復合酶酶解法制備中華草龜皮膠原蛋白肽的工藝優化

摘要：該研究探討了不同種類蛋白酶對中華草龜皮膠原蛋白酶解液的水解度和DPPH自由基清除率的影響，并進一步研究了復合蛋白酶對膠原蛋白的酶解效果。此外，通過正交試驗優化了復合酶酶解條件。結果表明，由胰蛋白酶和堿性蛋白酶按1∶1組成的復合酶對龜皮膠原蛋白進行酶解，可顯著提高酶解液的水解度和DPPH自由基的清除率（Plt;0.05）；優化的復合酶酶解工藝為復合酶添加量5 000 U/g、酶解pH值7.5、酶解溫度50 ℃、酶解時間3 h，在該酶解工藝條件下，水解度達（51.19±2.45）%，DPPH自由基清除率達（51.78±2.21）%。影響復合酶酶解效果的主次順序為酶添加量gt;酶解pH值gt;酶解時間gt;酶解溫度。

關鍵詞：中華草龜；膠原蛋白肽；復合酶酶解；胰蛋白酶；堿性蛋白酶

中圖分類號：TS201.25""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）08-0028-06

Optimization of Preparation Technology of Chinemys reevesii Skin Collagen

Peptide by Compound Enzymes Enzymatic Hydrolysis Method

YU Dan-dan1， WEI Wen-zhi2， GUAN Li1， CHEN Wen-zhuo1， CAO Hui1*

（1.College of Tourism and Culinary Science， Yangzhou University， Yangzhou 225127， China;

2.College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225001， China）

Abstract： In this study， the effects of different types of proteases on the hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging rate of Chinemys reevesii skin collagen enzymatic hydrolysate are studied， and the enzymatic hydrolysis effect of compound proteases on collagen is further studied. In addition， the enzymatic hydrolysis conditions of compound enzymes are optimized by orthogonal test. The results show that the hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic hydrolysate are significantly improved （Plt;0.05） when Chinemys reevesii skin collagen is hydrolyzed by the compound enzymes composed of trypsin and alkaline protease at 1∶1.The optimized compound enzymatic hydrolysis process is as follows： the addition amount of compound enzymes is 5 000 U/g， enzymatic hydrolysis pH value is 7.5， enzymatic hydrolysis temperature is 50 ℃， and enzymatic hydrolysis time is 3 h. Under such enzymatic hydrolysis process conditions， the hydrolysis degree reaches （51.19±2.45）%， and the DPPH free radical scavenging rate reaches （51.78±2.21）%.The primary and secondary order that affects the compound enzymatic hydrolysis effect is enzyme addition amountgt;enzymatic hydrolysis pH valuegt;enzymatic hydrolysis timegt;enzymatic hydrolysis temperature.

Key words： Chinemys reevesii; collagen peptide; compound enzymes enzymatic hydrolysis; trypsin; alkaline protease

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.006

引文格式：虞丹丹，魏文志，關利，等.復合酶酶解法制備中華草龜皮膠原蛋白肽的工藝優化.中國調味品，2024，49（8）：28-33.

YU D D， WEI W Z， GUAN L， et al.Optimization of preparation technology of Chinemys reevesii skin collagen peptide by compound enzymes enzymatic hydrolysis" method.China Condiment，2024，49（8）：28-33.

收稿日期：2024-01-14

基金項目：蘇北科技專項（2021022）

作者簡介：虞丹丹（1998—），女，碩士，研究方向：食品營養與衛生。

*通信作者：曹暉（1968—），女，副教授，博士，研究方向：食品營養與加工。

龜甲膠是我國的名貴中藥材，而中華草龜是加工龜甲膠的主要原料，在中國、韓國和日本分布廣泛。近年來，隨著中藥材龜板的取用以及市場上對龜甲膠需求量的增大，產生了大量中華草龜皮，研究表明中華草龜皮富含膠原蛋白。膠原蛋白為大分子物質，具有抗氧化性，進入人體小腸后難以被吸收，但降解為多肽后較易被吸收。近年來，酶解制備膠原蛋白肽的研究表明，膠原蛋白肽具有抗氧化、抑菌、降血壓等生物功能，可增強食品的保健功能；而蛋白酶酶解所制備的膠原蛋白肽含有豐富的呈味氨基酸，呈味性能較好，可用于開發新型調味品。

