寧夏部分地區哺乳期奶犢牛群中腹瀉相關病原流行病學調查

摘 要 為了解寧夏地區哺乳期奶犢牛群中腹瀉相關病原的流行情況，采用PCR和RT-PCR法對采自寧夏4個地區、18個規模化奶牛場的334份哺乳期犢牛糞便樣品分別進行牛輪狀病毒（Bovine rotavirus， BRV）、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛諾如病毒（Bovine norovirus， BNoV）、牛紐布病毒、牛星狀病毒、牛環曲病毒、牛嵴病毒（Bovine kobuvirus， BKoV）、牛腸道病毒、隱孢子蟲、艾美耳球蟲、賈第鞭毛蟲、K99型大腸桿菌和沙門氏菌14種腹瀉相關病原的檢測，并對各種病原的流行特點和主要流行病原的遺傳進化關系進行分析。結果顯示，從寧夏地區哺乳犢牛糞便中共檢出13種腹瀉相關病原，其中隱孢子蟲（38.02%）、BRV（19.76%）、BKoV（18.56%）和BNoV（13.77%）檢出率較高，隱孢子蟲、BRV和BKoV在腹瀉犢牛糞便中的檢出率顯著高于健康犢牛（Plt;0.05）。單一病原感染類型占比顯著高于兩種或兩種以上病原混合感染的類型（Plt;" 0.05）。在寧夏4個地區、3個季節采集的樣品中，隱孢子蟲、BRV、BKoV和BNoV檢出率相對較高，在1～30日齡犢牛群中隱孢子蟲、BRV和BKoV檢出率較高，在31～60日齡犢牛中隱孢子蟲和BNoV檢出率較高，在60日齡以上的哺乳犢牛中BKoV、BEV和隱孢子蟲檢出率較高。遺傳進化分析結果顯示，哺乳犢牛感染的隱孢子蟲主要為微小隱孢子蟲，BRV主要為A型輪狀病毒，BKoV主要為B型愛知病毒，BNoV主要為GIII.2型諾如病毒。以上結果表明，隱孢子蟲、BRV、BKoV和BNoV是寧夏地區哺乳期奶犢牛群中主要流行的腹瀉相關病原，并與犢牛腹瀉的發生關系密切。單一病原感染是哺乳期奶犢牛腹瀉相關病原感染的主要類型。犢牛感染的病原種類與季節和日齡關系密切。

關鍵詞 哺乳期奶犢牛；犢牛腹瀉；病原；流行病學調查

犢牛腹瀉是哺乳期犢牛群中的一種常見疾病，引發犢牛腹瀉因素眾多，其中腸道病原感染（病毒、寄生蟲、細菌）是引起犢牛腹瀉的最主要原因之一［1］。牛輪狀病毒（Bovine rotavirus， BRV）、牛冠狀病毒（Bovine coronavirus， BCoV）、牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus， BVDV）、隱孢子蟲、球蟲、賈第鞭毛蟲、大腸桿菌和沙門氏菌等是常見的與犢牛腹瀉相關的病原［2-3］。此外，一些新發的腸道病原，如牛諾如病毒（Bovine norovirus， BNoV）、牛紐布病毒（Bovine nebovirus， BNeV）、牛星狀病毒（Bovine astrovirus， BAstV）、牛環曲病毒（Bovine torovirus， BToV）、牛嵴病毒（Bovine kobuvirus， BKoV）、牛腸道病毒（Bovine enterovirus， BEV）等在近年來也多有報道［2， 4-6］。

寧夏地區是中國重要的奶牛和肉牛養殖地區之一，犢牛腹瀉問題嚴重影響了當地畜牧業的健康發展。王文佳等［7］、高海慧等［8］、黎玉瓊等［9］先后對寧夏地區犢牛群中常見腹瀉病原進行調查。結果顯示BRV檢出率為32.28%～" 43.16%，隱孢子蟲檢出率為25.20%～40.00%，BRV和隱孢子蟲是引起犢牛腹瀉的主要病原。但上述研究沒有明確區分犢牛的生長階段，也沒有對新發病原進行檢測。據報道，哺乳期與斷奶后犢牛感染的病原類型和腹瀉的發病情況存在較大差異［10］。郭仕輝等［11］于2019年對寧夏地區新生犢牛腹瀉相關病原進行調查分析，發現與新生犢牛腹瀉相關的病原主要有BRV（19.80%）、BCoV牛冠狀病毒（9.43%）、BNoV（12.26%）和隱孢子蟲" （6.60%），主要流行病原在30日齡內的犢牛中檢出率較高。牛曉昊［12］于2021年對寧夏地區奶牛場進行4種腸道病原檢測，發現在0～2月齡犢牛中隱孢子蟲檢出率最高（35.24%），在3～4月齡犢牛中艾美耳球蟲檢出率最高" （31.00%）。這表明犢牛群易感病原種類與犢牛日齡相關。目前，關于寧夏地區奶犢牛群中腹瀉相關病原的流行病學研究主要還是集中在對BRV、隱孢子蟲等幾種引起犢牛腹瀉常見病原的調查，對于一些新發病原，如BEV、BNeV、BAstV、BToV、BKoV等在犢牛群中的流行情況仍不清楚。

