抗氧化途徑下大豆GmbHLH130轉錄因子增強植物耐旱性研究

摘 要 為了探究大豆" GmbHLH130基因參與植物耐旱性調控的分子機制，分析了轉基因擬南芥在干旱處理下的表型并測定活性氧含量和抗氧化酶活性，同時檢測了擬南芥葉中干旱應答相關基因的表達模式以及轉錄因子GmbHLH130對下游基因啟動子的結合作用。結果顯示，" GmbHLH130基因過表達擬南芥的耐旱性明顯增強。干旱處理下，過表達株系鮮質量和葉片相對含水量均高于WT，而MDA含量和失水率則較低。此外，干旱處理導致擬南芥過表達株系積累更多的可溶性糖和脯氨酸、更少的活性氧以及更高的抗氧化酶活性；同時，干旱脅迫應答基因AtCAT、AtPOD、AtSOD、" AtNCED3、" AtP5CS1和" AtRD29A的表達水平在過表達株系中顯著上調。GmbHLH130蛋白則可結合到靶基因的啟動子區激活GUS報告基因的表達。本研究初步證明GmbHLH130轉錄因子通過結合干旱脅迫應答基因啟動子激活基因表達，增加轉基因植株體內滲透調節物質含量、激活抗氧化途徑和提高ROS清除能力，最終緩解干旱脅迫對植株的損傷。

關鍵詞 大豆；轉錄因子；bHLH；擬南芥；耐旱性

干旱脅迫是限制干旱和半干旱地區植物生長、發育和產量的主要環境因素之一［1］。在長期的進化過程中，植物在形態、生理和分子調控水平上形成了一系列復雜的機制來應對干旱脅迫［2］。植物對干旱脅迫的響應涉及復雜的基因調控網絡，其中，轉錄因子作為干旱信號轉導途徑的核心組成部分，通過激活或抑制下游靶基因的表達，在調節植物對干旱脅迫的適應過程中發揮重要作用［3-4］。

堿性螺旋-環-螺旋（basic-helix-loop-helix，bHLH）蛋白組成了植物第二大轉錄因子家族［5］。bHLH轉錄因子家族的成員包含兩個高度保守且功能不同的結構域：堿性結構域和HLH結構域。位于bHLH結構N端的基本結構域由約15個堿性氨基酸殘基組成，負責與靶基因啟動子區的G-box或E-box元件結合；HLH結構域位于bHLH結構的C端，對蛋白互作非常重要［6］。植物bHLH轉錄因子參與生長發育相關多種生物學過程，包括調節種子休眠［7］和萌發［8］、開花時間［9］、果實成熟［10］、植物次生產物合成和木質部的發育等過程［11］。此外，bHLH轉錄因子在植物對干旱、鹽、寒冷和重金屬等非生物脅迫的響應中發揮重要調控作用［12］。干旱、鹽和滲透脅迫誘導擬南芥" AtbHLH122基因表達上調，擬南芥 atbhlh122突變體對鹽和滲透脅迫的敏感性增加，而" AtbHLH122基因過表達則增強植株對干旱、鹽和滲透脅迫的耐受性［13］。番茄" SlbHLH22基因過表達可提高番茄植株次生代謝物和滲透調節物質的含量，增強活性氧（ROS）清除能力，進而增強番茄植株的耐旱和耐鹽性［14］。日本百脈根" LjbHLH34基因的表達受PEG和ABA誘導表達上調，該基因過表達可通過激活抗氧化酶編碼基因、增強相應的抗氧化酶活性正調控植物的耐旱性［15］。蘋果" MdbHLH130異源過表達則通過調節氣孔閉合和ROS清除增強轉基因煙草植物的耐旱性［16］。因此，探究植物bHLH家族成員在干旱等非生物脅迫中的功能和分子機制對作物的分子育種具有重要意義。

