響應面法優化三文魚骨排酶解工藝的研究

摘要：采用雙酶復合酶解法處理三文魚骨排，以水解度、TCA-可溶性肽含量、電子舌關鍵味覺響應值為指標，篩選出最適蛋白酶組合。以酶解溫度、液固比、酶解pH、酶解時間、酶添加量5個因素進行單因素試驗，通過Plackett-Burman試驗篩選關鍵因素并進行響應面試驗優化酶解工藝。結果表明，三文魚骨排復合酶解的最適蛋白酶組合為復合蛋白酶∶風味蛋白酶2∶1，最佳工藝條件為酶解溫度49 ℃、液固比3.9∶1、酶添加量0.85%、酶解pH 8.0、酶解時間3 h，在此條件下得到酶解液的水解度和TCA-可溶性肽含量分別為18.11%和9.45 mg/mL，與預測值無顯著性差異（Pgt;0.05）。該研究為三文魚骨排的深加工和高值化利用提供了一定的參考。

關鍵詞：三文魚骨排；響應面；酶解；工藝優化

中圖分類號：TS254.4""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）08-0090-08

Study on Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process of Salmon Bone

Steak by Response Surface Methodology

LIN Deng-feng， LI Shan-hui， ZHAO Hong-lei， LI Xue-peng， BU Ying， LI Jian-rong， XU Yong-xia*

（Institute of Ocean Research， College of Food Science and Engineering，

Bohai University， Jinzhou 121013， China）

Abstract： Salmon bone steak is treated with double enzyme complex enzymatic hydrolysis method， and the optimum combination of proteases is screened with degree of hydrolysis， TCA-soluble peptide content and key taste response value of electronic tongue as the indexes.Single factor test is conducted on five factors of enzymatic hydrolysis temperature， liquid-solid ratio， enzymatic hydrolysis pH， enzymatic hydrolysis time and enzyme addition amount.The key factors are screened by Plackett-Burman test and response surface test is carried out to optimize the enzymatic hydrolysis process. The results show that the optimum protease combination of salmon bone steak is the ratio of complex protease to flavorzyme of 2∶1， and the optimum process conditions are enzymatic hydrolysis temperature of 49 ℃， liquid-solid ratio of 3.9∶1， enzyme addition amount of 0.85%， enzymatic hydrolysis pH of 8.0， and enzymatic hydrolysis time of 3 h. Under these conditions， the degree of hydrolysis and TCA-soluble peptide content are 18.11% and 9.45 mg/mL respectively， which are not significantly different from the predicted values （Pgt;0.05）. This study has provided some references for the deep processing and high-value utilization of salmon bone steak.

Key words： salmon bone steak; response surface; enzymatic hydrolysis; process optimization

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.016

引文格式：林登峰，李珊慧，趙洪雷，等.響應面法優化三文魚骨排酶解工藝的研究.中國調味品，2024，49（8）：90-97.

LIN D F， LI S H， ZHAO H L， et al.Study on optimization of enzymatic hydrolysis process of salmon bone steak by response surface methodology.China Condiment，2024，49（8）：90-97.

收稿日期：2024-01-28

基金項目：遼寧省教育廳重點攻關項目（LJKZZ20220119）

作者簡介：林登峰（1999—），男，碩士，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：徐永霞（1983—），女，教授，博士，研究方向：水產品貯藏加工及風味化學。

三文魚（Salmo salar）又名鮭魚、大西洋鮭，屬硬骨魚綱、鮭形目、鮭科、大西洋鮭屬，主要分布在北半球高緯度的冷水水域中。三文魚營養豐富，富含優質蛋白、ω-3不飽和脂肪酸如DHA和EPA，以及Ca、K、Mg、Zn、P等礦物質，同時富含B族維生素、維生素A和維生素D等，深受廣大消費者的喜愛。三文魚多以生鮮刺身的形式進行銷售，在加工過程中經過放血、去內臟、剝皮、切片等工序后會產生大量副產物（如魚頭、魚尾、魚排等），約占整條魚質量的35%，這些副產物通常被用于生產魚粉、魚油、動物飼料或直接丟棄，附加值低。

