基于混菌發酵改善兔肉糜品質的研究

摘要：為探究混菌發酵對兔肉糜品質的影響，該研究基于蛋白酶活性、脂肪酶活性和氨基酸脫羧酶活性篩選出3組發酵劑，分別對兔肉糜進行混菌發酵，并對發酵過程中的理化指標進行檢測，同時對發酵產生的風味物質進行分析比較。結果表明，在兔肉糜發酵成熟過程中，4組發酵兔肉糜的pH值、水分活度呈顯著下降趨勢，菌落總數呈現先上升后下降的趨勢，經過40 h發酵后，4組發酵兔肉糜的pH值、水分活度均接近成熟期。QT組發酵劑對兔肉糜的硬度、咀嚼性影響較大，ZT組和QT組的水分含量顯著低于CT組和RT組。混菌發酵組丙二醛含量顯著低于自然發酵組（Plt;0.05），表明ZT組和QT組發酵劑對兔肉糜的質構特性和脂質氧化有一定的改善作用。GC-MS結果表明混菌發酵組風味物質種類顯著多于新鮮兔肉組，并且ZT組發酵兔肉糜的風味物質種類在酸類、醛類、醇類和其他類中均高于其他組；電子鼻測定結果顯示ZT組中硫化氫、硫磺、芳香族化合物、醇類、有機溶劑含量最高，這些物質對發酵兔肉糜揮發性風味物質的累積產生了積極作用。

關鍵詞：兔肉；混菌發酵；GC-MS；電子鼻

中圖分類號：TS251.54 """""文獻標志碼：A """"文章編號：1000-9973（2024）12-0014-07

Study on Improving Quality of Minced Rabbit Meat Based on

Mixed Bacterial Fermentation

CAO Yu-lan1， HU Lu-jun1*， XU Teng1， XIONG Da-ke1， ZHAO Zhi-feng1，2

（1.School of Biological Engineering， Sichuan University of Science amp; Engineering， Yibin 644005，

China; 2.College of Biomass Science and Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

Abstract： In order to explore the effect of mixed bacterial fermentation on the quality of minced rabbit meat， based on protease activity， lipase activity and amino acid decarboxylase activity， three groups of starters" are selected for mixed bacterial fermentation of minced rabbit meat， and the physicochemical indexes in the fermentation process are detected. Meanwhile， the flavor substances produced by fermentation are analyzed and compared. The results show that the pH value and water activity of four groups of fermented minced rabbit meat show a significant downward trend， and the total bacterial count increases firstly and then decreases during the fermentation and maturation of minced rabbit meat. After 40 h of fermentation， the pH value and water activity of four groups of fermented minced rabbit meat are close to those of maturation period. The QT group starter has a great effect on the hardness and chewiness of minced rabbit meat， and the water content of ZT group and QT group is significantly lower than that of CT group and RT group. The malondialdehyde content of mixed bacterial fermentation groups is significantly

收稿日期：2024-07-09

基金項目：四川輕化工大學研究生創新基金資助項目（Y2022086）；四川省科技計劃項目（2022NSFSC1132）

作者簡介：曹雨瀾（1997—），女，碩士，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：胡陸軍（1984—），男，高級工程師，博士，研究方向：食品生物技術。

lower than that of natural fermentation" group （Plt;0.05）， indicating that ZT group starter" and QT group starter have a certain improvement effect on the texture characteristics and lipid oxidation of minced rabbit meat. The results of GC-MS show that the types of flavor substances in mixed bacterial fermentation groups are significantly higher than those in fresh rabbit meat group， and compared with the other groups， the types of flavor substances of ZT group fermented minced rabbit meat are higher in acids， aldehydes， alcohols and other categories. The results of electronic nose measurement show that the content of hydrogen sulfide， sulfur， aromatic compounds， alcohols and organic solvents is the highest in ZT group， which have a positive effect on the accumulation of volatile flavor substances in fermented minced rabbit meat.

