甘蔗磷酸丙糖/磷酸轉運蛋白基因ShTPT的克隆與表達分析

摘""要：磷酸丙糖/磷酸轉運蛋白（triose-phosphate/phosphate"translocator，"TPT）是一種磷酸丙糖轉運蛋白，在植物碳代謝途徑以及非生物脅迫中發揮重要作用。蔗糖具有廣泛的食用價值和重要的經濟價值，甘蔗是制糖的主要原料，蔗糖占中國產糖量的80%以上，因此實現甘蔗高產高抗目標至關重要。本研究以甘蔗品種新臺糖22號（ROC22）為材料，克隆獲得甘蔗磷酸丙糖/磷酸轉運蛋白基因ShTPT，利用生物信息學方法對ShTPT進行蛋白理化性質、保守結構域、跨膜結構預測和蛋白序列比對。結果顯示：ShTPT基因CDS全長1221"bp，編碼406個氨基酸，蛋白分子量為43.63"kDa，等電點（pI）為9.80，富含丙氨酸、亮氨酸，不穩定系數為42.51，親水系數為0.583，是一種不穩定的疏水性蛋白；ShTPT蛋白不含信號肽并具有9個跨膜結構域；保守結構域預測顯示ShTPT含有1個TPT結構域，符合TPT家族特征；進化分析結果顯示，ShTPT與高粱SbTPT（XP_002454867.1）、玉米ZmTPT（NP_001105497.1）聚在一起，同源性分別為97.04%和94.13%。進一步對ShTPT進行亞細胞定位分析發現ShTPT定位在葉綠體。甘蔗組織表達模式分析表明，ShTPT主要在葉片中表達，在根部和莖中的表達量極低。在PEG模擬的干旱脅迫條件下ShTPT的表達量表現出升-降-升的趨勢，表明其響應干旱脅迫。該研究結果表明ShTPT是一個定位于葉綠體的跨膜轉運蛋白，可能參與甘蔗葉片中的原初碳代謝化合物的轉運，響應干旱脅迫。本研究初步確定甘蔗ShTPT基因在葉片中碳同化物的轉運和非生物脅迫方面發揮重要作用，為進一步研究其功能提供理論依據。

關鍵詞：甘蔗；磷酸丙糖/磷酸轉運蛋白（TPT）；亞細胞定位；干旱脅迫；表達分析中圖分類號：S566.1""""""文獻標志碼：A

Cloning"and"Expression"Analysis"of"the"Phosphate"Triose/Phosphate"Transporter"Gene"ShTPT"in"Sugarcane

ZHAO"Xueting1，2，"ZHAO"Tingting1，2，"FENG"Cuilian1，2，"GAO"Liyan1，2，"LIN"Jishan1，2"FENG"Xiaoyan1，2，"WANG"Wenzhi1，2，"SHEN"Linbo1，2，"ZHANG"Shuzhen1，2，"WANG"Jungang1，2*

1."National"Key"Laboratory"for"Tropical"Crop"Breeding"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Institute"of"Tropical"Agricultural"Resources"/"Key"Laboratory"for"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops"of"Hainan"Province"/"Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Sanya，nbsp;Hainan"572024，"China