大豆是中國重要的糧油作物，其富含蛋白質，是食用油、植物蛋白和動物飼料的關鍵原料，但是大豆苗期生長易遭受干旱脅迫，直接影響其生長發育和后期產量。隨著全球可支配淡水資源的逐年減少，農業灌溉用水也十分緊缺。因此，提高植物耐旱性對于農業的可持續發展越來越重要。通過轉基因育種和基因編輯育種技術培育高產高抗逆新品種是一種高效快捷的方式，但是這一目標的實現需要基于功能已知的候選基因。盡管已有一些大豆基因被報道參與大豆對干旱脅迫的響應。然而，仍有很多可能參與大豆干旱響應調控的基因有待發掘。已有報道顯示，bHLH轉錄因子家族在大豆中包含308個成員；其中，少部分大豆bHLH蛋白的功能被研究，如大豆 GmORG3的過表達則可增加鐵離子由根到地上部的轉運，同時減少鎘向地上部的運輸從而增強植物對重金屬鎘脅迫的耐受性［17］。大豆bHLH家族成員GmPIB1則通過直接結合到活性氧（ROS）產生關鍵酶基因" GmSPOD1啟動子區抑制其表達，減少ROS的積累，增強大豆轉基因植株對大豆疫霉菌的抗性［18］。本研究基于參與植物非生物脅迫調控的擬南芥" AtbHLH122基因和氨基酸序列，在大豆基因組中比對鑒定出其同源基因" GmbHLH130，該基因表達水平受干旱脅迫誘導顯著上調。進而通過轉基因技術、生理生化測定和分子生物學手段揭示GmbHLH130對于提高轉基因擬南芥的耐旱性非常重要。GmbHLH130蛋白可結合干旱脅迫應答基因啟動子激活靶基因的表達，增加轉基因植株體內滲透調節物質含量、激活抗氧化途徑和提高ROS清除能力，最終緩解干旱脅迫對植株的損傷。本研究將為大豆干旱脅迫應答的轉錄調控機制研究提供新的思路，同時為耐旱大豆的分子改良提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 轉基因擬南芥耐旱性鑒定

野生型擬南芥和" GmbHLH130過表達株系（兩個獨立株系L1和L2，均為T3代純合子）的種子經75%乙醇表面消毒后，播種于泥炭土和蛭石混合（1∶1）基質，在4 ℃冰箱春化3 d，移至植物生長室培養。生長室條件：溫度25" ℃，空氣相對濕度60%～70%，長日照（晝16 h/夜8 h）。2周后挑選長勢較一致的植株進行處理，每個處理6盆，每盆種植4株；首先澆大量水使基質吸水飽和，然后倒掉多余的水，后停止供水，使其自然干旱10 d，觀察野生型和過表達株系的生長情況。葉片丙二醛（MDA）含量測定參考Huang等［19］報道的方法。測定葉片相對含水量時取葉片稱取其鮮質量（FW）；將葉片浸沒在去離子水中，放置在4 ℃冷藏箱12 h，擦干表面水后再次稱量（TW）；將葉片在75 ℃烘箱烘干，再稱其干質量（DW）；葉片相對含水量=（FW-DW）/（TW-DW）%。取正常生長的野生型和轉基因擬南芥植株的葉片測定葉片失水率，將葉片剪下后立刻稱量（FW0），然后將葉片平鋪于試驗臺上，保持溫度為25 ℃、空氣濕度為60%～70%，每隔1 h稱量1次（FWt），失水率=（FW0- FWt）/FW0×100%。

1.2 DAB和NBT染色及H2O2含量測定

DAB（3， 3′-Diaminobenzidine）能夠和H2O2反應生成紅棕色沉淀，NBT（Nitrotetrazolium blue）能夠和O-2反應生成藍色化合物［6］。將擬南芥葉片剪下分別放入DAB染液（DAB粉末50 mg溶于50 mL 50 mmol/L PBS溶液，使用0.1 mmol/L HCl調節pH至3.8）和NBT染液（NBT粉末100 mg溶于50 mL 50 mmol/L PBS溶液），室溫染色過夜，使用75%乙醇脫色后觀察活性氧染色情況。葉片H2O2含量和抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性使用對應的試劑盒測定（南京建成）。

