葡萄堿基-抗壞血酸轉(zhuǎn)運蛋白(NAT)家族基因的鑒定和表達分析

摘 要 基于最新葡萄基因組數(shù)據(jù)庫，在全基因組范圍鑒定葡萄堿基-抗壞血酸轉(zhuǎn)運蛋白（nucleobase-ascorbate transporters，NAT）基因家族成員，并對其進行生物信息學(xué)和表達模式分析，為后續(xù)深入其功能奠定基礎(chǔ)。以Xan_ur_permease結(jié)構(gòu)域（PF00860）保守序列為種子序列篩選NAT基因，分別利用Prot Prama、Clustalx、MEGA 7.0、PlantCare、GSDS 2.0和MEME進行理化性質(zhì)、多序列比對、進化特征、順式作用元件、基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)分析，并利用公共數(shù)據(jù)庫基因表達數(shù)據(jù)和qRT-PCR分別分析其在各組織和響應(yīng)脅迫信號中的表達模式。結(jié)果表明，葡萄基因組存在13個NAT家族成員，分別命名為 VvNAT1～ VvNAT13，氨基酸數(shù)目、分子質(zhì)量和等電點分別為304～755、33.01～81.49 ku和8.15～9.6。進化分析將來自葡萄、蘋果、擬南芥、水稻和菠蘿的NAT蛋白分為4個亞組。結(jié)構(gòu)分析表明，VvNAT基因外顯子數(shù)目為1～14，其對應(yīng)蛋白序列中均含有［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］和（QH）兩個保守基序。此外，VvNAT基因啟動子區(qū)域存在響應(yīng)多種激素和逆境信號的元件。共線性分析表明，葡萄種內(nèi)存在3個NAT共線性基因?qū)Γ咸押蛿M南芥種間存在12個NAT共線性基因?qū)Α；虮磉_分析表明， VvNAT1、" VvNAT3、" VvNAT8、" VvNAT11和 VvNAT12在葡萄不同組織各發(fā)育時期均具有較高的表達量；200 mmol/L NaCl鹽脅迫和4 ℃低溫處理后，多個成員差異表達，其中" VvNAT8在莖和根中都顯著上調(diào)表達。綜上所述，葡萄多個NAT基因參與了組織發(fā)育和對鹽和低溫逆境脅迫的響應(yīng)，而" VvNAT8可能參與組織發(fā)育及植株對低溫和鹽脅迫的響應(yīng)，可作為后續(xù)功能分析的候選基因。

關(guān)鍵詞 葡萄；堿基–抗壞血酸轉(zhuǎn)運蛋白；家族基因；生物信息學(xué)；非生物脅迫

葡萄（Vitis vinifera" L.）是世界上第三大水果，栽培歷史悠久，經(jīng)濟價值較高［1］，但低溫、干旱、鹽堿等生長環(huán)境嚴重影響葡萄品質(zhì)以及葡萄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。近年，使用分子手段改良作物，提高植株抗逆性成為熱點，因此篩選逆境脅迫相關(guān)基因，對提高葡萄品質(zhì)具有重要意義。

堿基-抗壞血酸轉(zhuǎn)運蛋白（nucleobase-ascorbate transporters，NAT）又被稱為堿基陽離子同向轉(zhuǎn)運蛋白（NCS2）［2］，在哺乳動物中可轉(zhuǎn)運抗壞血酸［3-4］，并且被廣泛研究；在植物中具有轉(zhuǎn)運嘧啶、嘌呤和尿酸的作用［5］。生物中的核酸轉(zhuǎn)運蛋白一般分為四大類，其中堿基-抗壞血酸轉(zhuǎn)運蛋白（NAT）是最大的一類。NAT家族成員根據(jù)對底物的特異性可分為三類，第一類：在細菌、真菌和植物中作用于黃嘌呤或和尿酸［6-7］；第二類：在細菌中作用于尿嘧啶；第三類：在脊椎動物中用于轉(zhuǎn)運L-抗壞血酸［8-9］。前人研究表明，NAT家族成員一般包含400～650個氨基酸殘基、10～14個跨膜結(jié)構(gòu)域和兩個保守結(jié)構(gòu)域，分別位于跨膜結(jié)構(gòu)域TMS9上游的［Q/E/P］-N-X-G-X-X-X-X-T-［R/K/G］（X為疏水氨基酸）和TMS1中的QH結(jié)構(gòu)域［10-11］。功能研究表明，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，共鑒定出12個NAT家族基因，在其葉、莖、花等組織中均有表達，其中維管束組織表達較高，推測可能與植株的長距離運輸有關(guān)［12］。在番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）中鑒定出12個NAT基因，在不同生長階段具有明顯的組織特異性［13］。在辣椒（Capsicum annuum L.）中鑒定出12個NAT家族基因，部分基因在根、莖以及果實發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用，且對低溫和高溫具有較強的響應(yīng)［14］。在蘋果（Malus pumila Mill.）中鑒定出14個NAT家族基因，部分基因在莖尖、成熟葉片、幼果和成熟果實中均有表達，且對干旱脅迫和鹽脅迫均有響應(yīng)［15］。