水產品加工副產物中含有許多營養豐富的生物活性成分，如蛋白質、維生素、礦物質、不飽和脂肪酸、脂質、類胡蘿卜素等，這些物質在制藥行業、營養保健行業、食品行業有潛在的應用價值。目前從水產品加工副產物中提取生物活性物質的方法主要有超聲輔助萃取法、脈沖電場技術、超臨界流體萃取法、靜態高壓技術、膜技術和酶解輔助提取技術，其中酶解技術操作簡便，條件溫和，對環境的污染小，并且無有害的副產物產生，目前應用最廣泛。Cai等從草魚皮水解物中分離出了3種抗氧化肽并對其性質進行了研究。孫靜等采用響應面法對鰹魚下腳料的酶解工藝進行了優化。

在蛋白質水解過程中會形成許多含有疏水性氨基酸的肽，從而使酶解液產生苦味。近年來的研究發現，連續酶解、多酶復合酶解、分段式酶解均能有效地減少酶解產物的苦味并增加鮮味，改善酶解液的風味。Chen等研究發現，對香菇進行連續酶解能夠顯著地改善香菇酶解產物的風味特性。Li等采用雙酶復合酶解克氏原螯蝦，酶解產物的相對分子量集中在0.5 kDa以下，主要以游離氨基酸和二肽的形式存在。Tong等采用兩步酶解法對大豆蛋白進行水解，得到了苦味低、抗氧化活性高的大豆蛋白水解物。Cui等采用兩步酶解法處理乳蛋白濃縮物，發現經堿性蛋白酶和風味蛋白酶處理的水解產物具有較好的抗氧化能力。

本研究以三文魚骨排為原料，采用雙酶復合酶解，以水解度和TCA-可溶性肽含量和電子舌關鍵味覺響應值為指標，在單因素試驗的基礎上，通過Plackett-Burman試驗和響應面試驗優化最佳酶解工藝，以期為三文魚加工副產物的高值化利用提供一定的理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 材料與試劑

三文魚骨排：購于錦州林西路海鮮市場。

復合蛋白酶（100 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；木瓜蛋白酶（200 000 U/g）、菠蘿蛋白酶（50 000 U/g）、中性蛋白酶（100 000 U/g）、堿性蛋白酶（50 000 U/g）、風味蛋白酶（30 000 U/g）：河南萬邦化工科技有限公司；三氯乙酸、氫氧化鈉標準滴定液：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氫氧化鈉、酒石酸、氯化鉀、無水硫酸銅、甲醛溶液：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2" 儀器與設備

SA402B味覺分析系統" 日本Insent公司；UV-1801紫外可見分光光度計" 北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司；K9840凱氏定氮儀" 鄭州海能儀器有限公司；SHA-B往復式恒溫水浴振蕩器" 億通電子有限公司；LYNX-4000高速冷凍離心機" 美國Thermo Fisher Scientific公司；PL602-L分析天平" 寧波舜宇精工股份有限公司；FE-28 pH計" 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3" 試驗方法

1.3.1" 三文魚骨排酶解產物的制備

將魚骨排除去黑膜和淤血后切成寬5～6 cm、厚1.0～1.2 cm的小塊，清洗干凈。稱取適量攪碎的三文魚骨排于錐形瓶中，選用風味蛋白酶與其他5種蛋白酶以1∶2的比例進行復合酶解，酶解條件見表1。酶解結束后置于沸水浴中滅酶15 min，過濾除去雜質，然后在4 ℃、5 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液備用。

1.3.2" 水解度的測定

利用甲醛滴定法測定酶解液中的氨基酸態氮含量，總氮含量采用GB 5009.5—2016中的方法進行測定，并按下式計算水解度：

水解度（%）=氨基酸態氮含量（g/dL）總氮含量（g/dL）×100%。

1.3.3" TCA-可溶性肽含量的測定

參考朱均旺等的方法并稍作修改。取5.0 mL酶解液，加入等體積的15% TCA溶液混合后靜置30 min，然后在4 ℃下以5 000 r/min離心15 min，吸取1.0 mL上清液加入3.0 mL雙縮脲試劑，在540 nm處測定吸光度值，結果表示為mg/mL。