Key words： rabbit meat; mixed bacterial fermentation; GC-MS; electronic nose

兔肉的營養價值較高，以“三高三低”著稱，“三高”即兔肉中蛋白質含量高、礦物質含量高、兔肉的消化率高；“三低”即脂肪含量低、膽固醇含量低、能量低［1-2］。兔肉因低鈉和低膽固醇的特點也可滿足高血壓、心血管疾病等人群的特殊飲食需求［3］。風味化合物的組成對兔肉的品質至關重要，兔肉中腥味物質與肌肉組織結合緊密，不易釋放，導致兔肉的特殊腥味物質在加工過程中難以被去除［4］，這對兔肉的食用價值和兔產業的發展都產生了不利影響［5-6］，因此，如何降低或去除兔肉中的腥味物質尤為重要。目前，兔肉傳統加工還存在產品基礎研究較薄弱、技術研發和產品開發相對滯后等問題［1］，需要加強對兔肉加工的基礎研究和產品創新。

采用發酵技術對兔肉進行加工是兔肉精深加工的重要方向。發酵能通過內源性肌酶和微生物酶作用分解兔肉中的蛋白質、脂質和碳水化合物，形成醇類、酸類、雜環類、核苷酸等芳香類物質，賦予產品獨特的風味［7-8］。其中脂質降解會產生多不飽和脂肪酸［9］，這些脂肪酸會進一步氧化產生具有發酵肉特有風味的揮發性化合物［10］，并且微生物產生的多肽酶和氨基肽酶等蛋白酶會使兔肉中的肌原纖維蛋白降解，產生小肽并釋放出游離氨基酸，這些氨基酸對兔肉制品最終風味的形成起到至關重要的作用［11-12］。

本研究以兔肉為原料，以菌株發酵性能進行發酵劑的篩選，基于混菌發酵對兔肉糜進行發酵研究，分析混菌發酵對兔肉糜理化指標、質構、氧化程度、風味物質等品質的影響，以期為兔肉精深加工技術提供思路，從而為兔肉的研究和產品的開發提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）SCFF19、SCFF107、SCFF109、SCFF130、SCFF193、SCFF200、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）SCFF26、SCFF30、SCFF59、SCFF87、SCFF102、SCFF108和釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）SCFF202、SCFF205、SCFF211、SCFF216、SCFF227、SCFF232：來源于四川輕化工大學菌株保藏庫；兔肉、食鹽、豬油：市售；腸衣：商丘市宏洋腸衣有限公司；葡萄糖（AR）、酪氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸（均為BR）：國藥集團化學試劑有限公司；脫脂滅菌純牛乳：濟南伊利乳業有限責任公司。

1.2 儀器與設備

PHS-10 pH計 成都世紀方舟科技有限公司；HD-3A水分活度儀 無錫市華科儀器儀表有限公司；丙二醛試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；PC-16A水分測定儀 上海浦春計量儀器有限公司；TA-XT Plus質構儀 上海比朗儀器制造有限公司；TSQ 8000氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS） 美國Thermo Fisher Scientific公司；iNose電子鼻 上海瑞玢國際貿易有限公司；UV-1601紫外可見分光光度計 北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司；RT16000C高速冷凍離心機 上海容威儀器有限公司；FSH-2A可調高速勻漿機 杭州旌斐儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株發酵性能

1.3.1.1 菌株產蛋白酶活性和產脂肪酶活性試驗

菌株產蛋白酶活性和產脂肪酶活性試驗參照Zhou等［13］和于立梅［14］的方法進行檢測。分別添加10％脫脂牛乳作為蛋白酶檢測培養基，添加15%豬油和中性紅指示劑作為脂肪酶檢測培養基，稀釋涂布后于37 ℃條件下培養48 h，觀察菌落周圍透明圈大小和紅色斑點深淺［15］。