研究表明，NAT基因在植物的生長發(fā)育和響應(yīng)逆境方面具有重要的作用［16］，但目前在葡萄中尚未進行系統(tǒng)的分析研究。因此，本研究采用生物信息學(xué)方法在葡萄全基因組中鑒定、篩選NAT家族基因，并對家族成員進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，同時，采用qRT-PCR方法分析葡萄NAT家族基因成員在鹽和低溫逆境脅迫處理下，在其葉、莖和根中的表達情況，以期為進一步探究葡萄NAT基因的分子機理及葡萄逆境脅迫機制研究提供一個理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

以甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院保存的‘黑比諾’葡萄（V.vinifera L cv.Pinot Noir）試管苗為試材。配制MS培養(yǎng)基，pH為5.8～6.0，培養(yǎng)容器為150 mL的三角瓶，每瓶分裝40 mL培養(yǎng)基。選擇生長健壯，無污染的試管苗，在超凈工作臺剪成1.5 cm左右的帶芽莖段，每瓶接種2個，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃，光周期為16 h/8 h（光照/黑暗），繼代培養(yǎng)40 d后，選擇生長健壯、大小一致的試管苗，將其轉(zhuǎn)移至含有200 mmol/L NaCl的GS液體培養(yǎng)基中。4 ℃處理在低溫植物培養(yǎng)箱中進行，處理時長均為24 h，以正常生長的試管苗為對照，每個處理設(shè)3個重復(fù)。采集樣葉用錫箔紙包裹后在液氮中速凍，而后置于" -80 ℃冰箱保存，用于RNA的提取。

1.2 葡萄NAT家族基因的鑒定

使用 phytozomev12.1：Home（https：//zome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）［17］搜索并下載擬南芥NAT基因的氨基酸序列，在葡萄基因組網(wǎng)站進行同源比對，并下載葡萄NAT家族基因的全長、氨基酸序列和CDS序列。根據(jù)NAT基因家族所特有的功能結(jié)構(gòu)域（PF00860），利用在線軟件hmmscan search | HMMER進行篩選，刪去該功能結(jié)構(gòu)域缺失或不完整的序列。

1.3 葡萄NAT家族基因生物信息學(xué)分析

利用ExPASy數(shù)據(jù)庫（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件ProtParam工具，對蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目、等電點、相對分子質(zhì)量、不穩(wěn)定系數(shù)、總平均親水性等基本理化性質(zhì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計［18］。從Ensembl Pantsl網(wǎng)站獲取NAT基因位置及所在染色體長度，利用在線軟件（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）繪制染色體定位圖。利用WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）在線分析NAT家族的亞細胞定位預(yù)測［19］。根據(jù)基因登錄號在葡萄基因組網(wǎng)站（http：//www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/blast_server/projet_ML/blast.pl）查詢每個NAT基因上游2 000 bp序列，而后提交于PlantCare在線軟件，對序列進行啟動子順式作用元件進行預(yù)測分析。利用BAT（http：//www.infspire.org/）工具繪制葡萄種內(nèi)和葡萄與擬南芥種間的共線性關(guān)系［20］。

