基于生物信息學分析探討羥基紅花黃色素A通過JAK2/STAT3信號通路抑制缺血性腦卒中后神經元凋亡的機制

摘要目的：利用生物信息學技術篩選并鑒定缺血性腦卒中（IS）的關鍵基因，基于基因富集分析結合相關實驗探討羥基紅花黃色素A（HSYA）對腦缺血損傷后神經元凋亡的影響及機制。方法：從GEO數據庫獲得IS相關的樣本數據，進行差異表達基因（DEGs）分析及基因富集分析，獲得關鍵基因與關鍵信號通路，并通過體內外實驗進行相關驗證。建立Sprague-Dawley大鼠大腦中動脈閉塞再灌注模型（MCAO/R），采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）和免疫熒光檢測Janus激酶2（JAK2）/信號傳導轉錄激活因子3（STAT3）通路的磷酸化水平及凋亡相關蛋白的表達；線粒體膜電位探針檢測線粒體膜電位情況進而明確細胞凋亡水平。利用HT-22海馬神經元細胞建立糖氧剝奪/復糖氧模型（OGD/R），使用JAK2/STAT3信號通路抑制劑進一步驗證HSYA對神經元凋亡的作用機制。結果：通過生物信息學分析研究GSE22255數據集發現23個顯著上調的DEGs和2個顯著下調的DEGs。富集分析發現其與脂多糖的反應、細胞凋亡的調控、炎癥反應、急性炎癥反應調節、分子干預信號通路相關。生物過程方面，通過建立特征基因功能網絡發現，特征基因與急性炎癥反應、凋亡信號通路的調節、脂多糖介導的反應、穩態分子的反應等功能相關。基因集富集分析顯示，腫瘤壞死因子α（TNF-α）介導的核因子κB（NF-κB）信號通路、血紅素代謝信號通路、細胞凋亡相關信號通路、JAK/STAT3信號通路、P53信號通路發揮著關鍵作用。篩選出JAK2/STAT3信號通路和凋亡相關通路為研究重點。與假手術組比較，MCAO/R組大鼠磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）和促凋亡相關蛋白表達升高（P＜0.001），抑凋亡相關蛋白表達降低（P＜0.001）。HSYA干預后可抑制JAK2/STAT3信號通路磷酸化激活和神經元凋亡（P＜0.01）。體外實驗顯示，OGD/R組JAK2/STAT3通路被磷酸化激活，促凋亡相關蛋白表達較Normal組升高（P＜0.001），抑凋亡相關蛋白表達低于Normal組（P＜0.001）；加入抑制劑AG490后JAK2、STAT3磷酸化程度降低（P＜0.01）。與Normal組比較，OGD/R組凋亡相關蛋白半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、Bcl-2關聯X蛋白（Bax）表達水平升高（P＜0.001），Bcl-2表達降低（P＜0.001）。HSYA抑制了神經元的凋亡（P＜0.01）。結論：JAK2/STAT3信號通路和凋亡相關信號通路在IS后發揮著關鍵作用，HSYA可能通過調控JAK2/STAT3信號通路，抑制缺血缺氧后神經元凋亡，從而減輕腦損傷。

關鍵詞缺血性腦卒中；生物信息學分析；羥基紅花黃色素A；腦缺血；神經元；Janus激酶2/信號傳導轉錄激活因子3信號通路；凋亡；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.011

Mechanism of Hydroxysafflor Yellow A Inhibiting Neuronal Apoptosis after Ischemic Stroke through JAK2/STAT3 Signaling Pathway Based on Bioinformatics Analysis

WU Yige， YIN Lijun， WANG Zeqian， JIA Sifeng， WEN Chunli， SONG Lijuan， MA Cungen

Shanxi University of Chinese Medicine， Jinzhong 030619， Shanxi， China

Corresponding AuthorSONG Lijuan， E-mail： slj_0354@126.com; MA Cungen， E-mail： macungen@sxtcm.edu.cn

