不同乳粉中優勢芽孢桿菌的檢測與分析

摘要：為研究乳粉中菌落總數和芽孢桿菌種屬的組成，分析乳粉在運輸、銷售、貯藏過程中的風險菌，該研究以國內某品牌的6種不同產地的乳粉為研究對象，采用傳統的平板培養方法結合非熱處理和熱處理兩種處理方式對6種乳粉中菌落總數、芽孢菌數量進行統計分析，并通過形態學、革蘭氏染色鏡檢結合16S rDNA鑒定樣品中的優勢芽孢桿菌。6種樣品中的菌落總數主要在102～103 CFU/g范圍內，均小于國家標準5.0×104 CFU/g，符合GB 19644—2010的安全范圍。芽孢桿菌在6種樣品中均有檢出，檢出值在101～102 CFU/g范圍內。根據形態學觀察分類得到7種革蘭氏陽性芽孢桿菌，經16S rDNA和BLAST比對鑒定，芽孢桿菌分別為Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus circulans、Bacillus paramycoides、Bacillus subtilis、Bacillus velezensis和Bacillus cereus。不同乳粉的菌落總數符合國家標準要求范圍，但其中芽孢桿菌種類繁多，是乳粉中微生物的主要優勢菌。該研究為我國乳粉質量的監督與監測提供了數據支撐，為乳粉的安全風險評估提供了科學依據。

關鍵詞：乳粉；細菌總數；芽孢桿菌；16S rDNA；分離鑒定

中圖分類號：TS201.3""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）08-0007-05

Detection and Analysis of Dominant Bacillus in Different Milk Powder

XU Li-na1， LIU Shi-jie1， ZHU Yao-di1，2， ZHAO Li-jun1， LIANG Dong1，2，

ZHAO Gai-ming1， LI Miao-yun1*

（1.College of Food Science and Technology， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China;

2.Postdoctoral Innovation Base of Henan Jiuyuquan Food Co.， Ltd.， Xinxiang 453500， China）

Abstract： To study the total bacterial count and the composition of Bacillus species in milk powder and analyze the risk bacteria during the transportation， sales and storage of milk powder， in this study， with six kinds of milk powder from different places of origin of a domestic brand as the research object， the total bacterial count and the number of Bacillus in six kinds of milk powder are statistically analyzed by traditional plate culture method combined with non-heat treatment and heat treatment， and the dominant Bacillus in the samples is identified by morphology， Gram staining microscopy combined with 16S rDNA. The total bacterial count in the six samples is mainly in the range of 102～103 CFU/g， which is all less than the national standard of 5.0×104 CFU/g， and meets the safety range of GB 19644—2010. Bacillus is detected in all the six samples， with the detection value in the range of 101～102 CFU/g. According to morphological observation， seven kinds of Gram-positive Bacillus are classified. After 16S rDNA and BLAST comparison， Bacillus is identified as Bacillus licheniformis， Bacillus amyloliquefaciens， Bacillus circulans， Bacillus paramycoides， Bacillus subtilis， Bacillus velezensis and Bacillus cereus respectively. The total bacterial count of different milk powder meets the requirements of national standards， but there are many kinds of Bacillus， which are the main dominant bacteria in milk powder. This study has

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.002

引文格式：徐麗娜，劉世杰，朱瑤迪，等.不同乳粉中優勢芽孢桿菌的檢測與分析.中國調味品，2024，49（8）：7-11.

XU L N， LIU S J， ZHU Y D， et al.Detection and analysis of dominant Bacillus in different milk powder.China Condiment，2024，49（8）：7-11.

收稿日期：2024-01-15

基金項目：河南省重大科技專項（221100110500）；河南省杰出青年項目（212300410008）；河南省高等學校重點科研項目（22A550013）；河南省高校科技創新團隊支持計劃（22IRTSTHN021）；河南省科技攻關項目（232102110136）；河南省重點研發項目（22A550009）

作者簡介：徐麗娜（1979—），女，講師，碩士，研究方向：食品加工與質量控制。

*通信作者：李苗云（1976—），女，教授，博士，研究方向：食品加工與質量控制。

provided data support for supervision and monitoring of milk powder quality in China and scientific basis for safety risk assessment of milk powder.