1.4 葡萄NAT家族基因系統(tǒng)進化關(guān)系及基因結(jié)構(gòu)分析

在Phytozome數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）中下載水稻、菠蘿、蘋果的蛋白序列，利用CLUSTALW和DNAMAN對葡萄NAT基因家族進行多序列比對分析［21］，并通過MEGA7.0，采用鄰接法構(gòu)建NAT基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹，利用在線軟件Evolegenius（https：//evolgenius.info//evolview-v2/#login）對NAT基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹進行美化。使用在線軟件GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）進行基因結(jié)構(gòu)分析［22］。利用MEME（http：//meme-suite .org/tools/meme）在線軟件對葡萄NAT家族進行motif序列分析，預(yù)測基序的數(shù)量設(shè)置為15個。

1.5 葡萄NAT家族基因芯片表達譜分析

在BAR數(shù)據(jù)庫（http：//bar.utoronto.ca/）中，通過NAT基因家族的基因ID檢索在葡萄不同時期的芯片數(shù)據(jù)，基因ID是VIT_217s0000g10090等。篩選相關(guān)所需的數(shù)據(jù)，并使用TBtools軟件的HeatMap功能繪制熱圖。

1.6 葡萄NAT家族基因qRT-PCR分析

引物（表1）由生工（上海）生物工程有限公司合成。采用試劑盒提取葡萄葉片、莖和根的RNA，cDNA合成用（Prime Script RT reagent Kit，Perfect Real Time，，TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物冷藏于-20 ℃，備用。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）用Light Cycler○R

96 Real-Time System （ Roche，瑞士）實時定量PCR儀，對該家族基因的不同處理進行表達量分析。反應(yīng)體系為20 μL，分別加入ddH2O 6.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1.5 μL，SYBR MIX 10 μL［23］。以VvGAPDH基因（登錄號：CB973647）作為內(nèi)參基因［24］，每個處理設(shè)3個重復(fù)。試驗數(shù)據(jù)用 Excel 2016和SPSS 26軟件分析，利用TBtools和Origin 2022作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄NAT基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

通過同源比對分析和NAT特有結(jié)構(gòu)域鑒定，從葡萄基因組中鑒定到13個NAT家族基因成員。將篩選確定的13個葡萄NAT家族成員按照染色體定位的順序進行命名，依次為 VvNAT1～ VvNAT13。通過繪制13個基因在染色體上的分布圖可知（圖1），11個成員分布在9條染色體上，2個成員（ VvNAT12、 VvNAT13）分布在未知染色體上。其中Chr1、Chr3、Chr6、Chr8、Chr10、Chr12和Chr13號染色體各分布1個基因，分別是 VvNAT1、 VvNAT2、 VvNAT3、 VvNAT4、 VvNAT5、 VvNAT6和 VvNAT7，Chr17和Chr18染色體分別分布2個，分別是 VvNAT8、 VvNAT9和 VvNAT10、 VvNAT11。

由表2可知，葡萄NAT家族基因氨基酸數(shù)目、分子質(zhì)量和等電點分別為94～755、9.71～81.49 ku和8.15～9.6。其中 VvNAT12的氨基酸數(shù)目最少、分子質(zhì)量最低，與其他成員差異較大，分別為94和9.71 ku，而" VvNAT3的氨基酸數(shù)目最多、分子質(zhì)量最高，分別為755和81.49 ku。" VvNAT3的不穩(wěn)定系數(shù)最高（45.66）， VvNAT7的不穩(wěn)定系數(shù)最低（20.69）。 VvNAT1的等電點最高（9.6）， VvNAT10的等電點最低（8.15）。另外VvNATs基因家族成員的蛋白均為疏水性蛋白，以" VvNAT13的蛋白疏水性最強" （0.579），" VvNAT3蛋白疏水性最低（0.272）。對葡萄NAT家族的編碼蛋白進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)主要在細胞膜、細胞質(zhì)和液泡中表達，而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細胞核、細胞骨架和葉綠體中表達較少。其中 VvNAT2～ VvNAT10的蛋白均定位于細胞膜上； VvNAT1和" VvNAT11的蛋白分別定位于液泡和葉綠體； VvNAT12和" VvNAT13都定位于細胞質(zhì)。