AbstractObjective：To screen and identify key genes related to ischemic stroke（IS） by bioinformatics technology，and to explored the effects and its mechanism of hydroxysafflor yellow A（HSYA） on neuronal apoptosis after cerebral ischemic injury.Methods：Is-related sample data were obtained from GEO database，and differential expression gene（DEGs） analysis and gene enrichment analysis were performed to obtain key genes and key signaling pathways，and relevant verification was carried out through in vivo and in vitro experiments.The Sprague-Dawley rat middle cerebral artery occlusion and reperfusion model（MCAO/R） was established.The phosphorylation level of Janus kinase 2（JAK2）/signal transduction transcriptional activator 3（STAT3） pathway and the expression of apoptosis-related proteins were detected by Western Blot and immunofluorescence.Mitochondrial membrane potential probes were used to detect mitochondrial membrane potential to determine the level of apoptosis.The glucose-oxygen deprivation/reoxygen model（OGD/R） was established in HT-22 hippocampal neurons，and JAK2/STAT3 signaling pathway inhibitors were used to" verify the mechanism of HSYA on neuronal apoptosis.Results：Bioinformatics analysis of the GSE22255 dataset revealed 23 significantly up-regulated DEGs and 2 significantly down-regulated DEGs.Enrichment analysis showed that it was related to lipopolysaccharide response，apoptosis regulation，inflammatory response，acute inflammatory response regulation，and molecular intervention signal pathway.In terms of biological processes，by establishing functional networks of feature genes，it was found that feature genes were related to acute inflammatory response，regulation of apoptosis signaling pathway，lipopolysaccharids-mediated response，and homeostasis molecular response.Gene set enrichment analysis showed that nuclear factor κB（NF-κB） signaling pathway，heme metabolism signaling pathway，apoptosis-related signaling pathway，JAK/STAT3 signaling pathway and P53 signaling pathway mediated by tumor necrosis factor α（TNF-α） played some key role.JAK2/STAT3 signaling pathway and apoptosis-related pathways were screen out as the research focus.Compared with the sham group，the expressions of phosphorylated JAK2（p-JAK2），phosphorylated STAT3（p-STAT3） and pro-apoptosis-related proteins in the MCAO/R group increased（P＜0.001），while the expressions of anti-apoptosis-related proteins decreased（P＜0.001）.HSYA inhibited phosphorylation activation of JAK2/STAT3 signaling pathway and neuronal apoptosis（P＜0.01）.Vitro experiments showed that JAK2/STAT3 pathway was activated by phosphorylation in the OGD/R group，the expression of pro-apoptosis-related proteins was more than that in the normal group（P＜0.001），and the expression of anti-apoptosis-related proteins was less than that in the normal group（P＜0.001）.The phosphorylation of JAK2 and STAT3 decreased after the addition of inhibitor AG490（P＜0.01）.Compared with the normal group，the expression levels of apoptosis-associated protein cysteine protease 3（Cleaved Caspase-3） and Bcl-2 associated X protein（Bax） in the OGD/R group increased（P＜0.001），and the expression of Bcl-2 decreased（P＜0.001）.HSYA inhibited neuronal apoptosis（P＜0.01）.Conclusion：JAK2/STAT3 signaling pathway and apoptosis-related signaling pathway played key roles after IS，and HSYA might inhibit neuronal apoptosis after ischemia and hypoxia by regulating JAK2/STAT3 signaling pathway，thereby alleviating brain injury.

Keywordsischemic stroke; bioinformatics analysis; hydroxysafflor yellow A; cerebral ischemia; neurons; Janus kinase 2/signal transduction transcription activator 3 signaling pathway; apoptosis; experimental study