本研究采集寧夏4個主要奶牛養殖市區、18個規模化奶牛養殖場的哺乳期犢牛糞便樣品，采用PCR和RT-PCR對采集的樣品進行14種與犢牛腹瀉相關的病原檢測，并對犢牛群中主要流行病原進行遺傳進化分析，以期為寧夏地區犢牛腹瀉的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021年7月至2022年7月，從寧夏回族自治區4個主要奶牛養殖區（銀川市、吳忠市、石嘴山市、中衛市）的18 個規模化奶牛養殖場內采集334 份哺乳期犢牛糞便樣品。其中腹瀉樣品218 份，正常樣品116 份（表1）。銀川市樣品202 份，石嘴山市29 份，吳忠市78 份，中衛市25份；1～30日齡犢牛樣品279 份，31～60 日齡犢牛樣品43 份，60 日齡以上犢牛樣品12 份；春季（3月-5月）樣品133 份；夏季（6月-8月）樣品122 份；秋季（9月-11月）樣品0 份；冬季（12月-2月）樣品79 份。

1.2 引物合成與陽性質粒構建

參照文獻報道分別合成檢測BRV［13］、BCoV［14］、BVDV［13］、BNoV［14］、BNeV［15］、BAstV［16］、BToV［16］、BKoV［17］、BEV［18］、隱孢子蟲（Cryptosporidium spp.）［19］、艾美耳球蟲（Eimeria spp.）［20］、賈第鞭毛蟲（Giardia spp.）［21］、K99型大腸桿菌（E.coli K99）［22］和沙門氏菌（Salmonella spp.）［23］ 14 種病原的引物（表 2）。以從寧夏大學動物科技學院臨床獸醫學重點學科實驗室保存的陽性樣品中所提取的核酸為模板，分別構建14 種病原相應基因的重組陽性質粒，并對構建好的重組陽性質粒進行PCR和測序鑒定。

1.3 樣品處理與核酸提取

將每個集糞管中樣品分出兩份用于DNA和RNA提取，將剩余的樣品置于-80 ℃超低溫冰箱保存。1份樣品按照糞便DNA提取試劑盒（Stool DNA Kit， OMEGA）操作說明提取糞便中DNA，將提取的DNA置于-80 ℃超低溫冰箱保存，備用。取1份糞便樣品，按1∶4比例加入PBS溶液后漩渦振蕩，放入-80 ℃超低溫冰箱反復凍融3 次，于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，轉移800 μL上清至新的1.5 mL無菌無酶離心管中。按照RNA提取試劑盒（RNAiso Plus， Takara）操作說明提取總RNA，將提取的總RNA使用反轉錄試劑盒（HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit， Vazyme）反轉錄為cDNA，置于" -80 ℃超低溫冰箱保存，備用。

1.4 PCR和PT-PCR檢測

以提取的DNA和cDNA為模板，同時設置以無菌ddH2O為模板的陰性對照和以構建的重組陽性質粒為模板的陽性對照，進行PCR和RT-PCR檢測。在加入GelRedTM的1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測PCR擴增產物，并通過凝膠成像系統觀察。

1.5 主要病原遺傳進化分析

分別參照BRV"" VP6基因［13］、BNoV RdRp基因［14］、BKoV 3D基因［17］、隱孢子蟲SSU rRNA基因［24］等合成引物（表3），隨機選取部分病原檢測呈陽性的樣品進行PCR擴增，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit， OMEGA）對PCR擴增產物進行回收純化。將回收純化產物送上海生工生物技術有限公司采用Sanger法進行測序。將測得序列使用DNAstar（DNAstar 7.0）軟件進行拼接，在NCBI數據庫中進行BLAST比對。使用MEGA X軟件中的" Alignment程序進行多序列比對，根據多序列比對結果，采用DNAstar軟件中的Megalign程序進行核苷酸序列一致性分析。使用MEGA X軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹，步長檢驗為1 000次。