2.2 葡萄NAT家族基因多序列比對分析

為了進一步了解葡萄NAT家族基因，對其13個氨基酸序列進行多序列比對分析（圖2），發(fā)現(xiàn)該家族存在兩個保守結(jié)構(gòu)域：TMS9上游的［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］結(jié)構(gòu)氨基酸（除VvNAT4、VvNAT7、VvNAT9、VvNAT13）和TMS1中的（QH）功能氨基酸（除VvNAT4、VvNAT7、VvNAT9、VvNAT12、VvNAT13）。

2.3 葡萄NAT家族成員系統(tǒng)進化分析

為了探索VvNAT家族的進化特性，將擬南芥（14個）、葡萄（13個）、水稻（14個）、蘋果（27個）和菠蘿（13個）共81個NAT家族蛋白序列進行比對分析，篩選去除分支進化關(guān)系較遠的13個序列：水稻（3個）、葡萄（2個）、蘋果（6個）和菠蘿（2個），利用剩余的68個NAT家族蛋白序列構(gòu)建NAT家族系統(tǒng)進化樹（圖3）。該68個成員可分為4個亞組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ），其中第Ⅰ亞組包含VvNAT4、VvNAT7、VvNAT9，以及2個擬南芥、4個蘋果、2個水稻和3個菠蘿的NAT蛋白；第Ⅱ亞組包含VvNAT3，以及2個擬南芥、3個蘋果、1個水稻和1個菠蘿的NAT蛋白；第Ⅲ亞組包含VvNAT5、VvNAT6、VvNAT11，以及3個擬南芥、6個蘋果、3個水稻和3個菠蘿的NAT蛋白；第Ⅳ亞組包含VvNAT、VvNAT2、VvNAT8、VvNAT10，以及7個擬南芥、8個蘋果、5個水稻和4個菠蘿的NAT蛋白。此外，葡萄與雙子葉植物蘋果聚類于較近的分支中，進化關(guān)系較近；而與單子葉植物水稻和菠蘿聚類于較遠的分支。

2.4 葡萄NAT家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

葡萄NAT家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：13個NAT基因的結(jié)構(gòu)差異明顯，但在亞組內(nèi)的成員之間基因結(jié)構(gòu)相似，其中內(nèi)含子數(shù)最多的為13個，分別為 VvNAT2、 VvNAT5、 VvNAT6、 VvNAT8、 VvNAT10和" VvNAT11，而 VvNAT4、 VvNAT7和 VvNAT9不具有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)；外顯子數(shù)最多的為14個，分別為 VvNAT2、 VvNAT5、 VvNAT6、 VvNAT8、 VvNAT10和" VvNAT11，最少為1個，分別是 VvNAT4、 VvNAT7和 VvNAT9。第Ⅰ亞組中包含3個成員， VvNAT4、 VvNAT7和 VvNAT9均只有1個外顯子，無內(nèi)含子；第Ⅱ亞組有3個成員，其中" VvNAT3所含外顯子數(shù)和內(nèi)含子數(shù)最多，分別為9和8，VvNAT12含外顯子數(shù)和內(nèi)含子數(shù)最少，分別為2和1，" VvNAT13含外顯子數(shù)和內(nèi)含子數(shù)分別為7和6；第Ⅲ亞組的3個成員分別為VvNAT3、VvNAT12和" VvNAT13，均有14個外顯子和13個內(nèi)含子；第Ⅳ亞組中包含4個成員，其中 VvNAT2、" VvNAT8和 VvNAT10均有14個外顯子和13個內(nèi)含子， VvNAT1有13個外顯子和12個內(nèi)含子。

利用MEME軟件蛋白序列進行motif預(yù)測，共發(fā)現(xiàn)15個保守基序，基序含21～50個氨基酸（圖4），其中motif10含氨基酸數(shù)最少，為21個；motif1、motif6、motif8、motif12、motif13和motif15所含氨基酸數(shù)最多，為50個。N端是motif8和motif12，其中motif8中含（QH）功能氨基酸；C端是motif9。在 VvNAT1、 VvNAT2、 VvNAT3、 VvNAT5、 VvNAT6、 VvNAT8、 VvNAT10和 VvNAT11中存在motif2，其中包含［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］結(jié)構(gòu)氨基酸。此外，4個亞組中均有motif14保守基序，Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ 3個亞組中同一亞組內(nèi)基因編碼蛋白的保守基序具有相似性，Ⅱ亞組內(nèi)基因編碼蛋白的保守基序存在差異；Ⅲ和Ⅳ亞組NAT保守性相對比Ⅰ和Ⅱ亞組NAT保守性高。