1.3.1.2 氨基酸脫羧酶活性試驗

氨基酸脫羧酶活性試驗參照Bover-Cid等［16］的方法，分別加入1%的酪氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸與0.006%溴甲酚紫配制氨基酸脫羧酶活性檢測培養基，稀釋涂布后于30 ℃培養3～7 d，當平板上出現由黃變紫或菌落周圍的酪氨酸沉淀消失時，即為氨基酸脫羧酶陽性反應［17］，且顏色越深，氨基酸脫羧酶活性越高。

1.3.2 試驗設計

根據菌株發酵特性設置4組：CT組：自然發酵組;RT組：表皮葡萄球菌SCFF102、植物乳植桿菌SCFF200、釀酒酵母菌SCFF211;ZT組：表皮葡萄球菌SCFF108、植物乳植桿菌SCFF107、釀酒酵母菌SCFF216;QT組：表皮葡萄球菌SCFF59、植物乳植桿菌SCFF19、釀酒酵母菌SCFF205。RT組、ZT組和QT組3組為混菌發酵組，混菌發酵組中每種微生物的比例為1∶1∶1，接種量為107 CFU/mL。

1.3.3 發酵兔肉糜的制備

兔肉糜制備工藝流程：兔肉→去骨、絞碎→腌制→添加發酵劑→發酵→成品。

操作要點：選擇新鮮屠宰的兔子胴體，去除可見脂肪、結締組織，經攪肉機處理成肉糜狀，再添加3%食鹽和1%葡萄糖進行腌制，以107 CFU/mL活菌數接入發酵劑并充分攪拌后灌裝腸衣，最后于25 ℃下發酵成熟84 h。

1.3.4 兔肉糜發酵過程中動態理化指標的測定

每隔12 h測定發酵兔肉糜的pH值、水分活度和菌落總數。pH值的測定參考Wang［18］的方法，準確稱取10 g樣品，加入90 mL去離子水，加熱攪拌30 min，過濾后的上清液用pH計測定；菌落總數的測定參照Chen等［19］的方法，稀釋涂布后進行計數；水分活度的測定方法為將發酵樣品切碎后均勻鋪滿測量皿，經飽和氯化鈉溶液校準后利用水分活度儀進行測定。

1.3.5 發酵兔肉糜質構的測定

發酵兔肉糜質構的測定參照王寧寧等［20］的方法并略作修改，選用P/36R型探頭測定樣品的硬度、彈性和咀嚼性等指標。

1.3.6 發酵兔肉糜水分含量的測定

準確稱取1 g發酵兔肉糜樣品，使用水分測定儀測定其水分含量，于120 ℃條件下加熱至恒重，平行3次計算樣品中的水分含量。

1.3.7 發酵兔肉糜脂質氧化情況的測定

通過測定兔肉糜中丙二醛含量對兔肉糜脂質氧化情況進行測定，丙二醛含量的測定采用試劑盒中提供的方法。

1.3.8 發酵兔肉糜揮發性風味物質的測定

利用電子鼻對發酵兔肉糜揮發性風味物質進行測定［21］。取3.0 g切碎的發酵兔肉糜于頂空瓶中，用保鮮膜密封后手動進樣，平行測定3次，取平均值。測定參數：傳感器清洗時間120 s，數據調零時間10 s，數據采集時間60 s，流量0.5 L/min。

采用GC-MS對發酵兔肉糜中揮發性風味物質進行測定［22］，稱取5 g兔肉糜樣品置于25 mL頂空瓶中，50 ℃預熱10 min，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取針頭插入頂空瓶中，固相吸附40 min，于250 ℃進樣口解吸5 min。使用條件：載氣采用高純氦氣（gt;99.99%），恒定流速1.0 mL/min。初始溫度40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min的速度升至200 ℃，以8 ℃/min的速度升至230 ℃，保持5 min。質譜條件：電子電離能70 eV，離子源溫度280 ℃，全掃描模式，質量掃描范圍（m/z）：40～400 u。