Abstract："The"triose-phosphate/phosphate"translocator"（triose-phosphate/phosphate"translocator，"TPT）"is"a"triose"phosphate"transporter"that"plays"an"important"role"in"plant"carbon"metabolism"pathways"as"well"as"abiotic"stresses."Sucrose"has"a"wide"range"of"edible"value"and"important"economic"value."Sugarcane"is"the"main"raw"material"for"sugar"production，"and"sucrose"from"sugarcane"accounts"for"more"than"80%"of"China's"sugar"production，"so"it"is"very"important"to"achieve"the"goal"of"high"yield"and"high"resistance"of"sugarcane."In"this"study，"the"sugarcane"variety"ROC22"was"used"as"the"material"to"clone"the"sugarcane"triose/phosphate"transporter"gene"ShTPT，"and"the"physicochemical"properties，"conserved"domains，"transmembrane"structure"prediction"and"protein"sequence"comparison"of"ShTPT"were"carried"out"by"bioinformatics"methods."The"results"showed"that"the"CDS"of"ShTPT"was"1221"bp，"encoding"406"amino"acids，"the"molecular"weight"of"the"protein"was"43.63"kDa，"and"the"isoelectric"point"（pI）"was"9.80."It"was"rich"in"alanine"and"leucine，"its"instability"coefficient"was"42.51，"and"its"hydrophilic"coefficient"was"0.583，"which"was"an"unstable"hydrophobic"protein."ShTPT"did"not"contain"signal"peptides"but"had"9"transmembrane"domains."Conserved"domain"prediction"showed"that"ShTPT"contained"a"tpt"domain，"which"was"consistent"with"the"characteristics"of"the"TPT"family."The"results"of"phylogenetic"analysis"showed"that"ShTPT"was"clustered"with"Sorghum"bicolor"SbTPT"（XP_002454867.1）"and"Zea"mays"ZmTPT"（NP_001105497.1）"with"homology"of"97.04%"and"94.13%，"respectively."Further"subcellular"localization"analysis"of"ShTPT"showed"that"ShTPT"was"localized"in"chloroplasts."Tissue"expression"pattern"analysis"of"sugarcane"showed"that"ShTPT"was"mainly"expressed"in"leaves，"and"the"expression"level"in"roots"and"stems"was"very"low."Under"the"drought"stress"conditions"simulated"by"PEG，"the"expression"of"ShTPT"showed"an"upward"trend，"indicating"that"it"responded"to"drought"stress."The"results"of"this"study"suggest"that"ShTPT"is"a"chloroplast-localized"transmembrane"transporter，"which"may"be"involved"in"the"transport"of"primary"carbon"metabolic"compounds"in"sugarcane"leaves"and"responsive"to"drought"stress."This"study"preliminarily"determined"that"ShTPT"gene"plays"an"important"role"in"the"transport"of"carbon"assimilates"in"leaves"and"abiotic"stress，"which"provides"a"theoretical"basis"for"further"study"of"its"function.

Keywords："sugarcane;"triose-phosphate"/"phosph"ate"translocator"（TPT）;"subcellular"localization;"drought"stress;"expression"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.11.004

光合器官通過卡爾文循環將CO2同化為有機化合物，為地球上所有生命提供必不可少的基礎物質。在植物和藻類中，固定的碳以磷酸丙糖的形式通過磷酸丙糖轉運體（triose-phosphate/"phosphate"translocator，"TPT）從葉綠體輸出。TPT在葉綠體內膜上催化無機磷酸鹽（Pi）與三磷酸甘油醛（3-GAP）、二羥丙酮磷酸（DHAP）與3-磷酸甘油醛等三磷酸酯的交換運輸[1-4]，磷酸丙糖轉運體屬于質體磷酸鹽轉運體（pPTs）家族，能夠與Pi對向轉運磷酸化C3、C5和C6化合物[5]，其成員在所有光合生物真核生物和其他具有質體的生物中廣泛分布，多數被子植物基因組中有2個TPT基因，而莧科（Amaranthaceae）和十字花科（Brassicaceae）物質只有1個TPT基因[6-7]。陸生植物擁有4個pPT亞型，包括磷酸丙糖/磷酸轉運體（TPT）、磷酸烯醇丙酮/磷酸轉運體（PPT）、葡萄糖-6-磷酸/磷酸轉運體（GPT）和木糖醇-5-磷酸/磷酸轉運體（XPT），分別轉運不同的糖磷酸并在各種代謝途徑中發揮關鍵作用[8-9]，因此它們被視為用于改善作物產量的基因操縱的主要目標[10-11]。

在過去的幾十年里，對TPT的生理功能進行了比較詳細的研究。通過敲除植物體內TPT基因和減少其表達量，發現植株的表型均無明顯的變化。進一步的研究發現，TPT活性降低能夠促進同化物向臨時儲存淀粉轉化，并在光照階段同時增加淀粉的轉化率，從而彌補了TPT活性的缺失，此過程代謝中間產物釋放無機磷（Pi），以維持光合碳同化過程[12-14]。而在水稻（Oryza"sativa）的突變TPT基因植株葉片中蔗糖濃度升高、淀粉和可溶性糖含量減少、植物光合速率降低，且植株生長矮小，表明通過臨時淀粉儲存不能補償水稻TPT突變帶來的影響[4]。