2.5 葡萄NAT家族成員啟動子順式作用元件

將葡萄NAT家族基因啟動子上游2 000 bp的堿基序列提交至在線軟件PlantCare進行預(yù)測分析，而后篩選與激素和逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件。發(fā)現(xiàn)存在多種激素反應(yīng)元件，包括水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）、赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif、TATC-box和P-box）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACG-motif和CGTCA-motif）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、生長素響應(yīng)元件（AuxRR-core和TGA-element），與環(huán)境信號相關(guān)的包含厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件（ARE）、干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件（MBS）和防御與脅迫響應(yīng)元件（TC-rich repeats）。由圖5可知，13個VvNAT基因中，" VvNAT2、nbsp; VvNAT5、" VvNAT7、" VvNAT8、" VvNAT9和" VvNAT13含有TCA-element， VvNAT1、" VvNAT3和" VvNAT11含有GARE-motif， VvNAT1、 VvNAT2、" VvNAT5、 VvNAT10和 "VvNAT11含有TATC-box， VvNAT2、 VvNAT6、 VvNAT11和 VvNAT12含有P-box， VvNAT1、" VvNAT3、" VvNAT4、" VvNAT6、" VvNAT8和 VvNAT9含有TGACG-motif，" VvNAT3和" VvNAT11含有CGTCA-motif，VvNAT1、VvNAT5、VvNAT6、VvNAT10和" VvNAT11含有ABRE， VvNAT10和" VvNAT11含有AuxRR-core，因此推測葡萄NAT基因家族與植物激素響應(yīng)密切相關(guān)；13個VvNAT基因均含有ARE，其中VvNAT5、VvNAT8、VvNAT9和 VvNAT10含有MBS，VvNAT1、VvNAT2、VvNAT7和" VvNAT13含有TC-rich repeats，因此推測葡萄NAT基因家族與環(huán)境信號和防御與脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。

2.6 葡萄NAT家族基因芯片表達譜分析

通過對葡萄基因芯片數(shù)據(jù)進行分析，得到葡萄NAT家族基因成員在不同組織各發(fā)育時期的基因表達譜，并利用TBtools軟件繪制基因表達熱圖（圖6）。結(jié)果顯示，葡萄NAT家族基因成員的不同亞組在不同組織或同組織的各發(fā)育時期表達量存在差異。第Ⅰ亞組的3個成員在各個組織中的表達量明顯低于其他亞組，其中 VvNAT7在成熟葉片、木質(zhì)化莖、采收后3個月內(nèi)果皮和采收后3個月外果皮中高表達；第Ⅱ亞組中，" VvNAT3和 VvNAT12在卷須、葉片、幼苗、幼莖、花、花序軸、種子、果皮和果肉等組織中表達量均較高，且隨著組織的成熟和衰老表達量逐漸降低，而" VvNAT13的表達量相對較低；第Ⅲ亞組中，" VvNAT5和" VvNAT6的表達量均較低，而" VvNAT11在卷須、莖、花、果肉、種子、中表達量較高，且隨組織成熟和衰老表達量降低；第Ⅳ亞組中， VvNAT2和 VvNAT10在各組織中表達量均很低，而" VvNAT8在幼苗、幼莖、幼花、坐果期的卷須、花序軸、種子、坐果后期的果肉組織中高表達量高， VvNAT1在中度成熟果肉后期的組織中表達量較高。綜上可知， VvNAT1、" VvNAT3、" VvNAT8、" VvNAT11和 VvNAT12在葡萄不同組織各發(fā)育時期都具有較高的表達量。