膠原蛋白肽的制備方法主要分為化學法、生物酶酶解法。化學法制備膠原蛋白肽，肽損失嚴重；生物酶酶解法制備膠原蛋白肽，污染風險低，但大多采用單酶水解，水解度較低。提高動物皮膠原蛋白的水解度及其肽的生物活性備受廣大科研者的關注。現有研究表明，復合酶酶解工藝可以產生數量更多、分子量更小的多肽，于文影研究表明，單酶酶解膠原蛋白，酶解液的水解度最大為18.03%，而胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復合酶酶解水解度提高到21.41%。彭易鑫等研究表明雙酶復合酶解得到的多肽的抗氧化能力明顯高于單酶酶解。

目前，使用復合酶法制備中華草龜皮膠原蛋白肽的研究較少，本研究探討了不同蛋白酶對中華草龜皮膠原蛋白酶解效果的影響，并優化了復合酶酶解工藝，以期為新型調味品的開發利用提供理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 試驗原料與試劑

中華草龜皮膠原蛋白：實驗室自制；胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶：均購于上海源葉生物科技有限公司；乙酸、氫氧化鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、鄰苯二甲醛、四硼酸鈉、PBS緩沖液：均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2" 試驗設備與儀器

BBA124S/224S分析天平" 山東歐萊博儀器有限公司；PHS-3C pH計" 上海儀分科學儀器有限公司；LyoBeta冷凍干燥機" 西班牙Telstar公司；Allegra X-30R臺式高速冷凍離心機" 美國貝克曼庫爾特有限公司；SHZ-82A水浴恒溫振蕩器" 金壇市盛威實驗儀器廠；Infinite M200 Pro酶標儀" 北京龍躍生物科技發展有限公司。

1.3" 試驗方法

1.3.1" 中華草龜皮膠原蛋白酶解工藝流程

稱取適量中華草龜皮膠原蛋白，用PBS緩沖液溶解，制備底物濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液。將溶液的pH值調至蛋白酶最適pH值，酶解4 h，沸水浴10 min，冷卻至室溫后調pH值至中性。以4 000 r/min離心15 min，過濾，取上清液，真空冷凍干燥。

1.3.2" 水解度（DH）的測定

膠原蛋白肽的水解度采用鄰苯二甲醛（OPA）法測定。

OPA試劑（現配現用）：將200 mg OPA溶解于5 mL無水乙醇中，加入125 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液（pH 9.75）、0.5 mL β-巰基乙醇和12.5 mL 10% SDS溶液，定容至250 mL。

酶解液水解度的測定：將50 μL膠原蛋白酶解液與3 mL OPA試劑混合，室溫下靜置5 min，在340 nm處測定其吸光值。

Serine NH2=A樣品-A空白A標準-A空白×CSerine NH2×10-3×DX×P。

式中：CSerine NH2為每克蛋白中所含L-絲氨酸含量，0.951 6 mmol/g；D為稀釋倍數；X為樣品質量，g；P為樣品中蛋白質含量，%。

水解度（%）=（Serine NH2-β）/αHhot×100%。

式中：Hhot為膠原蛋白中含有的肽鍵總數，11.1 mmol/g；α=0.8，β=0.5。

1.3.3" DPPH自由基清除率的測定

參照Huang等的方法，準確稱取DPPH，配制成0.2 mmol/L DPPH溶液，于棕色瓶中避光低溫保存。取2 mL樣品液于試管內，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混合均勻，室溫下避光靜置30 min 后，測定其在517 nm 處的吸光值。樣品的DPPH·清除率按下式計算：