1.3 總RNA提取和定量PCR

使用20% PEG溶液、200 mmol/L NaCl溶液和300 mmol/L 甘露醇溶液處理大豆幼苗，分別在0、3、6、12和24 h取根組織用于檢測" GmbHLH130的表達模式。為了檢測干旱處理下野生型和轉基因擬南芥中干旱脅迫應答相關基因的表達情況，用20% PEG溶液模擬干旱條件處理生長4周的擬南芥，12 h后取葉片用于檢測基因的表達水平變化。被檢測的基因包括AtCAT（AT1G20630）、AtPOD（AT5G66390）、AtSOD（AT5G51100）、AtNCED3（AT3G14440）、AtP5CS1（AT2G39800）和" AtRD29A（AT5G 52310）。使用RNA提取試劑盒（生工，上海）提取總RNA，使用Nanodrop 2000測定RNA濃度，根據反轉錄試劑盒（SuperScript Ⅲ" First-Strand Synthesis SuperMix，賽默飛）的操作步驟合成cDNA第一條鏈作為PCR模板。使用實時熒光定量PCR儀（CFX96，Bio-Rad，美國）進行基因表達量檢測。熒光定量PCR體系包括10 μL"" 2×SYBR Green Mix， 正向和反向引物各0.5 μL， cDNA模板1.0 μL，加超純水至總體積20 μL。PCR儀程序設置為：94 ℃預變性3 min；" 94 ℃變性10 s，60" ℃退火和延伸30 s（40個循環）。以擬南芥" AtActin2（AT3G18780）基因作為內參基因，利用2-△△CT法計算目的基因的相對表達水平。所有樣本均包括3個生物重復，本研究使用的定量PCR引物序列見表1。

1.4 啟動子元件分析及GUS報告載體構建

通常認為bHLH家族成員通過結合基因啟動子上的G-box元件，進而調控靶基因的表達。為了進一步探究大豆GmbHLH130作用的可能機制，從擬南芥數據庫（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）檢索下載AtCAT、AtPOD、AtSOD、 AtNCED3、" AtP5CS1和" AtRD29A基因起始密碼子上游1 500 bp的序列，提交到啟動子元件分析數據庫PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）預測順式作用元件，分析G-box元件的數量和分布。此外，分別克隆前述基因的啟動子片段插入PBI101載體的GUS基因上游，構建GUS載體，然后將GUS載體導入根癌農桿菌GV3101。試驗所用引物見表1。

1.5 煙草瞬時轉化和GUS活性測定

將含有空載體pFGC5941、重組質粒OE" GmbHLH130或GUS載體的GV3101陽性菌落接種于LB液體培養基，于28" ℃震蕩培養至" OD=1.0，離心收集菌體后用10 mmol/L MgCl2溶液（含200 μmol/L" acetosyringone）重懸，然后室溫（25 ℃）靜置3 h。取生長4周的本氏煙草，使用注射器將重懸液混合液（空載體和GUS載體混合作為對照，OE" GmbHLH130和GUS載體混合為試驗組）注射到其葉片中，注射后的煙草正常培養24 h。然后剪取葉片于GUS染色液中，抽真空后于37 ℃暗室靜置8 h，葉片用無水乙醇中脫色后觀察著色深淺。根據Liu等［20］描述的方法測定GUS活性，提取注射GUS載體的煙草葉片總蛋白與底物4-甲基傘形基-β-將D-葡萄糖醛酸（4-MUG）反應，通過測定熒光強度計算GUS活性。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對GmbHLH130表達的影響

將大豆GmbHLH130與已報道參與植物非生物脅迫調控的其他物種bHLH家族成員進行系統進化分析，結果顯示大豆GmbHLH130與擬南芥AtbHLH122和AtbHLH3聚在同一進化分支（圖1-A），說明其功能上可能存在相似性。進而使用20% PEG溶液、200 mmol/L NaCl溶液和300 mmol/L 甘露醇溶液處理大豆幼苗，檢測" GmbHLH130基因在根中的應答情況，結果顯示，其受干旱、鹽和滲透脅迫誘導表達均上調，在干旱處理后的上調尤為明顯（圖1-B）。