2.7 葡萄NAT家族基因共線性分析

對葡萄NAT家族基因進行種內(nèi)共線性關(guān)系分析（圖7-A），發(fā)現(xiàn)葡萄種內(nèi)基因成員之間存在復(fù)制現(xiàn)象，其中葡萄13個NAT基因中 VvNAT2和 VvNAT10、" VvNAT11，" VvNAT4和 VvNAT7之間共線性較強。對葡萄和擬南芥進行種間共線性關(guān)系分析（圖7-B），發(fā)現(xiàn)葡萄和擬南芥種間也存在復(fù)制現(xiàn)象，存在12個重復(fù)的基因?qū)Γ謩e分布于擬南芥4條染色體和葡萄的7條染色體上。其中葡萄Chr1染色體上的基因和擬南芥Chr1上的基因、葡萄Chr6、Chr10和Chr18染色體上的基因和擬南芥Chr2染色體上的基因、葡萄Chr8和Chr13染色體上的基因和擬南芥Chr3、Chr5染色體上的基因、葡萄Chr17染色體上的基因和擬南芥Chr1、Chr5染色體上的基因之間共線性較強。葡萄Chr3、Chr8和ChrUn染色體上的基因和擬南芥染色體上的基因沒有共線性（圖7）。

2.8 葡萄NAT家族成員qRT-PCR分析

對葡萄NAT家族成員在不同逆境脅迫處理下的相對表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)各亞族基因的相對表達量差異顯著（圖8）。

200 mmol/L NaCl處理后，第Ⅰ亞組的3個家族成員" VvNAT4、 VvNAT7和 VvNAT9在莖中的表達量與對照相比均呈顯著上調(diào)，分別是對照的72倍、8.7倍和4 635倍。第Ⅱ亞組的3個家族成員" VvNAT3、VvNAT 12和" VvNAT13在莖中的表達量與對照相比均呈顯著上調(diào)，尤其" VvNAT13是對照680倍；在葉中的表達量與對照相比不顯著；" VvNAT3在根中的表達量與對照相比呈顯著上調(diào)， VvNAT12和" VvNAT13在根中的表達量與對照相比則不顯著。第Ⅲ亞組成員包括" VvNAT5、" VvNAT6 和" VvNAT11，其中" VvNAT5和" VvNAT11在莖中的表達量與對照相比呈顯著上調(diào)，" VvNAT6在莖中的表達量與對照相比不顯著。 VvNAT5、 VvNAT6和" VvNAT11在葉和根中的表達量與對照相比均無顯著變化。第Ⅳ亞組包含4個基因，為 VvNAT1、 VvNAT2、" VvNAT8和 VvNAT10，其中 VvNAT1、 VvNAT8和 VvNAT10在莖中的表達量與對照相比均呈顯著上調(diào)， VvNAT2則不顯著； VvNAT1、 VvNAT2和" VvNAT8在根中的表達量與對照相比均呈顯著上調(diào)， VvNAT10則不顯著； VvNAT1、 VvNAT2、" VvNAT8和 VvNAT10在葉中的表達量與對照相比均不顯著。4 ℃低溫處理后，13個葡萄NAT家族成員中除" VvNAT8在莖和根中的表達量與對照相比呈顯著上調(diào)外，其他在葉、莖和根中的表達量與對照相比均不顯著。

綜上可知，葡萄NAT基因在200 mmol/L NaCl鹽逆境脅迫處理下，在葉的表達量與對照相比均不顯著，在莖和根中的表達量與對照相比呈不同程度的顯著上調(diào)，其中 VvNAT9在莖中的表達量上調(diào)最為顯著，" VvNAT8在根中的表達量上調(diào)最為顯著。在4 ℃低溫逆境脅迫處理下，除" VvNAT8在莖和根中的表達量與對照相比呈顯著上調(diào)外，其他在葉、莖和根中的表達量與對照相比均不顯著。

3 討" 論

堿基–抗壞血酸轉(zhuǎn)運蛋白（NAT），普遍存在于植物、原核生物、真菌和哺乳動物中，因其轉(zhuǎn)運抗壞血酸的功能，所以在哺乳動物和微生物中研究較多。植物中最早發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)運蛋白的是Schultes等［7］，Burzle等［25］研究表明，SVCT1和SVCT2轉(zhuǎn)運蛋白對抗壞血酸具有特異性。Argyrou［6］等研究發(fā)現(xiàn)，玉米中該轉(zhuǎn)運蛋白主要參與轉(zhuǎn)運尿酸和黃嘌呤。Hunt［26］和Niopek-Witz等［27］研究發(fā)現(xiàn)，NAT在擬南芥中主要參與腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶以及次黃嘌呤的轉(zhuǎn)運。近年來，關(guān)于堿基–抗壞血酸轉(zhuǎn)運蛋白（NAT）在植物中的研究逐漸增多，發(fā)現(xiàn)其在維持植物正常生理代謝中發(fā)揮重要作用［28］。