1.3.4" 電子舌測定

取三文魚骨排酶解液10.0 mL，定容至100 mL。取適量樣品倒入電子舌專用樣品杯中，對樣品的滋味輪廓進行分析，將重復次數設置為4次，并去掉第1次循環所得數據。測試前對探頭進行活化和校準以確保試驗結果的準確度。

1.3.5" 單因素試驗

將風味蛋白酶與復合蛋白酶以1∶2的質量比進行復合酶解，研究不同酶解溫度（40，45，50，55，60 ℃）、不同液固比（2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1）、不同酶解pH（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）、不同酶解時間（1，2，3，4，5 h）、不同酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）對三文魚骨排酶解液水解度和TCA-可溶性肽含量的影響。

1.3.6" Plackett-Burman試驗設計

根據單因素試驗結果，以水解度為主要響應值，TCA-可溶性肽含量為輔助響應值，采用Plackett-Burman試驗設計篩選關鍵影響變量，試驗因素水平設計見表2。

1.3.7" 響應面試驗設計

在Plackett-Burman試驗的基礎上，選擇酶解溫度、液固比、酶添加量3個因素進行Box-Behnken響應面試驗，以水解度和TCA-可溶性肽含量為響應值，優化三文魚骨排的酶解工藝，具體因素水平見表3。

1.4" 數據分析

使用統計軟件SPSS 19.0對試驗數據進行處理，結果用平均值±標準差表示。采用Duncan方法進行顯著性分析，Plt;0.05表示差異顯著，采用Origin 2019軟件進行數據繪圖，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行Plackett-Burman試驗、Box-Behnken試驗設計、模型構建和數據分析。所有試驗平行進行3次。

2" 結果與分析

2.1" 不同酶處理對酶解產物水解度、TCA-可溶性肽含量和電子舌響應值的影響

由圖1可知，復合蛋白酶與風味蛋白酶進行組合酶解后，酶解液的水解度達到13.23%，顯著高于其他處理組（Plt;0.05），這可能是因為復合蛋白酶中兼有內切酶和外切酶，既能切割蛋白內部的肽鍵，又能作用于C端或N端的肽鍵，提高蛋白質的水解效率。而木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶與風味蛋白酶進行組合酶解后的水解度均小于10%，這可能是因為這幾種蛋白酶的作用方式和酶切位點有各自的局限性，堿性蛋白酶主要作用于羧基側，是疏水性氨基酸的肽鍵；木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶主要作用于羧基側，是Val、Phe、Leu殘基的肽鍵。采用電子舌對酶解液的滋味特性進行分析，結果見圖2。

由圖2可知，復合蛋白酶與風味蛋白酶組合使用時，酶解產物的鮮味最強，苦味最弱，豐富性較好；堿性蛋白酶、中性蛋白酶與風味蛋白酶進行組合后的苦味最強，可能是由于堿性蛋白酶和中性蛋白酶水解蛋白質后生成了更多含有疏水性氨基酸殘基的多肽鏈和苦味氨基酸，使得酶解液的苦味較強。所有處理組在澀味回味上差別不大。

綜合水解度、TCA-可溶性肽含量、電子舌關鍵味覺響應值考慮，選擇復合蛋白酶+風味蛋白酶（2∶1）進行后續試驗。

2.2" 單因素試驗結果

2.2.1" 酶解溫度對酶解效果的影響

酶解溫度對三文魚骨排酶解液水解度和TCA-可溶性肽含量的影響見圖3。

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，水解度和TCA-可溶性肽含量均呈先上升后下降的趨勢，當溫度達到50 ℃時水解度和TCA-可溶性肽含量均達到最大值。這是由于在一定的酶解溫度范圍內，隨著酶解溫度的升高，酶活性隨之升高，有助于酶促反應的進行，同時分子熱運動加快，有利于底物與酶的接觸；但當酶解溫度繼續升高至超過最適酶解溫度后，則可能使蛋白酶的活性下降或部分失活，從而使水解度降低。綜合考慮，選擇酶解溫度為50 ℃。