2.2 大豆轉錄因子GmbHLH130對擬南芥耐干旱能力的影響

本研究獲得了大豆 GmbHLH130基因過表達的擬南芥純合子材料（T3代）。比較轉基因擬南芥（L1和L2）與野生型（WT）植株的生長表型。結果顯示，正常培養時L1、L2與WT植株的表型無明顯差異；而停止澆水10 d后，盡管所有植株的生長都受到抑制，但WT的葉片卻嚴重失水、萎蔫，而L1、L2植株的生長狀況相對較好，尤其是L2植株的生長受傷害程度較輕（圖2-A）。對應的生理指標如單株鮮質量（圖2-B）、葉片MDA含量（圖2-C）和葉片相對含水量（圖2-D）等數據也顯示過表達植株在干旱脅迫下表現出相對較好的生長狀態。對上述擬南芥材料的離體葉片的失水率進行分析，發現WT葉片的失水率顯著高于L1和L2植株葉片（圖2-E）。對擬南芥滲透調控物質脯氨酸和可溶性糖含量測定，結果顯示，在對照條件下轉基因擬南芥L1和L2與野生型擬南芥植株WT的脯氨酸和可溶性糖含量均較低且無明顯差異；而干旱處理導致兩種物質的含量增加，并且在L1和L2中的含量顯著高于WT" （圖3）。

2.3 轉錄因子GmbHLH130對活性氧積累和抗氧化酶活性的影響

利用DAB和NBT染色分別觀測擬南芥葉片中H2O2和O-2的積累，結果顯示，正常生長的擬南芥葉片中H2O2和O-2的含量均較低，干旱處理導致H2O2和O-2在葉中積累量增加，尤其在WT葉片更明顯；在過表達株系L1和L2中的積累量則明顯低于WT（圖4-A，4-B）。進一步測定了擬南芥葉中H2O2含量，發現正常條件下WT、L1和L2植株葉片中H2O2含量分別為" 2.83、2.90和" 2.81 μmol/g，它們之間無顯著差異；干旱處理后，WT葉片H2O2含量顯著增加，達到6.30 μmol/g，而L1和L2的H2O2含量顯著低于WT，分別為4.81和4.44"" μmol/g（圖4-C）。進一步測定擬南芥葉中SOD、POD和CAT酶活性。結果顯示，正常生長的擬南芥WT和過表達株系的酶活性無明顯差異；干旱處理導致野生型WT和過表達植株的SOD、POD和CAT酶活性均顯著增強，且在過表達植株中顯著高于WT（圖4-D～4-F）。

2.4 轉基因擬南芥中干旱響應相關基因的激活

為了深入探究GmbHLH130參與干旱脅迫調控的分子機制，本研究檢測了非生物脅迫相關標記基因（AtCAT、AtPOD、AtSOD、 AtNCED3、 AtP5CS1和 AtRD29A）的表達模式。結果顯示，所有基因的表達水平在正常條件下的WT、L1和L2植株間均無明顯差異；而干旱處理導致基因表達水平均上調，且在過表達株系L1和L2中的上調倍數顯著高于WT（圖5）。以上結果說明：GmbHLH130異源表達可以通過激活AtCAT、AtPOD、AtSOD、 AtNCED3、 AtP5CS1和 AtRD29A等基因的表達，從而調節植物對干旱條件的適應能力。