本研究從葡萄全基因組中共鑒定出13個家族基因成員，與擬南芥（12個）［12］、番茄（12個）［13］、辣椒（12個）［14］、蘋果（14個）［15］的NAT家族成員數(shù)目相近，說明葡萄NAT家族基因在進化過程中相對保守。葡萄中鑒定出的13個基因分為4個亞組，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞組分別包含3個家族成員，第Ⅳ亞組包含4個家族成員。葡萄NAT家族氨基酸數(shù)量存在較大差異，為304～755，分子質(zhì)量為33.01～81.49ku，其編碼蛋白均為堿性蛋白，這與辣椒中的研究結(jié)果相似［13］。結(jié)合進化樹和基因結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)第Ⅰ亞組的3個基因無內(nèi)含子，第Ⅱ亞組的 VvNAT12只有1個內(nèi)含子，這可能是由于在進化過程中內(nèi)含子大量丟失，基因結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，加速CCAAT-box的轉(zhuǎn)錄，促進基因的表達有關(guān)［29］。多序列比對發(fā)現(xiàn)葡萄NAT家族成員對應(yīng)蛋白序列中均含有［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］和（QH）兩個保守基序，但部分基因的結(jié)構(gòu)域丟失，推測可能與物種所處的環(huán)境壓力有關(guān)。整體而言，葡萄NAT家族成員在［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］結(jié)構(gòu)氨基酸中，第一個氨基酸均為E，故而可推測其在葡萄中的轉(zhuǎn)運底物為核酸，這與蘋果NAT轉(zhuǎn)運蛋白可能主要轉(zhuǎn)運核酸類物質(zhì)的研究結(jié)果相同［30］。對NAT家族基因啟動子上游2 000 bp的堿基序列進行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)存在多種激素反應(yīng)元件和環(huán)境信號相關(guān)的元件，說明該家族基因表達調(diào)控機制復(fù)雜［31］，在蘋果的研究中，已經(jīng)證實MdNAT基因響應(yīng)干旱脅迫與鹽脅迫。在辣椒的研究中也發(fā)現(xiàn)其第一亞組的3個基因在所研究的器官和組織中整體表達量明顯低于其他亞組，其中3個CaNAT基因?qū)}脅迫有不同程度地響應(yīng)，6個CaNAT基因?qū)Φ蜏孛{迫有不同程度地響應(yīng)。而在番茄中，B亞組的3個基因 SlNAT149在栽培種中不表達，在野生種中低表達。葡萄NAT基因在不同組織中的表達分析發(fā)現(xiàn)，不同組織或同組織的各發(fā)育時期表達量存在差異，尤其在莖、花、果肉、種子、卷須中的表達量較高，并隨組織的成熟衰老表達量逐漸降低。共線性分析表明，葡萄種內(nèi)13個NAT基因中 VvNAT2和 VvNAT10、" VvNAT11，" VvNAT4和 VvNAT7之間共線性較強，葡萄和擬南芥兩個種間NAT基因中，葡萄Chr1、Chr6、Chr8、Chr10、Chr13、Chr17和Chr18染色體上的基因和擬南芥染色體上的基因有較強共線性，葡萄Chr3、Chr8和ChrUn染色體上的基因和擬南芥染色體上的基因沒有共線性。

通過qRT-PCR技術(shù)分析葡萄NAT家族基因成員在鹽和低溫逆境脅迫處理下的抗性，結(jié)果表明，該家族基因在葉、莖、根不同組織中對鹽和低溫兩種逆境脅迫的響應(yīng)程度有差異。200 mmol/L NaCl處理下，在葉中的表達量與對照相比均不顯著；除 VvNAT2和 VvNAT6，其他基因在莖中的表達量均呈顯著上調(diào)；" VvNAT1、 VvNAT2和" VvNAT8在根中的表達量呈顯著上調(diào)。4" ℃低溫處理下，在葉、莖、根組織中，只有" VvNAT8在莖和根組織中的表達量與對照相比呈顯著上調(diào)，其他則均不顯著。因此推測葡萄NAT基因在鹽和低溫脅迫下具有不同程度的響應(yīng)，尤其對鹽脅迫具有較強的響應(yīng)，這與鹽脅迫下， Vvnac17過表達系的發(fā)芽率和根長均高于野生型植株的研究結(jié)果相似［32］。