甘蔗（Saccharum"spp.）葉片淀粉含量相對較低，因此可能無法利用這種淀粉儲備來循環Pi以緩解當蔗糖合成受限時的光合抑制。在本研究中，基于本課題組前期的轉錄組數據，從新臺糖22號（ROC22）中克隆得到磷酸丙糖轉運體基因ShTPT，利用生物信息學方法對該基因的理化性質進行預測，并分析其亞細胞定位情況。同時，采用qRT-PCR技術分析ShTPT基因在干旱和非生物脅迫條件下的表達模式，以期探明ShTPT與光合作用直接的關系。本研究結果將為甘蔗抗逆性遺傳改良提供重要的基因資源。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料""供試材料為甘蔗品種新臺糖22號（ROC22）。基因表達分析材料為ROC22成熟期苗，種植于中國熱帶農業科學院文昌基地；PEG脅迫處理材料為ROC22組培苗，由本實驗室提供。所有材料均用液氮速凍備用。

1.1.2""載體及菌株""DH5ɑ感受態購自上海唯地生物技術有限公司，pMD-19T購自TaKaRa公司，pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp為本實驗室保存。

1.2""方法

1.2.1""ShTPT基因全長CDS克隆""取0.1"g"ROC22葉片，充分研磨，利用Omega公司RNA提取試劑盒提取總RNA，并用RevertAid"First"Strand"cDNA"Synthesis"Kit（Thermo"Scientific）合成cDNA第一鏈，具體方法參照試劑盒說明書，-20"℃保存。根據甘蔗轉錄組數據利用NCBI網站設計特異性引物ShTPT-F/R（表1），以cDNA為模板，利用高保真酶2×Phanta"Max"Master"Mix（Vazyme）進行PCR擴增，反應程序：95"℃"1"min"；95"℃"20"s，58"℃"30"s，72"℃"1"min，35個循環；72"℃"10"min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，回收純化后利用TA克隆與pMD-19T載體連接，轉化DH5α大腸桿菌感受態，通過氨芐霉素篩選以及菌液PCR進行驗證，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。

1.2.2""ShTPT生物信息學分析""對獲得的ShTPT序列進行生物信息學分析。利用SnapGene軟件得到ShTPT氨基酸序列，在NCBI網站進行序列相似性比對后用DNAMAN軟件進行多重序列比對，進一步用最大似然法在MEGA"7.0軟件中構建系統進化樹。用Prot"Param（http：//web.ex pasy.org/"protparam）在線軟件推導ShTPT蛋白的分子質量等理化性質，并用NPSA-PRABI（https：//"npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/

NPSA/npsa_server.html）和SWISS-MODEL（https：//"swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件對其二級結構和三級結構進行預測。用NetPhos"3.1"Server軟件對ShTPT進行磷酸化位點預測。

1.2.3""構建ShTPT-GFP融合表達載體對ShTPT進行亞細胞定位""設計ShTPT開放閱讀框擴增引物ShTPT-G-F/R（表1），引物兩端引入Bsa"I酶切位點，下游引物去除終止密碼子，以ShTPT-19T為模板，經PCR擴增后酶切，與線性化的pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp質粒連接，轉化大腸桿菌后通過卡那霉素篩選，PCR鑒定后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

將水稻培養至7～15日齡，按照YOO等[15]方法提取水稻葉片的原生質體，將構建好的"pBWA（V）HS-ShTPT-GLosgfp融合質粒轉入原生質體進行瞬時表達，最后通過激光共聚焦顯微鏡（Nikon，"C2-ER）進觀察ShTPT蛋白亞細胞定位結果并拍照。

1.2.4""甘蔗ShTPT的差異表達分析""選用田間生長至成熟期的ROC22植株研究ShTPT在甘蔗不同部位的表達情況，分別取其-1葉（IL）、+1葉（ML）、1-2節莖（S1）、4-5節莖（S2）、7-8節莖（S3）、10-11節莖（S4）、12-13節莖（S5）、14-15節莖（S6）和根（RS）。干旱脅迫處理選用生長至6～7葉的ROC22甘蔗組培苗，在含有20%"PEG6000的MS液中進行脅迫處理，處理時間分別為0、6、12、24、48、72、96"h時取樣，整株取樣后迅速用液氮固定。每個處理設置3個生物學重復，樣品的總RNA提取及反轉錄方法同1.2.1。