清除率（%）=（1－A1－A2A3）×100%。

式中：A1為樣品加DPPH溶液的吸光值；A2為樣品加95%乙醇溶液的吸光值；A3為DPPH溶液加95%乙醇溶液的吸光值。

1.3.4" 單一蛋白酶的篩選

將冷凍干燥的膠原蛋白用0.02 mol/L、pH值為7.5的PBS溶液配制成5 mg/mL的膠原蛋白溶液，用恒溫磁力攪拌器加熱至所需溫度，5種酶的最佳酶解條件見表1。在不同蛋白酶最適條件下酶解，比較各組的水解度。

1.3.5" 復合蛋白酶的篩選

將胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶兩兩復配，復配比為1∶1，酶添加量為4 000 U/g，復合蛋白酶的酶解條件見表2，酶解4 h后比較各組酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.6" 復合酶酶解單因素試驗

1.3.6.1" 酶解pH值對酶解反應的影響

取20 mL濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液，將溶液的pH值調至5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，酶添加量為4 000 U/g，胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復配比為1∶1，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為4 h，測定酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.6.2" 酶解溫度對酶解反應的影響

取20 mL濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液，將溶液的pH值調至8.5，酶添加量為4 000 U/g，胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復配比為1∶1，分別在40，45，50，55，60 ℃的酶解溫度下酶解4 h，測定酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.6.3" 酶解時間對酶解反應的影響

取20 mL濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液，將溶液的pH值調至8.5，酶解溫度為50 ℃，酶添加量為4 000 U/g，胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復配比為1∶1，分別酶解2，3，4，5，6 h，測定酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.6.4" 復合酶添加量對酶解反應的影響

取20 mL濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液，將溶液的pH值調至8.5，酶解溫度為50 ℃，胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復配比為1∶1，分別加入3 000，3 500，4 000，4 500，5 000 U/g的復合酶酶解4 h，測定酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.6.5" 復配比對酶解反應的影響

取20 mL濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液，將溶液的pH值調至8.5，酶解溫度為50 ℃，酶添加量為4 000 U/g，分別加入復配比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的胰蛋白酶和堿性蛋白酶酶解4 h，測定酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.7" 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，以水解度（DH）、DPPH·清除率的總評歸一值（OD）為指標，設計復合酶添加量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時間的四因素三水平正交試驗L9（34），試驗方案見表3。

1.3.8" 數據處理

使用SPSS 20.0軟件進行數據顯著性分析，利用Excel 2016、Origin 2021軟件繪制圖表，所有試驗均重復3次。Plt;0.05表示數據具有顯著性差異。

2" 結果與分析

2.1" 單一蛋白酶的篩選

由圖1可知，中華草龜皮膠原蛋白經胰蛋白酶酶解效果最好，水解度達35.37%，DPPH·清除率達28.98%，顯著高于其他4種蛋白酶（Plt;0.05）；堿性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果較好，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解效果較差。5種蛋白酶的水解度和DPPH·清除率從大到小是Trygt;Alcgt;Neugt;Pepgt;Pap。結果表明，不同蛋白酶的酶解效果不同，主要是由于蛋白酶具有專一性，單酶只能水解固定的肽鍵，水解程度受到限制。復合酶切斷肽鍵的位置不同，能進一步降低產物的分子量，得到分子量合理分布的膠原蛋白肽。因此，本試驗選定胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶3種蛋白酶兩兩復配來酶解膠原蛋白。

2.2" 復合蛋白酶的篩選

由圖2可知，中華草龜皮膠原蛋白經胰蛋白酶和堿性蛋白酶復合酶解效果最好，其水解度明顯高于其他兩組復合酶，且DPPH·清除率最高可達43.54%。因此，本研究確定采用胰蛋白酶和堿性蛋白酶復配來酶解中華草龜皮膠原蛋白。

2.3" 復合酶酶解單因素試驗結果

2.3.1" 復合酶酶解pH值的確定

由圖3可知，pH值在5.5～8.5之間時，水解度和DPPH·清除率均呈現上升趨勢；當pH值為8.5時，水解度和DPPH·清除率均達到最大；當pH值gt;8.5時，水解度和DPPH·清除率均逐漸下降。由于蛋白酶的空間構型會受pH值的影響而產生變化，當pH值不適宜時蛋白酶活力降低甚至失活；并且底物與蛋白酶的解離狀態也會受到pH值的影響，從而影響蛋白質的水解度。pH值為8.5時復合酶的酶活力最強，酶解效果最好。