1.6 統計分析

使用Excel 2019軟件對病原檢測結果進行統計，采用SPSS軟件（IBM SPSS Statistics"" v 25.0）中卡方檢驗對不同病原檢出率及組間差異進行顯著性分析，并使用GraphPad Prism（GraphPad Prism 8.0.1）進行繪圖。Plt;0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 重組陽性質粒鑒定

分別以14種病原重組陽性質粒為模板進行PCR鑒定，結果表明（圖1），均擴增到與預期片段大小一致的目的條帶。對重組陽性質粒測序序列進行BLAST比對，結果與預期相符。

2.2 病原檢測結果

2.2.1 病原檢測結果概覽 對采集的334份犢牛糞便樣品利用PCR和RT-PCR方法進行14種病原檢測，共檢測出13種病原，結果表明（表4），除沙門氏菌未檢出外，BVDV、BRV、BCoV、BNoV、BNeV、BAstV、BToV、BKoV、BEV、艾美耳球蟲、隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、E.coli K99的平均檢出率分別為" 0.60%、19.76%、11.38%、" 13.77%、 0.30%、10.48%、5.69%、18.56%、" 1.20%、" 5.69%、38.02%、" 5.39%、5.69%。在檢測的病毒性病原中，BRV檢出率最高" （19.76%），BKoV檢出率次之（18.56%），BVDV檢出率最低（0.60%）；在檢測的寄生蟲性病原中，隱孢子蟲檢出率最高（38.02%），賈第鞭毛蟲檢出率最低（5.39%）；在檢測的細菌性病原中，僅檢測出E.coli K99" （5.69%）。通過對檢出率進行卡方檢驗發現，隱孢子蟲平均檢出率顯著高于其他12種病原（Plt;0.05）；BRV、BNoV與BKoV之間檢出率差異不顯著（Pgt;" 0.05），但與其他病原檢出率存在顯著差異（Plt;0.05）。對正常犢牛糞便樣品和腹瀉犢牛糞便樣品中病原檢出率進行卡方檢驗，結果顯示，腹瀉犢牛糞便樣品中BRV、BKoV和隱孢子蟲檢出率顯著高于正常樣品" （Plt;0.05） （圖2）。

2.2.2 病原感染類型分析結果 對采集的樣品進行病原感染類型統計分析，發現單一病原感染類型占比為42.22%，分別顯著高于兩種或多種病原混合感染類型（Plt;0.05）（圖3）；混合感染類型中兩種病原混合感染類型（23.05%）顯著高于兩種以上病原混合感染類型（Plt;0.05）。單一病原感染類型中，隱孢子蟲檢出率最高為14.37%，BRV（5.69%）和BNoV（5.69%）次之，BEV檢出率最低為0.30%。

2.2.3 不同地區樣品病原檢測結果 對采集的樣品按照不同地區進行病原檢出率分析（表5），銀川市樣品中隱孢子蟲（37.62%）、BRV" （21.78%）和BKoV（16.34%）平均檢出率較高，BVDV平均檢出率最低（0.50%），BNeV和BEV均未檢出；吳忠市樣品中隱孢子蟲（29.49%）、BKoV（23.08%）和BNoV（17.95%）平均檢出率較高，BVDV（1.28%）和BNeV（1.28%）平均檢出率最低；石嘴山市樣品中隱孢子蟲（31.03%）、BRV（31.03%）、BKoV" （13.79%）和BNoV" （13.79%）平均檢出率較高，BVDV平均檢出率最低（0.50%），BVDV、BNeV、BToV、BEV和艾美耳球蟲均未檢出；中衛市樣品中隱孢子蟲" （76.00%）、BAstV（28.00%）、BKoV（28.00%）、BRV（24.00%）和艾美耳球蟲（24.00%）平均檢出率較高，BNoV和BToV平均檢出率最低" （4.00%），BVDV、BNeV、BEV和E.coli K99均未檢出。