根據獲得的ShTPT序列設計特異引物ShTPT-"Q-F/R（表1），以磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）為內參基因并設計甘蔗內參引物GADPH-F/R（表1）。利用Roche羅氏qPCR儀Light"Cycler"96進行RT-qPCR，反應體系：2×Q3"SYBR"qPCR"Master"Mix"10"μL、上/下游引物（10"μmol/L）各0.4"μL、cDNA模板1"μL、ddH2O"7"μL。反應程序：95"℃"2"min；95"℃"10"s，58"℃"30"s，72"℃"30"s，40個循環。每個樣品設置3個重復。根據2-??Ct公式計算ShTPT相對表達量。采用IBM"SPSS"Statistics"25軟件通過單因素的方差分析對ShTPT的表達水平的差異顯著性進行檢驗。

2""結果與分析

2.1""ShTPT基因克隆

以甘蔗品種ROC22葉片的cDNA為模板，利用特異性引物進行擴增，獲得1300"bp左右的條帶（圖1）。測序結果顯示其與參照序列一致。利用BioMX"2.6軟件對ShTPT核酸序列進行分析，CDS長1221"bp，編碼406個氨基酸。

2.2""生物信息學分析

通過ProtParam在線軟件對ShTPT蛋白進行理化性質分析，結果顯示，ShTPT蛋白分子量為43.63"kDa，等電點（pI）為9.80，分子式C2038H3184"N512O526S11，含有丙氨酸（13.8%）、亮氨酸（11.3%）等20種氨基酸，不穩定系數為42.51，親水系數為0.583，是一種不穩定的疏水性蛋白。

ShTPT蛋白具有一個TPT結構域，起止氨基酸為103—401位，ShTPT蛋白具有植物TPT家族特有的典型保守區域（圖2）。在NCBI網站下載其同源序列進行比對發現，甘蔗ShTPT與高粱SbTPT、水稻OsTPT、柳枝稷PvTPT、玉米ZmTPT等蛋白都具有相同的保守結構域，但不同物種之間存在少數氨基酸的差異，其中甘蔗ShTPT與高粱SbTPT同源性達到97.04%（圖3）。

蛋白二級結構預測結果顯示，ShTPT蛋白中的α-螺旋（alpha"helix，"Hh）占比51.48%，無規則卷曲（random"coil，"Cc）占比40.39%，延伸鏈（extended"strand，"Ee）占比8.13%，無β-轉角（beta"turn，Tt）和其他元件（圖4）。

蛋白三級結構預測結果顯示ShTPT具有跨膜結構，包含α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈，且主要以α-螺旋的形式完成跨膜（圖5），與蛋白二級結構預測結果一致。

利用在線軟件TMHHM對ShTPT蛋白的跨膜結構進行預測，發現其具有9個典型的跨膜結構域（圖6A），與ShTPT三級結構預測結果一致。利用SignalP-5.0在線軟件進行信號肽預測結果顯示該蛋白不含有信號肽結構，表明ShTPT是一個不具有信號肽的跨膜蛋白。

對ShTPT磷酸化進行位點分析發現，ShTPT蛋白有20個Ser（絲氨酸）位點、9個Thr（蘇氨酸）位點、2個Tyr（酪氨酸）位點可發生磷酸化修飾（圖6B），推測ShTPT翻譯后可能通過磷酸化修飾發揮其功能。

2.3""ShTPT蛋白的系統進化分析

通過Blast比對在數據庫中獲取了10條與甘蔗ShTPT蛋白同源性較高的蛋白序列，使用MEHA"7.0軟件通過鄰接法（neighbor-joining"algorithm）構建系統進化樹。聚類結果表明，甘蔗ShTPT與高粱SbTPT同源性極高，被聚類在一小支，序列比對后發現同源性高達97.04%。另外ShTPT與同屬禾本科的玉米ZmTPT、粟SiTPT、黍PmTPT、柳枝稷PvTPT、水稻OsTPT、小麥TaTPT的親緣關系較近，被聚類在同一簇中。而屬于雙子葉植物的豌豆PsTPT、擬南芥AtTPT與菠菜SoTPT則被聚類于另一簇，與甘蔗ShTPT親緣關系較遠（圖7）。

2.4""ShTPT亞細胞定位

利用Plant-mPLoc在線網站預測ShTPT的亞細胞定位，結果顯示甘蔗ShTPT定位在葉綠體。為了驗證預測結果，構建了pBWA（V）HS-"ShTPT-GLosgfp融合表達載體，與pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp（對照）分別轉入水稻原生質體進行瞬時表達，研究ShTPT的亞細胞定位。結果顯示，含GFP空載體使水稻原生質體的細胞核、細胞膜、葉綠體等部位均有熒光，ShTPT-GFP融合蛋白只在葉綠體部位發出熒光（圖8），表明ShTPT是一種葉綠體定位蛋白，與預測結果一致。