2.3.2" 復合酶酶解溫度的確定

由圖4可知，酶解溫度在40～50 ℃之間時，水解度和DPPH·清除率均逐漸上升；當酶解溫度為50 ℃時，水解度和DPPH·清除率均達到最大；當酶解溫度大于50 ℃時，水解度和DPPH·清除率均呈下降趨勢。由于蛋白酶活力會受到溫度的影響，酶解溫度過低時，蛋白酶活力會降低，酶解反應速率降低；酶解溫度過高時，酶的空間結構會發生變化，導致酶活力下降甚至失活，從而影響蛋白質的水解度。因此，復合酶酶解的最佳溫度為50 ℃。

2.3.3" 復合酶酶解時間的確定

由圖5可知，酶解時間在2～4 h之間時，水解度和DPPH·清除率均呈上升趨勢，此時酶解反應處于加速反應階段；當酶解時間為4 h時，水解度和DPPH·清除率均達到最大，酶與底物反應完全；當酶解時間大于4 h時，水解度和DPPH·清除率均呈下降趨勢，隨著酶解時間的延長，底物濃度相應降低，生成的復合物濃度增加使蛋白酶的活性中心被覆蓋，抑制了酶解反應，從而導致膠原蛋白的水解度下降。因此，選擇4 h為最適酶解時間。

2.3.4" 復合酶添加量的確定

由圖6可知，隨著復合酶添加量的增加，酶解液的水解度和DPPH·清除率均呈現上升趨勢。由于起初復合蛋白酶添加量增加，底物膠原蛋白得到充分水解，水解度增加。當復合酶添加量達到4 000 U/g時，水解度和DPPH·清除率均趨于平緩，由于底物膠原蛋白不足，酶用量達到過飽和狀態。因此，考慮到經濟成本，選擇4 500 U/g為最適復合酶添加量。

2.3.5" 復合酶復配比的確定

由圖7可知，隨著胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復配比逐漸減小，酶解液的水解度呈現先上升后下降的趨勢。當復配比為2∶1時，水解度為48.88%，當復配比為1∶1時，水解度為48.69%，兩者相差不大，且當復配比為1∶1時，DPPH自由基清除率最大，因此，選擇1∶1為最適復配比。

2.4" 復合酶酶解正交試驗結果

由表4可知，影響復合酶酶解效果的主次順序為復合酶添加量gt;酶解pH值gt;酶解時間gt;酶解溫度，最優組合A3B2C1D1。復合蛋白酶酶解中華草龜皮膠原蛋白的最佳酶解條件為酶解溫度50 ℃、酶解pH值7.5、酶解時間3 h、復合酶添加量5 000 U/g。

由表5可知，對正交試驗結果進行方差分析，復合酶添加量、酶解pH值、酶解時間對酶解效果的影響極顯著（Plt;0.01），而酶解溫度對酶解效果的影響顯著（0.01lt;Plt;0.05）。對上述工藝條件進行驗證試驗，在A3B2C1D1條件下測得水解度和DPPH·清除率較好，分別為（51.19±2.45）%和（51.78±2.21）%。因此，最終確定復合酶的最佳酶解條件為復合酶添加量5 000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解pH值7.5、酶解時間3 h。

采用最優酶解條件制備的中華草龜皮膠原蛋白多肽液凍干粉見圖8，膠原蛋白肽呈粉末狀，顏色呈乳白色，稍有腥味，沒有肉眼可見的雜質，符合國家質量檢測標準GB 31645—2018。

3" 結論

以水解度和DPPH·清除率為指標，篩選出胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶3種單一蛋白酶。胰蛋白酶酶解膠原蛋白酶解液的水解度最高，為（35.37±1.25）%，DPPH·清除率最高，為（28.98±1.12）%。最佳復合酶組合為胰蛋白酶和堿性蛋白酶按照1∶1的比例進行復配。復合酶酶解正交試驗結果得出最優酶解條件為復合酶添加量5 000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解pH值7.5、酶解時間3 h，在此條件下進行驗證試驗，獲得水解度為（51.19±2.45）%，DPPH·清除率為（51.78±2.21）%。綜上所述，采用復合酶法制備中華草龜皮膠原蛋白肽顯著提高了膠原蛋白酶解液的水解度和DPPH·清除率（Plt;0.05），縮短了酶解時間，為制備新型調味品的工業化生產提供了理論依據。

參考文獻：

CHANG M H， SONG J Y， KOO K S. The status of distribution for native freshwater turtles in Korea， with remarks on taxonomic position.Korean Journal of Environmental Biology，2012，30（2）：151-155.