2.2.2" 液固比對酶解效果的影響

由圖4可知，隨著液固比的增大，三文魚骨排酶解液的水解度和TCA-可溶性肽含量均呈先上升后下降的趨勢，在液固比為4∶1時分別達到最大值17.19%和9.40 mg/mL。這是由于液固比較小時，體系過于黏稠，底物流動性差，不利于酶與底物的接觸，使得水解不完全。液固比的增大能夠增加酶與底物的接觸，但當液固比過大時，會導致底物濃度被稀釋，增加蛋白酶與底物接觸的難度，從而導致水解不充分。綜合考慮，選擇液固比為4∶1。

2.2.3" 酶解pH對酶解效果的影響

pH是影響酶解效果的重要因素之一，蛋白酶活性中心功能基團的解離狀態會隨著體系pH的變化而變化，只有在適宜pH條件下，蛋白酶才能與底物結合，發揮出理想的酶解效果。不同酶解pH對三文魚骨排水解度和TCA-可溶性肽含量的影響見圖5。

由圖5可知，當酶解pH從5.0增加到8.0時，水解度和TCA-可溶性肽含量均不斷上升，當酶解pH大于8.0時，pH繼續增加，水解度呈現下降趨勢。這可能是由于過酸或過堿的條件都有可能破壞酶的空間結構，使蛋白酶變性，從而影響酶的活力。綜合考慮，選擇酶解pH為8.0。

2.2.4" 酶解時間對酶解效果的影響

由圖6可知，當酶解時間在1～3 h范圍內時，隨著酶解時間的延長，三文魚骨排酶解液的水解度和TCA-可溶性肽含量均顯著上升（Plt;0.05）；當酶解時間超過3 h后，再繼續增加酶解時間，水解度和TCA-可溶性肽含量變化均不顯著（Pgt;0.05）。這是由于隨著酶解時間的延長，體系內的蛋白質不斷被水解，在酶解時間達到3 h時，體系內的大部分蛋白質已被完全水解，再繼續增加酶解時間可能會導致一些鮮味肽降解和低活性氨基酸產生，影響酶解液的品質。綜合考慮，選擇酶解時間為3 h。

2.2.5" 酶添加量對酶解效果的影響

酶添加量對三文魚骨排酶解液水解度和TCA-可溶性肽含量的影響見圖7。

由圖7可知，隨著酶添加量的增加，水解度和TCA-可溶性肽含量均呈逐漸上升的趨勢，當酶添加量為0.8%時水解度達到17.24%，再繼續增加酶添加量，水解度變化不顯著（Pgt;0.05）。這是由于隨著酶添加量的增加，增加了酶與底物接觸的概率，促進了蛋白的水解；當酶添加量達到0.8%后，繼續增加酶添加量，水解度和TCA-可溶性肽含量上升已不顯著，說明此時底物可能已酶解完全。綜合考慮，選擇酶添加量為0.8%。

2.3" Plackett-Burman試驗結果

根據單因素試驗確定了5個因素的水平范圍，以水解度（R1）和TCA-可溶性肽含量（R2）為響應值進行Plackett-Burman試驗，以確定對試驗結果產生顯著影響的因素，試驗設計與結果見表4，試驗結果的方差分析和回歸方程的可行性分析見表5～表7。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行編碼擬合，得到水解度（R1）和TCA-可溶性肽含量（R2）的回歸方程分別為：

R1=16.21-0.71A+1.42B+0.17C+0.15D-0.19E;

R2=7.37+0.52A+0.13B-0.039C-0.89D+0.24E。

P＜0.05時表明該模型顯著，P＜0.01時表明該模型極顯著。由表5和表6可知，三文魚骨排酶解工藝模型的F值分別為84.07和86.68，P值均＜0.000 1，表明該模型在所選的水平范圍內極顯著。由表5可知，各因素對水解度（R1）的影響大小為液固比gt;酶解溫度gt;酶添加量gt;酶解pHgt;酶解時間，其中液固比、酶解溫度、酶添加量的P值均lt;0.05，說明這3個因素對水解度的影響顯著。由表6可知，各因素對TCA-可溶性肽含量（R2）的影響大小為酶解時間gt;酶解溫度gt;酶添加量gt;液固比gt;酶解pH，其中酶解時間、酶解溫度、酶添加量、液固比的P值均lt;0.05，說明這4個因素對TCA-可溶性肽含量的影響顯著。由表7可知，相關系數R2分別為98.59%和98.64%，說明預測值與實際值之間相關性較高，調整系數RAdj2分別為97.42%和97.50%，均接近100%，說明模型的擬合程度良好。因此，綜合這5個因素對水解度和TCA-可溶性含量的影響考慮，選擇酶解溫度、液固比和酶添加量進行后續的Box-Behnken試驗。