2.5""ShTPT基因的表達分析

通過對甘蔗ShTPT基因進行熒光定量PCR分析發現，該基因主要在甘蔗葉片中表達，在莖和根中的表達量極低（圖9）。在20%"PEG6000模擬的干旱脅迫下，ShTPT的表達呈現升-降-升的趨勢，在24"h達到最高，為0"h表達量的2.2倍，48"h時降為0"h的1.3倍，96"h"時又回升至0"h的2倍以上（圖10）。表明ShTPT響應干旱脅迫。

3""討論

植物中缺乏TPT引起的效應幾乎可以通過植物夜間淀粉的轉化途徑完全補償，該途徑促使淀粉降解為葡萄糖和麥芽糖的形式，并通過麥芽糖轉運蛋白（MEX1）和葡萄糖轉運蛋白（pGlcT）輸出葉綠體[16-17]。此外，在植物中，淀粉的降解也可能發生在光照時期，與淀粉的合成同時進行[13-14]。與藻類相比，植物細胞運輸固定碳的能力似乎更為靈活，且大多數被子植物一般含有較多數量的pPTs（5～16個）[7]，擬南芥有6個pPTs，包括1個TPT、2個GPTs、2個PPTs、1個XPT[7]，而藻類有4個pPTs，其中有2個TPTs，1個推測的PPT，以及1個推測的GPT/XPT[18]。TPTs白天在植物葉綠體中導出碳的過程中發揮著重要作用，而XPT已被證明在中低光和高光條件下運輸三磷酸甘油醛，并在一定程度上補償了TPT功能的喪失[9，"19]，因此植物中固定碳輸出的途徑是相互合作的，涉及使用各種糖、糖磷酸和三磷酸甘油醛的轉運蛋白，而干旱脅迫可能對碳同化代謝途徑產生影響，從而調控磷酸丙糖轉運體的表達。

本研究從甘蔗品種ROC22中克隆了含有完整cDNA序列的ShTPT基因，對其編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析發現，ShTPT蛋白具有1個TPT結構域，具有植物TPT家族特有的典型保守區域。ShTPT的亞細胞定位結果也顯示此蛋白定位在葉綠體，在葉片中表達高，此與其他作物的研究結果一致，可能能夠快速響應非生物脅迫[20-21]。干旱脅迫降低了光合速率，同時卡爾文循環相關基因下調，碳的同化效率下降，參與碳水化合物代謝的干旱響應基因HxK、FK、SuT、GPT、FBPA、SuS、SPP、PFP均發生顯著的變化[22-24]，碳同化的減少將減少從葉綠體到細胞質的三磷酸鹽的輸出，而在睡茄（Withania"somnifera）中磷酸丙糖轉運體的基因在干旱脅迫早期和后期的葉片中顯著下調。這表明在干旱脅迫下，對三磷酸鹽輸出的需求減少[21]。而本研究中發現，干旱脅迫后磷酸丙糖轉運體基因呈現先升后降的趨勢，和其他研究有些不同。甘蔗為異源同源多倍體，相同的基因家族可能存在協同機制，相同的功能蛋白不同的基因表達存在差異，在玉米（Zea"mays）的干旱處理磷酸丙糖轉運體基因表達也出現不一致的趨勢[20]，另外甘蔗為葉片淀粉含量較低的單子葉植物，不同物種磷酸丙糖轉運體功能可能會體現不同的差異性，如水稻中磷酸丙糖轉運體突變能夠造就表型的巨大變化，而在擬南芥（Arabidopsis"thaliana）和煙草（Nicotiana"tabacum）中沒有觀測到此變化[4，"25]。以上結果可以推測甘蔗ShTPT可能參與甘蔗干旱和鹽脅迫應答，而其作用機制有可能有其特異性，下一步對其功能的詳細解析，將來可作為甘蔗抗旱性工程的候選新基因。

本研究在甘蔗中克隆ShTPT基因，對其基因序列及對應蛋白結構進行解析，并對其在甘蔗不同組織部位中的表達以及干旱條件下的表達模式進行探究，為后續甘蔗高產抗逆育種提供參考。

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