Key words： milk powder; total bacterial count; Bacillus; 16S rDNA; separation and identification

乳粉是一種以新鮮牛奶或羊奶為原料，經過濃縮處理后用低溫或熱處理的方法開發的高營養產品，極易受微生物污染，尤其是芽孢桿菌，是極大的安全隱患。近年來隨著經濟的發展，人們對美好生活的需求日益增長，消費者對乳粉類健康、營養豐富的食品的消費量大幅度增加。隨著人們消費水平和生活水平的提高，乳粉不再僅僅是嬰幼兒和老年人群體必不可少的營養食品，在調味品行業中的使用也日益增加。根據餐飲業對標準便捷化的需求、家庭消費對方便味美營養的需求，復合調味品產品越來越趨向功能化，市場需求不斷增長。其中，乳粉是復合調味粉（如鴨湯調味粉、火鍋調味粉等）的主要原料之一，可在提高復合調味粉風味和口感的同時增加產品的營養價值。因此，乳粉的安全性是非常重要的。

芽孢桿菌是乳粉中常見的污染菌，每年由于食源性致病菌導致的食源性疾病造成全球約2 000萬人死亡，對食品質量安全存在極大的威脅，是產品變質的主要潛在危害。芽孢是芽孢桿菌在極端條件下形成的休眠體，抗逆性極強，一旦萌發即可產毒，不僅給企業造成極大的損失，而且給人體健康造成極大危害。其主要原因有兩個方面：一方面，生產乳粉的原料牛奶從農場到車間生產的過程中由于養殖環境自然化、生產加工以及包裝運輸過程復雜，非常容易引入芽孢桿菌；另一方面，芽孢的抗逆性強，其在經過巴氏殺菌和干燥等處理的過程中可以存活下來，并在乳粉中繼續以細菌休眠體的形式存在，一旦條件適宜便萌發形成菌落并快速繁殖，產生大量的蛋白酶、脂肪酶等各種酶類，降低食品的感官品質與營養價值，造成產品的腐敗變質甚至危害消費者的健康。2011年，孟浩浩等對牛乳進行超高溫滅菌處理前、后的微生物情況進行分析，得到牛乳中存在芽孢桿菌且通過超高溫滅菌方式難以殺死的結論。近年來，隨著乳粉現代化、工業化加工設備的進步和生產技術的革新，鮮見對乳粉中優勢芽孢桿菌鑒定和分析的及時有效的相關報道。

基于此，本研究以國內某品牌的6種不同產地的乳粉為研究對象，采用傳統的平板培養方法結合非熱處理和熱處理兩種處理方式對6種乳粉中菌落總數和芽孢數進行統計分析，進一步通過形態學觀察和分子生物學（16S rDNA）方法進行種屬鑒定，確定6種不同產地乳粉中的優勢芽孢桿菌類別，更加全面地了解乳粉中潛在優勢芽孢桿菌的種屬類別，以期對乳粉的質量檢測和復合調味粉的安全控制提供指導，保障復合調味粉在生產和運輸過程中的安全性并為消費者的健康提供保障。

1" 材料與方法

1.1" 材料與試劑

6種不同產地的乳粉由國內某品牌食品公司提供，將6種樣品分別編號為樣品1～6。

大豆酪蛋白瓊脂（soybean-casein digest agar，TSA）培養基、營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基、革蘭氏染色試劑盒：青島高科園海博生物技術有限公司；PCR檢測試劑盒、離心柱型細菌DNA提取試劑盒：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2" 儀器與設備

HIRAYAMA HVE-50高壓滅菌器" 華粵行儀器有限公司；BIOBASE生物安全柜" 濟南鑫貝西生物技術有限公司；Allegra-64R高速冷凍離心機" 美國Beckman Coutter公司；Nikon ECLIPSE 80i科研級顯微鏡" 日本尼康公司；AL104電子分析天平（測量精度為0.1 mg）" 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Biometra T-Gradient梯度PCR儀" 德國Biometra公司；IKA Vortex Geniu旋渦混勻儀" 北京佳源興業科技有限公司；MIR-254低溫培養箱" 日本Sanyo公司。

1.3" 微生物的分離培養與純化

參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》中的方法進行菌落總數的培養。

芽孢桿菌的分離培養與純化：在無菌條件下將6種樣品各取25 g于225 mL無菌生理鹽水中，于均質機中拍打2 min制備菌懸液，然后將上述菌懸液經80 ℃水浴熱處理10 min，冷卻至室溫后進行芽孢桿菌的分離培養，在無菌條件下準確吸取不同濃度梯度的菌懸液0.2 mL，分別涂布于TSA培養基表面，于37 ℃培養24～48 h后計數，同時用滅菌生理鹽水作空白對照。進一步將TSA培養基上菌落形態不同的典型菌株分別采取“三區劃線”方式純化3代，保存菌株備用。