李晴，朱香梅，石雨荷，等.龜甲膠研究發展探析.河南中醫，2023，43（6）：968-972.

黃文，印大中，朱澤瑞.龜皮膠原蛋白的提取及結構表征（Ⅰ）.湖北大學學報（自然科學版），2010，32（4）：434-437.

丁琳.鵝皮膠原蛋白的提取及功能性研究.寧波：寧波大學，2015.

程進霞，李景軍.食物源活性肽及其生物功能特性研究現狀.新疆師范大學學報（自然科學版），2022，41（4）：16-24.

WANG B，WANG Y M，CHI C F，et al.Isolation and characterization of collagen and antioxidant collagen peptides from scales of croceine croaker （Pseudosciaena crocea）.Marine Drugs，2013，11：4641-4661.

萬春燕，王英華，鄔元娟，等.膠原蛋白在食品中的應用現狀及其發展前景.中國食物與營養，2008（9）：24-26.

畢琳.刺參（Stichopus japonicus）體壁膠原蛋白理化性質和生物活性研究.青島：中國海洋大學，2006.

于文影.鹿角脫盤多肽的制備及其生物活性的研究.長春：吉林農業大學，2011.

彭易鑫，陸旭麗，代亞萍，等.響應面法優化復合酶酶解制備可口革囊星蟲膠原蛋白抗氧化肽工藝研究.食品工業科技，2021，42（22）：230-239.

劉曉艷，葉月華，白衛東，等.外源物質對低鹽羅非魚糜蛋白構象及體外消化特性的影響.食品工業科技，2024，45（1）：80-87.

HUANG J J， LI H L， XIONG G Q， et al. Extraction， identification and anti-photoaging activity evaluation of collagen peptides from silver carp （Hypophthalmichthys molitrix） skin.LWT-Food Science and Technology，2023，173：114384.

SAMARANAYAKA A G P， LI-CHAN E C Y. Food-derived peptidic antioxidants： a review of their production， assessment， and potential applications.Journal of Functional Foods，2011，3（4）：229-254.

嚴超，牟建樓，陳志周，等.櫛孔扇貝酶解液制備條件優化及其抗氧化性研究.中國調味品，2017，42（12）：1-6.

CHOWDARY G V， KRISHNA S H， RAO G H. Optimization of enzymatic hydrolysis of mango kernel starch by response surface methodology.Bioprocess Engineering，2000，23（6）：681-685.

南學敏.羊骨膠原蛋白肽抗氧化活性及氨基酸組成分析.呼和浩特：內蒙古農業大學，2019.

XIE Z K， WANG X G， YU S Y， et al.Antioxidant and functional properties of cowhide collagen peptides.Journal of Food Science，2021，86（5）：1802-1818.

張典，李齡佳，崔春，等.牡蠣酶解工藝的響應面優化研究.中國調味品，2019，44（5）：12-16.

桂海佳，李江龍，李澤林，等.基于雙酶水解優化牛肉酶解液工藝及其呈味成分分析.中國調味品，2022，47（10）：103-109.

文章，李周，賀富強，等.雙酶分步水解醬香型白酒丟糟中粗蛋白的工藝研究.食品工業，2018，39（2）：79-83.

梁曉芳，牟建樓，嚴超，等.扇貝酶解條件的優化及其抗氧化性的研究.中國調味品，2018，43（1）：61-66.

國家市場監督管理總局，國家衛生健康委員會.食品安全國家標準 膠原蛋白肽：GB 31645—2018.北京：中國標準出版社，2018.