腦卒中是威脅人類健康的疾病，在中老年群體中發病率逐年增加［1］，造成沉重的家庭負擔及醫療負擔。我國腦卒中病人逐漸趨于年輕化，風險因素包括心房顫動、高血壓、高脂血癥、糖尿病、吸煙、飲酒、不健康飲食和肥胖等［2］。缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）約占全部腦卒中的70%以上，原因主要是腦梗死和腦動脈閉塞引起的缺血病變導致缺氧，常伴有認知、感覺功能障礙［3］。由于腦缺血引起的神經元死亡決定了腦卒中病人的死亡率和致殘率，因此，針對神經元的治療方案尤為重要。逆轉缺血缺氧造成的神經元損傷在理論上具有一定難度，腦卒中不僅對神經元造成重要損傷，而且通過細胞因子與信號通路產生廣泛的相互作用，誘導多種細胞死亡途徑的激活［4-6］。因此，深入探討IS的發生、發展機制，從中尋找關鍵的分子標志物與信號通路，對IS的基礎研究及后續的治療方案有重要的臨床意義。

近年來，隨著生物信息學的快速發展，測序及基因芯片等研究手段在疾病的預測與治療中被廣泛應用［7］。采用生物信息學方法分析IS相關的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），進行可視化繪圖以分析篩選并鑒定關鍵基因，通過實驗進行體內外相關基因與信號通路的驗證，以期為藥物治療IS提供新方向。

Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號傳導轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路在生理狀態下處于靜息狀態，但在IS后的各種神經細胞中產生磷酸化被激活［8-9］。JAK2/STAT3信號通路通過直接或間接方式參與各種細胞活動，并與其他通路間發生串擾，誘導神經細胞凋亡、焦亡和鐵死亡等。有研究顯示，抑制神經元的JAK2/STAT3相關信號通路，有助于減輕IS后的神經元凋亡［10］。多項研究表明，對STAT3相關通路的調控可緩解神經炎癥和改善突觸可塑性［11-13］。調控JAK2/STAT3信號通路進而降低其磷酸化水平可能是抑制IS后神經元凋亡的有效途徑。前期建立的可視化生信分析結果顯示，凋亡相關信號通路與JAK2/STAT3信號通路在IS相關的基因與通路中發揮著重要作用。因此，探討相關藥物能否通過干預JAK2/STAT3信號通路的方式介導IS后神經元凋亡。

傳統中藥紅花治療IS歷史悠久，其有效單體羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）抗腦缺血損傷作用顯著，且于2023年作為治療IS的新藥上市并應用，目前僅闡明部分機制［14-16］。相關研究表明，HSYA通過抑制IS后星形膠質細胞和小膠質細胞上的JAK2/STAT3信號通路磷酸化激活，進而抑制神經炎性因子表達，緩解神經細胞損傷［17-19］。但HSYA能否通過干預神經元上的JAK2/STAT3信號通路抑制IS后的神經元凋亡仍需深入研究。

1材料與方法

1.1數據的獲取及差異表達

通過GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）搜索“ischemic stroke”且下載GSE22255。參與基因組表達譜研究的IS病人要求在采血前至少6個月只經歷過1次IS發作，對照組無IS家族史；排除患有嚴重貧血或活動性過敏的病人。樣本來源于靜脈穿刺采集，標準化預處理后共得到40個樣本，其中對照組20個樣本，IS組20個樣本。獲得數據后，使用R軟件limma（version 3.40.6）對40個樣本進行分析，獲得IS相關的DEGs（以P＜0.01，差異倍數＞2.0為篩選標準）。通過對DEGs相關數據進行整合分析，利用R軟件包進行差異基因火山圖和熱圖的繪制。根據上述分析數據，基于基因本體（GO）、京都基因和基因組百科全書（KEGG）對DEGs進行功能富集分析。通過使用Cluster Profiler，并對分析結果進行可視化。GO富集分析包括生物過程、分子功能和細胞組成等。本研究中篩選條件為P＜0.05，Count≥1。選取排名居前20位的相關信號通路分析差異基因相關的生物功能［7，20］。

1.2特征基因功能網絡的構建

基于GO及KEGG數據分析，繪制特征基因功能相關的網絡圖，了解特征基因關聯的具體功能，并對結果進行可視化分析。

1.3基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

GSEA是一種生物信息學的計算方法，從基因集的富集角度分析，計算方法內容不局限于是否為差異基因，理論上更易發現對生物通路及生物功能細微變化的影響。因此，使用GSEA分析富集相關的信號通路。