本研究獲得的信息有助于提高對葡萄NAT家族基因的認識，本研究對13個VvNATs進行了鑒定和分析，并將它們的蛋白質(zhì)分成4個亞組，這些亞組具有共同的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育和保守基序的分布。qRT-PCR分析結(jié)果表明，200 mmol/L NaCl鹽脅迫和4℃低溫處理后，葡萄多個NAT基因參與了組織發(fā)育和對鹽和低溫逆境脅迫的響應(yīng)，而" VvNAT8可能參與組織發(fā)育及植株對低溫和鹽脅迫的響應(yīng)，可作為后續(xù)功能分析的候選基因。盡管，文中對葡萄NAT基因的功能還沒有得到充分的描述，但本研究的發(fā)現(xiàn)為今后葡萄NAT家族功能研究和參與植物適應(yīng)脅迫條件提供了一個理論依據(jù)。

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Identification and Expression Analysis of Nucleobase-ascorbate Transporter （NAT） Family"" Gene" in Grape

LAN Guanquecailang，GUO Lili，MA Weifeng，MAO Juan and CHEN Baihong

（College of Horticulture，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070， China）

Abstract Based on the latest grape genome database，members of the nucleobase-ascorbate transporters （NAT） family" gene" were identified on a genome-wide scale and subjected to bioinformatics and expression pattern analysis，laying a foundation for further functional investigation.The conserved sequence of the" Xan_ur_permease domain （PF00860） was used as a seed sequence to screen NAT genes.Prot Prama，Clustalx，MEGA 7.0，PlantCare，GSDS 2.0，and MEME were used to analyze physicochemical properties，multiple sequence alignment，evolutionary characteristics，cis-acting elements，gene structure，and protein structure.The expression patterns of these genes in various tissues and in response to stress signals were analyzed using public database gene expression data and qRT-PCR.The results showed that there were 13 NAT family members in the grape genome，denoted as"" VvNAT1-VvNAT13，with the number of amino acids，molecular mass，and isoelectric point ranging from 304-755，33.01-81.49" ku，and 8.15-9.6，respectively.The phylogenetic analysis divided the NAT proteins from grape，apple，Arabidopsis thaliana，rice，and pineapple into four subgroups.Structural analysis showed that the number of VvNAT gene exons ranged from 1 to 14，and the corresponding protein sequences contained two conserved motifs，［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］ and" （QH）.Moreover，the VvNAT gene promoter region contained elements responsive to various hormones and stress signals.The collinearity analysis showed that there were three NAT collinear gene pairs within the grape species，and 12 NAT" collinear gene pairs between grape and A.thaliana.Gene expression analysis showed that"" VvNAT1， VvNAT3， VvNAT8， VvNAT11，and" VvNAT12 had high expression levels in different tissues and developmental stages of grape.After 200 mmol/L NaCl salt stress and 4" ℃ low temperature treatment，multiple members were differentially expressed，among which" VvNAT8" was significantly up-regulated in both stems and roots.In summary，multiple NAT genes in grape are involved in tissue development and response to salt and low-temperature stress，while" VvNAT8" may be involved in tissue development and plant response to low temperature and salt stress，and can be used as a candidate gene for subsequent functional analysis.

Key words Grape; Nucleobase-ascorbate" transporters; Family gene; Bioinformatics; Abiotic stress

Received "2023-09-13 """Returned 2023-11-22

Foundation item 2022 Silk Road Science and Technology Project for Cold and Drought Agriculture （No.GSLK-2022-4）.

First author LAN Guanquecailang，male，master student.Research area： stress physiology and growth regulation of fruit trees.E-mail： 3501317931@qq.com

Corresponding"" author CHEN Baihong，male，professor，doctoral supervisor.Research area： stress physiology and growth regulation of fruit trees.E-mail： bhch@gsau.edu.cn

（責(zé)任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）