物脅迫下植物的生長發育過程[37]。茉莉酸含量的增加通常伴隨著防御相關基因的上調表達，產生具有防御功能的次級代謝產物，如萜類化合物、葡萄糖苷、黃酮類和花青素等[38-39]。昆蟲咬食和茉莉酸及其衍生物均可上調氰苷合成關鍵基因的表達[40-42]，表明氰苷的合成可能與茉莉酸密切相關。在本研究中，MeCYP79D2基因在MeJA作用下，表達量和氰苷含量均呈顯著性變化，說明MeCYP79D2基因參與茉莉酸激素的響應影響氰苷合成。以上結果為后續相關基因的功能研究奠定基礎，同時為深入研究木薯氰苷合成機制提供理論依據。

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