2.2.4 不同季節樣品病原檢測結果 對采集的樣品按照不同季節進行病原檢出率分析（表6），在春季采集的樣品中，隱孢子蟲（32.33%）、BRV（16.54%）、BNoV（15.04%）和BKoV（14.29%）平均檢出率較高，BVDV和艾美耳球蟲平均檢出率最低（0.75%），BNeV和BEV均未檢出；在夏季采集的樣品中，隱孢子蟲（30.33%）、BKoV（20.49%）、BRV（18.85%）和BNoV（18.03%）平均檢出率較高，BNeV平均檢出率最低（0.82%），BVDV未檢出；在冬季采集的樣品中，隱孢子蟲（59.49%）、BRV（26.58%）、BKoV（22.78%）、BAstV（22.78%）和艾美耳球蟲（20.25%）平均檢出率較高，BVDV平均檢出率最低（1.26%），BNeV、BEV和E coli K99均未檢出。

2.2.5 不同日齡樣品病原檢測結果 對采集的樣品按照不同日齡進行病原檢出率分析（表7），在1～30日齡段樣品中，隱孢子蟲（40.14%）、BRV（22.58%）和BKoV（18.28%）平均檢出率較高，BVDV平均檢出率最低（0.36%），BEV未檢出；在31～60日齡段樣品中，隱孢子蟲（25.58%）和BNoV（20.93%）平均檢出率較高，BVDV、艾美耳球蟲和賈第鞭毛蟲平均檢出率最低" （2.33%），BNeV和BEV均未檢出；在60日齡以上樣品中，BKoV（58.33%）、BEV（33.33%）和隱孢子蟲（33.33%）平均檢出率較高，BRV、BCoV和賈第鞭毛蟲平均檢出率最低（8.33%），BVDV、BNoV、BNeV和BAstV均未檢出。

2.3 主要病原遺傳進化分析結果

2.3.1 BRV遺傳進化分析結果 隨機選取10份檢測結果陽性的樣品進行BRV" VP6基因擴增和序列分析。結果顯示，10條BRV"" VP6基因核苷酸序列一致性為93.4%～99.9%（圖4-A），與GenBank中公布RV-A型核苷酸序列一致性為94.4%～98.1%。BRV"" VP6基因系統發育分析結果顯示（圖4-B），10條BRV序列均與GenBank中公布的RV-A群聚為同一個大分支，親緣關系較近；與RV-B群和RV-C群處于不同分支，親緣關系較遠。

2.3.2 BNoV遺傳進化分析結果 隨機選取6份檢測結果陽性的樣品進行BNoV RdRp基因擴增和序列分析，結果顯示，6條BNoV RdRp基因核苷酸序列一致性為92.6%～99.0%（圖5-A），與GeneBank中已公布的NoV GIII.2型核苷酸序列一致性為92.2%～99.1%。BNoV RdRp基因系統發育樹結果表明（圖5-B），6條BNoV序列均與GeneBank中已公布的NoV GIII.2型聚為同一個大分支，親緣關系較近；與NoV GI型、NoV GII型、NoV GIII.1型、NoV GIV型、NoV GV型處于不同分支，親緣關系較遠。

2.3.3 BKoV遺傳進化分析結果 隨機選取8份檢測結果陽性的樣品進行BKoV 3D基因擴增和序列分析，結果顯示，8條BKoV 3D基因核苷酸序列一致性為91.5%～99.6%（圖6-A），與GeneBank中已公布的BKoV核苷酸序列一致性為89.3%～98.5%。BKoV 3D基因系統發育樹表明（圖6-B），8條BKoV序列均與GeneBank中已公布的B型BKoV聚為同一個大支，親緣關系較近；與PKoV和CaKoV處于不同分支，親緣關系較遠。

2.3.4 隱孢子蟲遺傳進化分析結果 隨機選取6 份檢測結果陽性的樣品進行隱孢子蟲SSU rRNA基因擴增和序列分析，結果顯示，6 條隱孢子蟲SSU rRNA基因核苷酸序列的一致性為" 99.7%～100%（圖7-A），與GeneBank中已公布的C. parvum核苷酸序列一致性分別為85.1%～" 90.8%。隱孢子蟲SSU rRNA基因系統發育樹表明（圖7-B），6條隱孢子蟲序列均與GeneBank中已公布的微小隱孢子蟲（C. parvum）聚為同一個大分支，親緣關系較近；與牛隱孢子蟲（C. bovis）、安氏隱孢子蟲（C. andersoni）和瑞氏隱孢子蟲（C. ryanae）處于不同分支，親緣關系較遠。