1.4實驗試劑和儀器

高糖DMEM培養液購自中生奧邦公司；胎牛血清購自EXCELL公司；無糖DMEM培養液（貨號A2477501）、青霉素-鏈霉素混合液（貨號15140122）均購自美國Gibco公司；兔抗凋亡相關蛋白半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）一抗（貨號9661）購自Cell Signaling Technology公司；磷酸化JAK2（p-JAK2，貨號Tyr1007/1008）購自Cell Signaling Technology公司；JAK2（貨號ab108596）購自Abcam公司；磷酸化STAT3（p-STAT3，貨號Tyr705）購自Cell Signaling Technology公司；STAT3（貨號ab119352）購自Abcam公司；Bax（貨號ab32503）購自Abcam公司；Bcl-2（貨號68103-1-Ig）購自Proteintech公司；山羊抗兔抗體（貨號BA1054）購自Boster公司；山羊抗鼠抗體（貨號SA00001-1）購自Proteintech公司；Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG（貨號A-11001）、ALexa FlourTM Plus555標記的山羊抗兔IgG抗體（貨號A-32732）均購自Thermo Fisher公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）（貨號E-CK-A301）購自Elabscience公司；4%多聚甲醛溶液（貨號P1110）、0.25%Trypsin-EDTA胰蛋白酶（貨號T1300）均購自中國索萊寶公司；一步法脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（貨號C1089）購自碧云天公司；RIPA裂解液（貨號P0013B）購自碧云天公司；厭氧培養箱購自英國Baker Ruskinm公司；Bio analytical Imaging System購自美國Bio-Rad公司；CO2培養箱、全波長光吸收酶標儀均購自Thermo公司。

1.5實驗動物與大腦中動脈閉塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型

MCAO/R模型采用成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體質量200～240 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物實驗遵照山西中醫藥大學生物醫學倫理審查委員會制定的實驗動物倫理原則進行，動物倫理批號為2020DW081。

將大鼠隨機分為假手術組（Sham組）、MCAO/R組和MCAO/R中藥組（MCAO/R＋HSYA組），各6只。MCAO/R組通過戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，剃毛后使用鑷子鈍性分離皮下組織，暴露頸內動脈（internal carotid artery，ICA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）及頸總動脈后可見Y型分叉，此時用細線在ECA根部和ICA近心段進行結扎以暫時中斷血流供應，結扎完成后于頸總動脈剪一切口并插入線栓，待線栓進入頸內動脈，解開頸內動脈的動脈夾，并將線栓繼續推進，直至線栓已進入大腦中動脈且不能前行，平均探入深度18～20 mm。線栓插入完畢后，將預留的結扎線拉緊固定。醫用棉簽清理并消毒后，縫合頸部切口，將大鼠放回籠內，進行消毒處理，做好保溫措施。閉塞2 h后，解開預留的結扎線，重新進行再灌注。假手術組與MCAO/R組操作過程類似，但不進行線栓和血管結扎處理，只進行血管分離。MCAO/R＋HSYA組大鼠模型處理與MCAO/R組一致，拔除線栓，并以12 mg/kg的劑量腹腔注射HSYA。術后將大鼠放回籠子并注意保溫措施，給予充足的食物和水。所有大鼠在取出線栓后24 h內進行處死。

1.6細胞系與細胞糖氧剝奪/復糖氧模型（oxygen glucose deprivation/reoxygen，OGD/R）模型

HT-22細胞系小鼠海馬神經元細胞系由中國科學院細胞庫（中國上海）提供。細胞置于含有10%胎牛血清（FBS，Gibco，Clayton，澳大利亞）中，并加入10 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM，Gibco，Clayton，澳大利亞）中進行培養。將細胞置于37 ℃，含有5%CO2潮濕空氣的培養箱中培養，每2 d更換1次培養基。使用HT-22細胞建立OGD/R模型，模擬缺血/再灌注條件。將細胞隨機分為正常組（Normal組）、OGD/R組、OGD/R中藥組（OGD/R＋HSYA組）。OGD/R組、OGD/R＋HSYA組棄去完全培養基后，使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細胞，確保完全無培養基殘留后加入不含葡萄糖的DMEM，將細胞置于厭氧培養箱（0.1%O2、5%CO2、94%N2，37 ℃）中進行糖氧剝奪2 h。待OGD結束后，將葡萄糖補充至正常水平。之后將細胞置于先前培養箱中繼續培養24 h。OGD誘導期間，OGD/R＋HSYA組用25 μmol/L的HSYA處理8 h。Normal組更換同體積的高糖完全培養液，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養 ？厱