2.5 GmbHLH130激活干旱相關基因表達的可能途徑

進一步分析擬南芥基因AtCAT、AtPOD、AtSOD、" AtNCED3、" AtP5CS1和" AtRD29啟動子區的順式作用元件，發現所有基因啟動子區都含有G-box元件。其中PAtCAT上包含4個G-box元件，P AtNCED3含有3個，P AtRD29A含有2個，PAtPOD、PAtsOD和PAtP5CS1都含有1個（圖6-A）。構建了" GmbHLH130基因的過表達載體以及AtCAT、AtPOD、AtSOD、" AtNCED3、" AtP5CS1和" AtRD29啟動子融合GUS的報告載體，" GmbHLH130基因過表達載體分別和報告載體組合共轉化煙草葉片，以空載體pFGC5941與報告載體組合轉化的葉片作為對照。結果顯示， OE GmbHLH130分別與PAtCAT：：GUS、PAtPOD：：GUS、PAtsOD：：GUS、PAtNCED3：：GUS、PAtP5CS1：：GUS和PAtRD29A：：GUS共表達的葉片GUS染色更深，而對照染色較淺（圖6-B）。進一步測定煙草葉片的GUS活性，結果顯示過表達載體與報告載體共表達的葉片中GUS活性較對照顯著增強（圖6-C），與GUS染色結果基本一致，說明在煙草葉片中轉錄因子GmbHLH130結合啟動子激活GUS報告基因的表達。

3 討" 論

植物的非生物脅迫耐受性取決于脅迫關鍵基因，這些基因表達水平的改變可以提高植物適應各種環境脅迫的能力［21］。盡管bHLH轉錄因子參與植物非生物脅迫響應的研究已有報道，包括干旱脅迫［22］、鹽脅迫［23］和低溫脅迫［24］等。然而，大豆bHLH家族成員參與非生物脅迫響應的功能仍需進一步探究。本研究基于湖南科技學院湖南省銀杏工程技術研究中心前期研究結果，克隆了受干旱誘導表達上調的bHLH家族基因" GmbHLH130，構建了該基因的過表達載體并通過農桿菌介導的遺傳轉化獲得轉基因擬南芥植株。干旱處理下的表型和生理指標顯示L1、L2植株的生長狀況相對較好，尤其是L2植株受傷害程度較輕。MDA含量反應了脂質過氧化水平，通常用于表示脅迫下的植株損傷程度［19］。本研究結果顯示干旱導致所有植株體內MDA含量上升，而過表達植株顯著低于WT，尤其L2株系更低，說明過表達植株受傷害較輕。此外，脯氨酸和可溶性糖是植物中重要的滲透劑，被認為是改善植物干旱脅迫導致的不利影響的重要滲透調節物質［25］，" P5CS1基因編碼脯氨酸生物合成途徑關鍵限速酶，在干旱脅迫應答過程發揮正調節作用［26］。苦蕎FtbHLH3通過上調" P5CS表達水平來增加脯氨酸積累，從而增強植物耐旱性［27］。本研究也得到類似的結果，GmbHLH130異源表達增加了干旱處理后擬南芥葉片" AtP5CS1表達水平和脯氨酸含量，在緩解植株干旱損傷中也發揮重要作用。ABA途徑在植物響應和適應干旱脅迫的信號轉導中發揮重要作用，可激活下游干旱應答基因的表達；而" NCED3和" RD29A基因是ABA途徑關鍵基因 ［28］。干旱脅迫下，PtrbHLH66蛋白通過激活" DREB1A、" DREB2A、" ERD1、" RD29A和" RD20基因的表達，以ABA依賴途徑正調節轉基因植株的耐旱性。在本研究中，干旱脅迫下GmbHLH130過表達植株中" AtNCED3和" AtRD29A的表達水平較WT植株顯著增加，說明轉錄因子GmbHLH130調節植物耐旱可能是ABA依賴性的。