2.4" 響應面試驗結果

根據Plackett-Burman試驗結果，選擇酶解溫度、液固比、酶添加量作為自變量，以水解度和TCA-可溶性肽含量為響應值進行響應面優化，試驗設計及結果見表8。

通過對試驗數據進行回歸擬合，得到水解度（R1）和TCA-可溶性肽含量（R2）的多元回歸方程分別為：

R1=18.11-0.22A′-0.087B′+0.15C′-0.066A′B′+0.16A′C′-0.77B′C′-0.51A′2-0.25B′2-0.052C′2。

R2 =9.47-0.030A′-0.046B′+0.035C′+0.017A′B′-0.038A′C′+0.066B′C′-0.19A′2-0.16B′2-0.17C′2。

由表8和表9可知，兩個響應值模型的F值分別為23.10和32.23，P值均lt;0.01，達到極顯著水平，且失擬項的P值均不顯著。模型系數R2分別為0.967 4和0.976 4，說明兩組回歸方程的擬合程度較好，具有可信度。調整系數RAdj2分別為0.925 6和0.946 1，說明回歸方程的預測值和真實值之間較接近，能夠對試驗結果進行有效預測。

由表9和表10可知，所設定因素對水解度的影響大小為酶解溫度（A′）gt;酶添加量（C′）gt;液固比（B′），A′和C′對水解度的影響極顯著。A′C′對水解度的影響顯著，A′2、B′2對水解度的影響極顯著，其他項對水解度的影響不顯著。所設定因素對TCA-可溶性肽含量的影響大小為B′gt;C′gt;A′，B′、C′對TCA-可溶性肽含量的影響顯著，B′C′對TCA-可溶性肽含量的影響顯著，A′2、B′2、C′2 對TCA-可溶性肽含量的影響極顯著，其他項對TCA-可溶性肽含量的影響不顯著。

2.5" 相關變量的交互作用分析

響應曲面的陡峭程度和等高線的形狀均能反映各因素之間的交互作用，響應曲面越陡峭，表明兩個因素之間交互作用越強，等高線圖形越接近橢圓，表明兩個因素之間的交互作用越顯著。

由圖8可知，酶解溫度和酶添加量的交互作用對水解度的影響顯著，液固比和酶添加量的相互作用對TCA-可溶性肽含量的影響顯著，這與表9和表10中的分析結果一致。

2.6" 最佳工藝參數及試驗驗證

通過響應面優化得出三文魚骨排的最佳酶解工藝條件為酶解溫度49.31 ℃、液固比3.86∶1、酶添加量0.85%。結合實際操作條件，將工藝參數調整為酶解溫度49 ℃、液固比3.9∶1、酶添加量0.85%，在此工藝條件下對三文魚骨排進行酶解，得到酶解液的水解度為18.11%，TCA-可溶性肽含量為9.45 mg/mL，與預測值相比均無顯著性差異（Pgt;0.05），表明通過響應面法優化得到的工藝參數是可靠的。

3" 結論

綜合水解度、TCA-可溶性肽含量和電子舌關鍵味覺響應值，從5種蛋白酶組合中篩選出復合蛋白酶-風味蛋白酶（2∶1）作為最適酶組合。以水解度和TCA-可溶性肽含量為指標，在單因素試驗的基礎上，通過PB試驗篩選出3個影響顯著的因素，再進行響應面試驗優化，得到三文魚骨排的最佳酶解工藝為酶解溫度49 ℃、液固比3.9∶1、酶添加量0.85%、酶解pH 8.0、酶解時間3 h。在此工藝條件下，得到三文魚骨排酶解液的水解度為18.11%，TCA-可溶性肽含量為9.45 mg/mL，與預測值無顯著性差異（Pgt;0.05）。本研究為三文魚副產物的深加工和高值化利用提供了一定的理論依據。

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