1.7TUNEL細胞凋亡檢測

將制備的冰凍切片置于載玻片上復溫，取出樣品并甩干；應用組化筆將待染部位畫圈，采用0.3%TritonX-100配制液在室溫通透30 min，之后用含山羊血清的PBS封閉液封閉1 h；PBS沖洗3次并甩干；首先滴加配制好的NeuN抗體（1∶2 000），平放于濕盒內置于4 ℃冰箱孵育過夜；次日棄去NeuN一抗，PBS沖洗5次并甩干，加入與一抗相應種屬的二抗，在室溫下孵育2 h；吸出二抗，PBS沖洗5次并甩干，根據說明書比例加入配制好的TUNEL溶液，放入濕盒中，置于37 ℃恒溫箱孵育；取出后棄去TUNEL溶液，使用PBS沖洗5次，最后加入含DAPI的熒光封片液，完成制作。

1.8線粒體膜電位檢測（JC-1）

JC-1是一種對線粒體膜電位敏感的熒光探針，根據試劑的說明書配制JC-1工作溶液和分析緩沖液。完成細胞分組與造模后，首先使用PBS輕洗細胞，接著使用Assay Buffer沖洗細胞1次，丟棄上清后用JC-1工作液孵育20 min。孵育后，將細胞皿置于熒光顯微鏡下觀察并選取代表性圖像進行拍攝。

1.9免疫熒光染色

大鼠：制作來自不同組別的石蠟切片用于免疫熒光染色。腦切片經過二甲苯與乙醇脫蠟后，使用檸檬酸鈉修復液進行抗原修復后用于免疫熒光。細胞：完成細胞玻片與細胞造模后棄去培養液，用PBS清洗3次，每次5 min。使用4%多聚甲醛進行固定，用于免疫熒光前的準備。室溫下用含有0.15%的Triton X-100和2%BSA的PBS封閉2 h后，將腦切片/細胞玻片與特異性一抗在濕盒中置于冰箱4 ℃孵育過夜。棄去一抗并使用PBS清洗5次后，使用熒光二抗在室溫孵育1.5 h。最后用熒光顯微鏡拍攝代表性圖像。

1.10蛋白免疫印跡法（Western Blot）

將大鼠腦組織勻漿和神經元細胞加入到RIPA Lysis Buffer中。按比例加入苯甲基磺酰氟（PMSF）和磷酸酶抑制劑，進行成分混勻渦旋，置于冰上裂解30 min，每隔5～10min再進行1次渦旋混勻。使用One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit（Epizyme Biotech）配制7.5%～12.5%的電泳凝膠并進行電泳。接下來將蛋白質轉移至聚偏乙烯膜（PVDF）上（Millipore），并進行后續恒流200 mA轉膜。轉膜完成后將膜與脫脂牛奶在室溫搖床上孵育封閉1.5 h，之后將膜與稀釋配制好的特異性一抗在4 ℃冰箱搖床條件下孵育過夜。最后與二抗在室溫孵育1.5 h。

2結果

2.1IS后對照組與IS組相關DEG的鑒定

在GSE22255數據集中確定了對照組和IS組顯著差異的基因25個。DEG相關熱圖顯示了IS組和對照組樣本之間的差異，其中LogFC≥1.0的基因有23個，LogFC＜－1.0的基因有2個。詳見圖1。