1.4" 優勢芽孢桿菌的種屬鑒定

1.4.1" 優勢芽孢桿菌的菌落形態及鏡檢

觀察記錄熱激處理組分離純化的菌落形狀、邊緣、光滑度、透明度和顏色等，并通過計數對未知優勢芽孢桿菌進行初步判斷和分類，使用革蘭氏染色法對分離純化后的菌株進行微生物鏡檢，并判別微生物是革蘭氏陽性菌還是陰性菌。通過觀察分離到的微生物在平板上的菌落形態與在顯微鏡下觀察到的個體形態，參考《常見細菌系統鑒定手冊》對其進行初步判定。

1.4.2" 16S rRNA基因序列分析和系統發育樹的構建

采用細菌通用引物27F：AGAGTTTGATCMTGG-CTCAG；1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT，對三代純化后的未知優勢芽孢桿菌的16S rDNA進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖電泳分離。PCR產物送至生工生物工程（上海）有限公司測序，得到的16S rDNA序列在NCBI-GenBank進行BLAST同源性檢測分析，找到序列最相近的微生物種類。采用Mega 7.0軟件，用鄰接法構建系統發育樹，通過自舉分析進行置信度檢測，自舉數集1 000次，相似度達96%以上認為是同一種菌。

2" 結果與分析

2.1" 乳粉中的菌落總數和芽孢數分布情況

按1.3中的方法對6種不同產地乳粉中的菌落總數和芽孢桿菌數量的分布情況進行統計，結果見表1。

由表1可知，6種樣品中的菌落總數主要在102～103 CFU/g范圍內，均小于國家標準5.0×104 CFU/g，符合GB 19644—2010《食品安全國家標準 乳粉》的安全范圍。經檢測，6種樣品中均含有芽孢菌，芽孢菌數量主要在101～102 CFU/g范圍內，普遍存在于不同的乳粉樣品中，且芽孢的存在對乳粉在生產流通過程中的營養品質和消費者的健康安全存在潛在危害。因此，進一步對芽孢桿菌進行純化鑒定，可以為乳粉的質量監督與檢測提供指導意義。

2.2" 芽孢桿菌菌落形態及鏡檢結果

對熱激處理組的TSA培養基上微生物的菌落形態進行分類，共得到7種不同形態的優勢芽孢桿菌，分別編號 W1～W7，并進行菌落形態特征記錄和革蘭氏染色鏡檢。7種不同形態的優勢芽孢桿菌在TSA培養基上的形狀大小、光澤度、黏稠度等特征見表2，7種不同形態的優勢芽孢桿菌在TSA培養基上純化的菌落形態及革蘭氏染色鏡檢圖見圖1。

由表2可知，7種不同形態的優勢芽孢桿菌均為革蘭氏陽性桿菌。

2.3" 16S rRNA基因序列分析和系統發育樹的構建

提取7種待測菌株W1～W7 的DNA片段進行PCR擴增，將擴增得到的DNA片段進行核酸凝膠電泳30 min，7種待測菌株16S rDNA片段PCR擴增產物凝膠電泳圖見圖2。

由圖2可知，7種菌株均在1 500 bp處出現單一熒光條帶，產物條帶清晰，符合測序需要。

對7種待測優勢菌株進行16S rDNA測序后，將序列結果錄入NCBI數據庫進行BLAST同源性檢索分析，結果見表3。

分別將7株優勢菌株的16S rDNA序列與GenBank上5株同源性較高的菌株序列進行對比，利用Mega 7.0軟件構建系統發育樹，見圖3。

由表3和圖3可知，W1號菌株的16S rDNA序列與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）同源性最高，匹配度為99.17%，并且在圖3的系統發育樹中W1和Bacillus licheniformis位置最近，親緣關系較近，因此，W1被鑒定為Bacillus licheniformis。同理，根據16S rDNA序列同源性對比和系統發育樹的構建，可以得到：W2號菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），W3號菌為環狀芽孢桿菌（Niallia circulans），W4號菌為副蕈樣芽孢桿菌（Bacillus paramycoides），W5號菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），W6號菌為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），W7號菌為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。其中，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌與蠟樣芽孢桿菌與王偉軍等在2015年從原料乳粉中分離到的芽孢桿菌種屬一致；2016年，閆琳等對中國10個省市售的乳粉進行食源性致病菌污染水平調查的結果顯示，蠟樣芽孢桿菌是乳粉中主要的致病菌。不同配方、不同產地的乳粉中芽孢桿菌污染雖然存在不同程度上的差異，但是芽孢桿菌在乳粉中均有檢出，應當在運輸、銷售、貯藏過程中做好微生物防控措施，避免優勢芽孢桿菌的繁殖增長，保障消費者的健康和安全。