3 討 論

3.1 寧夏地區哺乳期奶犢牛群中腹瀉相關病原流行特點

通過對采集自寧夏4個奶牛養殖市區、18個規模化奶牛養殖場的哺乳期奶犢牛糞便樣品進行14種病原檢測，共檢出BVDV、BRV、BCoV、BNoV、BNeV、BAstV、BToV、BKoV、BEV、艾美耳球蟲、隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲和E.coli K99"" 13種病原。隱孢子蟲（38.02%）、BRV" （19.76%）、BNoV（13.77%）和BKoV（18.56%）檢出率顯著高于其他病原，是哺乳期奶犢牛群中主要流行病原。黎玉瓊等［9］在對寧夏地區奶犢牛進行腹瀉病原調查中發現，隱孢子蟲（40.00%）和BRV（43.16%）在腹瀉犢牛中檢出率較高，是引起犢牛腹瀉的主要病原。本研究中發現隱孢子蟲和BRV在腹瀉犢牛中檢出率顯著高于正常犢牛，這說明隱孢子蟲和BRV感染與犢牛腹瀉發生關系密切。此外，在本研究還發現了BKoV在腹瀉樣品中檢出率顯著高于正常犢牛，表明該病原可能也與寧夏地區哺乳期奶犢牛腹瀉發生密切相關。BKoV作為一種新發病原，在健康和腹瀉牛群中均有發現，在中國多個省份和地區均已有報道，并呈廣泛流行趨勢［25］。據報道，BKoV在腹瀉犢牛中檢出率顯著高于健康犢牛［25］，這也表明BKoV感染與犢牛腹瀉可能密切相關，這與本研究檢測結果相一致，但該病原的致病作用還有待進一步研究。通過對樣品病原感染類型進行分析發現，寧夏地區哺乳期奶犢牛中病原感染類型呈多樣化，但單一病原感染類型占比分別高于兩種或兩種以上病原的混合感染類型，表明單一病原感染仍然是最主要的感染類型。在黎玉瓊等［9］、郭仕輝等［11］研究中也表明寧夏地區犢牛腹瀉病原感染類型以單一病原感染為主，這與本研究結果一致。

本研究對不同地區樣品的病原檢測結果進行分析發現，寧夏地區病原感染種類繁多，但隱孢子蟲在4個地區樣品中檢出率均為最高，其次BRV、BKoV和BNoV在寧夏各地區的檢出率也相對較高，表明上述4種病原在寧夏地區哺乳奶犢牛群中廣泛存在。牛曉昊［12］對寧夏4個奶牛養殖市區犢牛糞便中的4種腸道病原進行分析，結果表明隱孢子蟲感染普遍存在，并且腹瀉犢牛樣品中隱孢子蟲檢出率顯著高于正常犢牛，這與本研究結果相一致。熊新雪［26］對寧夏地區犢牛腹瀉相關病毒調查結果表明，BRV（14.23%）和BKoV（26.02%）在寧夏地區犢牛中檢出率較高，在4個奶牛養殖市區均有檢出，但未檢測出BVDV。而在本研究中，在銀川市和吳忠市樣品中檢測出了BVDV，平均檢出率分別為0.50%和1.28%。2019年一項關于中國西部地區牛群中BVDV血清學調查顯示，寧夏地區奶牛群中BVDV平均陽性率為30.00%［27］，這表明寧夏地區奶牛群中存在BVDV感染，也提示寧夏地區需要加強對BVDV的檢測和防控。

本研究對不同季節樣品的病原檢測結果進行分析發現，隱孢子蟲在春、夏、冬3個季節均有較高的檢出率，而BRV和BKoV在冬季檢出率較高。BRV、BCoV、BAstV、BNoV、BKoV和隱孢子蟲等多種病原在春、夏、冬3個季節哺乳期奶犢牛糞便樣品中均有檢出，且在1～30日齡犢牛群中檢出率較高，表明除BRV、BCoV、隱孢子蟲等公認能引起犢牛腹瀉的病原流行外，BNoV、BAstV、BKoV等新發病原也已在寧夏地區存在并廣泛流行。本研究由于未采集到秋季樣品，無法對寧夏地區哺乳期奶犢牛群中腹瀉相關病原的全年流行情況進行準確分析，存在一定不足，但對研究寧夏地區犢牛腹瀉相關病原的流行也具有重要參考價值。