2.2IS后功能富集分析與基因功能網絡

為探討DEGs涉及的生物學功能，本研究對所有差異基因表達進行GO分析后，發現在生物過程（biological process，BP）中基因參與細胞對脂多糖的反應、細胞凋亡的調控、炎癥反應、急性炎癥反應調節、分子干預信號通路等；分子功能（molecular function，MF）中與細胞因子活性、細胞因子結合受體、DNA結合轉錄、催化劑活性、CXCR趨化因子受體結合等顯著相關。詳見圖2A。BP方面，通過建立特征基因功能網絡，發現特征基因與急性炎癥反應、凋亡信號通路的調節、脂多糖介導的反應、穩態分子的反應等功能相關。詳見圖2B。為探討哪些基因和信號通路與IS有重要聯系，采用基因富集分析不同組間信號通路富集情況。詳見圖3。分析結果表明，通過TNF-α介導的NF-κB信號通路、血紅素代謝信號通路、細胞凋亡相關信號通路、JAK/STAT3信號通路、P53信號通路、炎癥反應信號通路等在基因富集中發揮著重要作用。

2.3HSYA抑制MCAO/R誘導的神經元凋亡

基于上述生信分析結果發現，細胞凋亡與JAK/STAT3信號通路在IS后發揮著重要作用。利用MCAO/R大鼠進行分析，觀察HSYA是否能通過上述靶點富集通路產生影響，進而緩解IS后的神經元損傷。通過TUNEL染色觀察HSYA是否抑制MCAO/R后的神經元凋亡。結果表明，MCAO/R后，大鼠海馬神經元出現大量凋亡，HSYA干預后，凋亡神經元數量減少。詳見圖4。為了進一步確定MCAO/R及HSYA對大鼠凋亡相關指標的影響，測定大鼠腦勻漿Cleaved Caspase-3、Bax與Bcl-2的表達，得到與免疫熒光相似結論，即MCAO/R可增加凋亡相關指標Cleaved Caspase-3與Bax，減少抗凋亡蛋白Bcl-2表達（P＜0.001），HSYA干預可緩解神經元的凋亡（P＜0.01或P＜0.001）。詳見圖5。

2.4HSYA抑制MCAO/R后JAK2/STAT3信號通路的磷酸化激活

為明確HSYA及MCAO/R對JAK2/STAT3信號通路的影響，首先對大鼠腦組織的蛋白勻漿進行測定。結果顯示，MCAO/R能誘導JAK2/STAT3信號通路的磷酸化激活，HSYA干預后可抑制其表達。詳見圖6。

2.5HSYA抑制OGD/R后JAK2/STAT3信號通路的磷酸化激活與神經元凋亡

通過動物實驗初步明確了HSYA抑制MCAO/R誘導的神經元凋亡和HSYA抑制MCAO/R后JAK2/STAT3信號通路的磷酸化激活。體外細胞實驗進一步通過免疫熒光雙染神經元細胞發現，HSYA可抑制OGD/R后JAK2/STAT3信號通路的磷酸化激活。詳見圖7。通過Western Blot檢測凋亡相關蛋白，結果顯示，HSYA抑制OGD/R引起的Cleaved Caspase-3表達增加與Bax/Bcl-2比值增大，與體內實驗結果一致。詳見圖8。

2.6HSYA通過抑制OGD/R后JAK2/STAT3信號通路的磷酸化激活減輕神經元凋亡

通過體外實驗與體內實驗可知：HSYA可抑制缺血再灌注誘導的神經元凋亡和JAK2/STAT3信號通路的磷酸化激活。使用JAK2/STAT3信號通路的抑制劑AG490，設置4組細胞，分別為Normal組、OGD/R組、OGD/R＋HSYA組和OGD/R＋HSYA＋AG490組探討HSYA是否通過抑制JAK2/STAT3信號通路磷酸化激活從而緩解OGD/R后的神經元凋亡。Western Blot結果顯示，OGD/R可激活JAK2/STAT3信號通路的磷酸化，引起凋亡相關蛋白表達增多（P＜0.001），HSYA可抑制通路的激活并減少促進凋亡蛋白的表達（P＜0.01）；加入HSYA與AG490進行干預后，這種通路磷酸化的抑制效果未得到進一步逆轉（P＞0.05），提示HSYA可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路磷酸化激活的方式緩解OGD/R引起的神經元凋亡，詳見圖9。JC-1探針為一種對細胞膜電位敏感的檢測方式，相關結果與Western Blot結果一致，即HSYA通過抑制JAK2/STAT3的磷酸化激活進而減輕OGD/R引起的神經元凋亡，詳見圖10。