2 結果與分析

2.1 發酵劑篩選

18株微生物菌株的蛋白酶活性、脂肪酶活性和氨基酸脫羧酶活性檢測結果見表2。

脂質是芳香化合物的溶劑和前體物質，與發酵肉風味物質的形成密不可分［23］，而蛋白酶可以加速肉中的蛋白質分解，對關鍵性風味和滋味物質具有重要貢獻［24］。由表2可知，表皮葡萄球菌（SCFF30、SCFF59）、植物乳植桿菌（SCFF19）和釀酒酵母菌（SCFF205）表現出較好的蛋白質和脂質分解能力，植物乳植桿菌（SCFF193、SCFF200）和釀酒酵母菌（SCFF211）未表現出蛋白酶活性。微生物對蛋白質進行分解的同時，一些產氨基酸脫羧酶的細菌會通過脫羧或經精氨酸脫亞胺酶途徑分解氨基酸形成組胺、腐胺、尸胺和酪胺等生物胺［25］，而生物胺是致癌性N-亞硝基化合物的前體物質［26］。植物乳植桿菌和釀酒酵母菌均無氨基酸脫羧酶活性，表皮葡萄球菌對賴氨酸和組氨酸無脫羧酶活性，不會發生脫羧反應產生生物胺。對酪氨酸來說，SCFF59和SCFF108菌株脫羧能力最弱，而SCFF102菌株對精氨酸脫亞胺酶能力最弱。因此，選擇這3種菌株作為發酵劑，分別依據每種菌株的弱（RT）、中（ZT）和強（QT）發酵性能組合進行兔肉糜發酵研究。

2.2 兔肉糜發酵過程中pH值、水分活度和菌落總數的變化分析

典型的成熟發酵肉的水分活度（Aw）一般在0.92以下，pH值在4.8～5.5之間［27］。由圖1可知，經過40 h發酵后，4組發酵兔肉糜的pH值、水分活度均接近成熟期。在整個發酵期間4組樣品的pH值總體呈下降趨勢，3個試驗組發酵初期pH值均低于對照組（CT），表明植物乳植桿菌產生大量乳酸或羥基脂肪酸，有效降低了發酵兔肉糜的pH值。較低的pH值能夠抑制雜菌生長，提高兔肉糜的安全性［28］。水分活度的降低會抑制大多數病原微生物，有效防止肉制品的腐敗變質［29］，由圖1中B可知，發酵過程中水分活度始終呈下降趨勢。由圖1中C可知，自然發酵CT組的初始菌落總數約為1.6×107 CFU/g，在40 h時達到2.1×108 CFU/g。相比之下，RT組發酵樣品中菌落總數從0 h時的5.9×107 CFU/g增加到24 h時的1.65×108 CFU/g，達到峰值。3個試驗組pH值的變化趨勢顯示出發酵劑產酸能力的強弱：QT組gt;RT組gt;ZT組，這3組的pH值和水分活度在發酵期間的變化趨勢大致相同，菌落總數呈現先上升后下降的趨勢，并在48 h后趨于平穩。

2.3 混菌發酵對發酵兔肉糜質構和水分含量的影響

質構是反映肉制品品質的重要指標之一。由表3可知，菌株發酵性能強的QT組的硬度和咀嚼性顯著高于其他組（P＜0.05），同時凝聚性也高于其他組。在彈性方面，4組發酵兔肉糜差異不顯著。成熟的發酵兔肉糜的水分含量在35%～45%之間［27］，過高的水分含量可能使雜菌過度繁殖，從而使得肉制品腐敗變質［21］，ZT組和QT組的水分含量顯著低于CT組和RT組，造成這些差異的主要原因可能是植物乳植桿菌在發酵過程中產生乳酸，使pH值接近蛋白質等電點，蛋白質的持水力下降，肌肉蛋白質凝膠化，進一步形成緊密的凝膠網絡結構［29-30］，導致凝聚性增大和水分含量減少；或是所篩選的發酵菌株具有較強的脂肪酶活性，Cruxen等［27］研究表明脂肪含量越低，硬度越大，咀嚼性越大。