本研究對不同日齡犢牛樣品的病原檢測結果進行分析發現，在1～30日齡犢牛中隱孢子蟲、BRV和BKoV檢出率較高，在31～60日齡犢牛中隱孢子蟲和BNoV檢出率較高，而在60日齡以上犢牛中BKoV、BEV和隱孢子蟲檢出率較高。黎玉瓊等［9］對寧夏部分地區10個奶牛場" 0～60日齡犢牛進行與犢牛腹瀉相關病原的調查發現，BRV和隱孢子蟲等檢出率較高，為主要病原。郭仕輝等［11］對寧夏部分地區2月齡新生犢牛進行腹瀉病原調查發現，BRV、BNoV和隱孢子蟲等為新生犢牛腹瀉的主要相關病原。上述研究結果也表明犢牛感染的病原種類與犢牛日齡相關。

3.2 寧夏地區哺乳期奶犢牛群中主要流行病原的遺傳進化分析

根據RV的" VP6基因可以將RV分為A～H 8個血清型，A型RV是在多種哺乳動物中分布最廣泛的血清型［28］。在本研究中，BRV"" VP6基因系統發育分析結果顯示，檢出的BRV與A型RV聚為一支，遺傳距離最近，表明寧夏地區哺乳期奶犢牛群中流行的BRV主要為A型RV。郭仕輝等［11］、熊新雪［26］對寧夏地區奶犢牛群中流行的BRV分析發現，檢出的BRV均為A型RV，這表明A型RV為奶犢牛群中的主要感染類型。

根據RdRp基因和VP1衣殼基因可將NoV分為GI～GVII 7個基因型，BNoV為GIII基因型［29］。在本研究中，BNoV RdRp基因系統發育分析結果顯示，檢出的BNoV與NoV GIII.2型聚為一支，遺傳距離最近，表明寧夏地區哺乳期奶犢牛群中流行的NoV為GIII.2型。郭仕輝等［11］、熊新雪［26］對寧夏地區奶犢牛群中流行的病毒分析發現，犢牛群中檢出的BNoV均為GIII.2型NoV，這與本研究結果相一致。在Guo等［15］研究中發現，中國地區犢牛群中存在有GIII.1型NoV。王玥琳［30］對河南、四川等地檢出的BNoV進行分析發現，大部分為GIII.2型NoV，小部分為GIII.1型NoV。這表明GIII.2型NoV為犢牛群中流行的主要類型，在中國多地已廣泛流行，寧夏地區哺乳期犢牛群中主要流行的也為GIII.2型NoV。

KoV屬于微RNA病毒科成員，國際病毒委員會將KoV分為A～F 6個種［31］。在本研究中，BKoV 3D基因系統發育分析結果顯示，檢出的BKoV與GeneBank中已公布的B型愛知病毒BKoV聚為同一分支，遺傳距離較近，與C型愛知病毒PKoV和CaKoV處于不同分支，遺傳距離較遠，表明寧夏地區哺乳期奶犢牛群中流行的BKoV主要為B型愛知病毒。但從系統發育樹觀察到獲得序列較為分散，表明BKoV存在較大的遺傳變異性。

隱孢子蟲是引起犢牛腹瀉的常見病原，能引起犢牛腹瀉的有C. parvum、C. bovis、" C.andersoni和C. ryanae等，其中C. parvum最為常見［32］。在本研究中，隱孢子蟲SSU rRN基因系統發育分析結果顯示，檢出的隱孢子蟲與" C.parvum聚為一支，遺傳距離最近，表明寧夏地區哺乳期奶犢牛群中流行的隱孢子蟲類型主要為C. parvum。Li等［33］研究發現，C. parvum感染與犢牛日齡有關，斷奶前犢牛C. parvum檢出率高于其他蟲種。郭仕輝等［11］對寧夏部分地區新生犢牛腹瀉病原調查結果顯示，C. parvum為新生犢牛群中流行的主要蟲種。牛曉昊［12］對寧夏地區不同月齡奶牛進行隱孢子蟲檢測，發現" C.parvum僅在0～4月齡犢牛群中被檢出，為" 0～2月齡犢牛群中流行的優勢蟲種。以上研究表明，寧夏地區哺乳期奶犢牛群中存在C. parvum的廣泛流行。C. parvum是引起新生兒和多種幼齡動物腹瀉的重要病原，高致病性C. parvum會對公共衛生造成巨大威脅。寧夏地區哺乳期奶犢牛群中C. parvum的廣泛流行提示該地區需要進一步加強對C. parvum的生物安全防控。