3討論

IS發生后，中樞神經系統發生供血功能障礙導致缺氧和能量缺乏，并引起神經元離子梯度紊亂。發生去極化的神經元可觸發細胞死亡機制，包括凋亡、焦亡和細胞壞死［21-22］。細胞凋亡是一種高度調節的、能量依賴性的細胞死亡形式，其特征是細胞出現顯著的形態變化，如細胞質萎縮與凝結、核膜分解及凋亡小體形成［23-24］。神經元細胞凋亡在IS病理過程中發揮著重要作用，影響疾病的死亡率、致殘率。既往研究顯示，IS中凋亡與多種信號通路存在密切聯系并相互協調，通過干預凋亡與信號通路之間的平衡可減輕神經功能損傷［25-26］。

JAK2/STAT3作為一條經典的信號通路，在IS的急性期被激活［27］。本研究生信分析結果表明，JAK2/STAT3信號通路與細胞凋亡相關信號通路均是IS后關鍵的通路與靶點。有研究表明，JAK2的磷酸化激活可直接引起STAT3的磷酸化［28］。有研究顯示，JAK2/STAT3通路的磷酸化激活后參與多種細胞死亡進程，進而參與IS后的病理活動［29］。既往研究指出，JAK2/STAT3信號通路是導致腦缺血/再灌注損傷的主要因素之一［30］。實驗研究表明，JAK2/STAT3信號通路的磷酸化激活與細胞凋亡有緊密聯系，抑制其通路的激活有助于減輕細胞損傷［31］。

中醫經典活血化瘀代表藥物紅花治療IS歷史悠久，《中國藥典》中明確有效單體成分HSYA是對紅花進行含量測定和質量控制的指標。有實驗表明，HSYA通過抑制星形膠質細胞和小膠組織細胞的JAK2/STAT3信號通路，抑制脂質運載蛋白2和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3的表達，進而發揮神經保護作用［17-18］。研究發現，HSYA通過調節自噬通路直接干預神經元自噬［16］。HSYA是否通過抑制神經元的JAK2/STAT3信號通路的磷酸化激活抑制IS后的神經元凋亡，有待進一步研究。

本研究首先通過生信分析篩選出了在IS后重要的信號通路與細胞功能基因網絡，基于課題組研究結果將其進行選擇與串擾；通過進一步的體內外實驗驗證HSYA干預JAK2/STAT3通路發揮抑制IS神經元凋亡的作用。體內實驗結果表明，HSYA可抑制MCAO/R大鼠神經元JAK2/STAT3信號通路的磷酸化激活，并降低促凋亡相關蛋白表達，提高抗凋亡蛋白表達；為了明確JAK2/STAT3的磷酸化與神經元凋亡之間的關系，在小鼠海馬神經元細胞系HT-22建立OGD/R模型，通過體外實驗進一步探討兩者之間的關系，實驗結果佐證了體內實驗結果，即HSYA與JAK2/STAT3通路抑制劑AG490的作用類似，通過抑制JAK2、STAT3的磷酸化減輕IS后神經元凋亡。上述研究結果提示，JAK2/STAT3信號通路可能與凋亡相關信號通路間存在串擾，HSYA可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路磷酸化激活的方式抑制凋亡的發生與發展。

眾多研究證實JAK2/STAT3信號通路與細胞凋亡之間有密切聯系，但不排除其他通路可能對凋亡產生影響，且HSYA的作用靶點尚未明確，今后實驗需深入探討進一步驗證證實。

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（收稿日期：2024-03-21）

（本文編輯薛妮）