3" 結論

本研究以國內某品牌的6種不同產地的乳粉為研究對象，采用傳統的平板培養方法結合非熱處理和熱處理兩種處理方式對6種乳粉中菌落總數和芽孢數進行統計分析，進一步通過形態學觀察和分子生物學（16S rDNA）方法進行種屬鑒定，確定6種不同產地乳粉中的優勢芽孢桿菌類別及污染情況。結果顯示，6種樣品中的菌落總數主要在102～103 CFU/g范圍內，均小于國家標準5.0×104 CFU/g，符合GB 19644—2010《食品安全國家標準 乳粉》的安全范圍。芽孢桿菌在6種樣品中均有檢出，檢出值在101～102 CFU/g范圍內。進一步，通過微生物分離純化得到7種典型菌落形態的優勢芽孢桿菌，通過16S rDNA和BLAST比對鑒定可知，優勢芽孢桿菌分別為Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Niallia circulans、Bacillus paramycoides、Bacillus subtilis、Bacillus velezensis和Bacillus cereus。通過檢測乳粉的菌落總數和芽孢菌數量及種屬分布，為我國乳粉和復合調味粉的安全質量監督與風險評估、企業產品質量提升提供了一定數據支撐和科學依據，并為標準的制定提供了有力參考。

參考文獻：

PEREIRA A P M， SANT'ANA A S. Diversity and fate of spore forming bacteria in cocoa powder， milk powder， starch and sugar during processing： a review.Trends in Food Science amp; Technology，2018，76：101-118.

JIAN Z， MENGRUI Y， FUKAI L， et al. Development of matrix certified reference material for accurate determination of docosahexaenoic acid in milk powder.Food Chemistry，2023，406（3）：135012.

羅麗，宋禮，崔廣智，等.混料設計在中老年牦牛乳蛋白粉配方研究中的應用.食品研究與開發，2018，39（15）：80-84.

白建，薛建娥，沙闖闖.乳清在奶酪制作中的工藝優化.中國調味品，2021，46（10）：121-123，143.

劉志聰，王輝，李軍，等.鴨湯調味粉制備工藝優化及其揮發性風味物質分析.食品工業科技，2023，44（19）：336-346.

唐晨希.低脂低鹽脆性休閑調味面制品的研制.武漢：武漢輕工大學，2018.

劉達玉，劉陽，鄧靜，等.自然發酵甜面醬中芽孢桿菌的分離、篩選及鑒定.中國調味品，2018，43（10）：5-10.

DETTLING A， WEDEL C， HUPTAS C， et al. High counts of thermophilic spore formers in dairy powders originate from persisting strains in processing lines.International Journal of Food Microbiology，2020，335：108888.

楊春暉，王文平，續丹丹.腐乳及其生產過程中蠟樣芽孢桿菌的防控及檢測方法研究進展.中國調味品，2023，48（9）：214-220.

孟浩浩，李婷，顧雯雯，等.牛乳超高溫滅菌前后芽孢桿菌分離鑒定.乳業科學與技術，2011，34（1）：9-11.

MOEJES S N， VAN BOXTEL A J B. Energy saving potential of emerging technologies in milk powder production.Trends in Food Science amp; Technology，2017，60（1）：31-42.

LIU S， ZHU Y， LI M， et al. Rapid identification of different pathogenic spore-forming bacteria in spice powders using surface-enhanced Raman spectroscopy and chemometrics. Food Analytical Methods，2022，15（10）：2810-2820.

HAFIDA W， ABIOLA O F， KUMAH B M， et al. Effect of dual-frequency thermosonication， food matrix， and germinants on Alicyclobacillus acidoterrestris spore germination.Food Research International，2023，171（4）：113054.

東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊.北京：科學出版社，2001.

孫玉俠，黃國保.16S rDNA鑒定泡椒鳳爪中的腐敗菌.食品安全導刊，2023（6）：73-75.

李建洲，邵偉，陳賀，等.生鮮乳中芽孢桿菌的危害與控制措施.中國奶牛，2020（5）：47-52.

吳霜.乳粉加工環境中蠟樣芽孢桿菌分型及耐熱性的研究.哈爾濱：東北農業大學，2018.

程輝，王鎵萍，陶瀟杭，等.脹包常溫酸奶中產氣微生物的分離鑒定與特性研究.飲料工業，2022，25（4）：16-20.

王偉軍，何光華，王嬌，等.原料乳粉中常見芽孢菌的分離鑒定及控制.中國乳品工業，2016，44（1）：15-18.

閆琳，李瑩，楊大進，等.市售乳粉中致病菌污染狀況檢測分析.中國公共衛生，2016，32（5）：602-604.