植物通常因環境脅迫引起ROS過量積累而受到損傷［29］。而ABA參與干旱脅迫調控可能與其誘導的抗氧化防護系統有關。CAT、POD和SOD基因編碼的抗氧化酶在ROS清除過程中發揮功能，SOD能夠催化O-2生成H2O2和O2，H2O2則被CAT和POD分解成H2O和O2，減少ROS的積累，從而抑制膜氧化，減少膜系統的氧化損傷。本研究通過3，3′-二氨基聯苯胺（DAB）和硝基藍四唑（NBT）染色分別檢測葉片中H2O2和O-2含量，結果顯示干旱導致兩種主要ROS積累量增加，但是過表達植株葉片中含量較少。為了揭示GmbHLH130過表達植株中氧化損傷減輕的潛在機制，進一步測定了抗氧化酶的活性，即過氧化氫酶（CAT），過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）。發現干旱脅迫下這些酶活性在過表達植株中均顯著高于WT，證明" GmbHLH130過表達提高了干旱脅迫下的ROS清除能力，降低了脅迫誘導的氧化損傷。已有報道指出bHLH轉錄因子通過結合靶基因啟動子序列中的E-box或G-box來激活下游基因的表達［6， 13］。本研究通過構建" GmbHLH130基因過表達載體和非生物脅迫應答關鍵基因AtCAT、AtPOD、AtSOD、" AtNCED3、" AtP5CS1和" AtRD29啟動子融合GUS的報告載體，結合煙草葉片瞬時表達和GUS染色以及GUS活性測定，證明GmbHLH130蛋白能夠結合到啟動子區調控下游靶基因表達，調節植物對干旱脅迫的響應過程。基于本研究結果，初步證明GmbHLH130具有參與干旱脅迫反應的功能。簡言之，GmbHLH130蛋白通過結合到干旱應答標記基因啟動子區激活其表達，提高滲透調節物質含量、增強抗氧化活性和清除ROS，最終緩解干旱脅迫對植物造成的傷害。本研究為揭示大豆bHLH轉錄因子參與干旱調控的分子機制提供了重要依據，為作物抗旱育種提供了重要線索。

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Research of Soybean GmbHLH130 Transcription Factor on

Plant Drought Tolerance under Antioxidant Pathway

ZHANG Bin

（Hunan Provincial Engineering Research Center for Ginkgo biloba，Hunan University of

Science and Engineering，Yongzhou" Hunan 425199，China）

Abstract To elucidate the molecular mechanism underlying the involvment of the soybean"" GmbHLH130 gene in regulating plant drought tolerance.We analyzed the phenotype of transgenic Arabidopsis under drought treatment，determined the levels of reactive oxygen species （ROS） and assessed antioxidant enzyme activities.Moreover，we investigated the expression pattern of drought-responsive genes in Arabidopsis and examined the binding activities of the transcription factor GmbHLH130 with the promoters of its downstream genes.The results showed that the overexpression of"" GmbHLH130 gene significantly enhanced the drought tolerance of transgenic Arabidopsis.Under drought treatment，transgenic plant overexpressing"" GmbHLH130 exhibited higher fresh weight and relative water content in their leaves compared to wild-type （WT） plants，while showing lower malondialdehyde （MDA） content and water loss rate.In addition，drought stress led to increased soluble sugar and proline accumulation，elevated antioxidant enzyme activity，and reduced ROS accumulation in the"" GmbHLH130 overexpressing Arabidopsis. Moreover，the expression levels of drought stress responsive genes，including AtCAT，AtPOD，AtSOD，AtNCED3，AtP5CS1 and AtRD29A，were significantly up-regulated in the"" GmbHLH130 overexpressing plants.In conclusion，GmbHLH130 binds with the promoter region of the target gene，activating GUS reporter gene expression.This binding with promoters of drought-responsive genes activates their expression，increases the content of osmoregulatory substances，triggers antioxidant pathway and improves ROS scavenging ability，and eventually alleviates damage of drought stress on transgenic plants.

Key words Soybean;Transcription factor; bHLH; Arabidopsis thalianap; Drought tolerance

Received "2023-01-16 """Returned 2023-05-13

Foundation item The Natural Science Foundation of Hunan Province （No.2022JJ30274）.

First author ZHANG Bin，male，Ph.D，associate professor.Research area：plant developmental biology and plant resistance.E-mail：zhangbin27104@163.com

（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）