4 結" 論

本研究從寧夏地區哺乳期奶犢牛糞便中檢出13種腹瀉相關的病原，其中隱孢子蟲、BRV、BKoV和BNoV是寧夏地區哺乳期奶犢牛群中主要流行的病原，隱孢子蟲、BRV和BKoV與奶犢牛腹瀉的發生顯著相關。單一病原感染仍然是哺乳期奶犢牛腹瀉相關病原感染的主要類型。寧夏地區哺乳期奶犢牛感染的隱孢子蟲主要為C. parvum，BRV主要為A型RV、BKoV主要為B型愛知病毒、BNoV主要為GIII.2型NoV。本研究明確了寧夏地區哺乳期奶犢牛群中腹瀉相關病原的流行情況，為寧夏地區哺乳期奶犢牛群腹瀉防控提供了參考依據。

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Epidemiological Investigation of Diarrhea-associated Pathogens in Suckling Dairy Calf Herds in Some Areas of Ningxia

CUI Shengwei1， ZHAO Qingmei2， YU Kun1， XUE Jiaqi1， SUN Ruohan1， LI Yong3，MA Yun1 and YU Yongtao1

（1.School of Animal Science and Technology， Ningxia University， Yinchuan 750021，China;

2.School of Biological Science and Engineering， North Minzu University， Yinchuan 750021，China;

3.School of Life Sciences， Ningxia University， Yinchuan 750021，China）

Abstract

To understand the prevalence of diarrhea-associated pathogens in suckling dairy calves in the Ningxia region， 334 fecal samples from suckling calves were collected from 18 large-scale dairy farms in four regions of Ningxia.The samples were tested for bovine rotavirus （BRV）， bovine coronavirus， bovine viral diarrhea virus， bovine norovirus （BNoV）， bovine nebovirus， bovine astrovirus， bovine torovirus， bovine kobuvirus （BKoV）， bovine enterovirus， Cryptosporidium spp.， Eimeria spp.， Giardia spp.， E. coli K99， and Salmonella spp. through PCR and RT-PCR， respectively. The epidemic characteristics of pathogens and the genetic evolutionary relationship of the main epidemic pathogens were analyzed. The results showed that a total of 13 diarrhea-related pathogens were detected in the feces of suckling calves in Ningxia， among these， cryptosporidium （38.02%）， BRV （19.76%）， BKoV （18.56%） and BNoV （13.77%） were the most commonly observed pathogens. The detection rates of Cryptosporidium spp.， BRV， and BKoV in the diarrhea group were significantly higher than that in the healthy group （Plt;0.05）. The proportion of single pathogen infection was significantly higher than that of two or more mixed pathogens（Plt;0.05）. The samples collected from four regions and three seasons in Ningxia had relatively higher detection rates of Cryptosporidium， BRV， BKoV， and BNoV. The detection rates of Cryptosporidium， BRV， and BNoV were higher in calves aged 1 to 30 days.Meanwhile， the detection rates of Cryptosporidium and BNoV were higher in calves aged 31 to 60 days， and the detection rates of BKoV， BEV， and Cryptosporidium were higher in suckling calves above 60 days. The results of the phylogenetic analysis showed that Cryptosporidium， BRV， BKoV， and BNoV infected suckling calves were mainly Cryptosporidium parvus， BKoV type A， BKoV type B， and BNoV type GIII.2. The above results indicated that Cryptosporidium， BRV， BKoV， and BNoV are the main pathogens associated with diarrhea in suckling calves in Ningxia， and are closely related to the occurrence of diarrhea in calves. Single pathogen infection is the main infection type of diarrhea-related pathogens in suckling calves. The pathogenic species of calves are closely related to season and age.

Key words Suckling dairy calves; Calf diarrhea; Pathogen; Epidemiological investigation

Received "2023-05-24 """Returned 2023-06-13

Foundation item The Key Research and Development Programme of Ningxia Hui Autonomous Region （No. 2021BEF02028， No. 2021BEF01001）; the Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region （No. 2022AAC03231， No. 2023AAC03051）.

First author CUI Shengwei， male， master student.Research area：animal clinical disease diagnosis and treatment techniques. E-mail：cuishengwei1@126.com

Corresponding"" author YU Yongtao， male， professor.Research area：mechanisms of interaction between gastrointestinal flora and animal diseases. E-mail：yongtao_yu@nxu.edu.cn

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）