2.4 混菌發酵對兔肉糜脂質氧化的影響

脂肪水解后產生游離脂肪酸，進一步氧化有助于風味的形成，而過度氧化則會使肉制品發生酸敗和腐敗，丙二醛是一種具有代表性的脂質過氧化物，本研究通過丙二醛含量反映脂質的氧化程度。發酵兔肉糜的丙二醛含量見圖2。

由圖2可知，在發酵結束后，自然發酵CT組的丙二醛含量為（95.26±2.74） nmol/g，顯著高于其他組（Plt;0.05），這與Bozkurt等［31］的研究結果一致。ZT組的丙二醛含量（52.19±1.43） nmol/g和QT組的丙二醛含量（55.01±3.68） nmol/g與新鮮兔肉組的丙二醛含量（50.02±1.88） nmol/g無顯著差異，表明ZT組和QT組發酵劑在促進脂肪水解產生游離脂肪酸的同時，也能提升發酵兔肉糜的抗氧化性，阻止其進一步氧化［32］。

2.5 兔肉糜揮發性風味物質的分析

采用GC-MS對兔肉糜中揮發性風味物質進行測定，結果見表4。

不同組發酵劑對發酵兔肉糜風味物質的貢獻存在明顯差異。5組兔肉糜樣品中共檢出41種揮發性風味物質，其中新鮮兔肉組10種，CT組14種，RT組15種，ZT組23種，QT組15種。ZT組發酵兔肉糜的風味物質不僅總含量較高，且酸類、醛類、醇類及其他類的種類均高于其他組，可能是植物乳植桿菌水解脂肪釋放出大量特征脂肪酸，產生了更多的揮發性酸類物質［33］。醛類的產生主要與脂肪酸的氧化有關，發酵產生的醛類物質可以被視為一種衡量脂質氧化的指標［34-35］，輕微的氧化有助于風味的形成，如ZT組中檢測到的正己醛可以提供青草香味［36］，但過多的小分子醛類物質如壬醛、辛醛等會散發出令人不愉快的哈喇味并對風味造成負面影響［37］，而壬醛僅在CT組中被檢測到。在生成的醇類物質中，2-十六烷醇等長碳鏈醇賦予發酵肉木質味、花香等獨特的風味特征［38］，1-辛烯-3-醇具有蘑菇香和花香，是發酵肉制品中常見的不飽和醇［39］。與新鮮兔肉相比，發酵兔肉糜中醇類物質和酸類物質發生酯化反應，使酯類迅速增加，癸酸乙酯和辛酸乙酯等酯類通常可以給發酵肉帶來水果味和奶油味［40］，這些物質共同組成發酵兔肉糜的風味特征。部分風味物質僅存在于發酵劑組中，如辛酸乙酯、正己醇、苯乙醇、3-羥基月桂酸、（E）-2-庚烯醛。這些風味物質中，苯乙醇、（E）-2-庚烯醛和正己醇是釀酒酵母發酵的肉制品中典型的風味物質，尤其是苯乙醇、辛酸乙酯，是發酵肉的關鍵風味物質［24］。甲基肼和呋喃衍生物被認為是兔肉兔腥味的重要生成物質［4］，但發酵后能有效去除這一不良氣味。

總的來說，發酵劑對兔肉糜揮發性風味物質的累積產生了積極影響，尤其是ZT組發酵劑增加了醇類、酸類和醛類等風味物質，有效抑制了脂質的過度氧化，減少了不良氣味的產生。

2.6 發酵兔肉糜風味物質的電子鼻分析

由圖3可知，新鮮兔肉、自然發酵兔肉糜和混菌發酵兔肉糜的風味特征存在顯著性差異，傳感器的響應值均不同。傳感器S1、S2、S4、S5、S7、S8、S11、S12、S13的響應值相對較高，其中ZT組對S2和S4傳感器的響應強度最大，說明兔肉糜在發酵過程中產生硫化氫類化合物的氣味較強，而含硫化合物是產生基本肉香味的關鍵物質［41］；同時生成更多醇類、有機溶劑等揮發性物質，使香氣特征更豐富，與GC-MS得出的醇類物質顯著增多且相對含量最高的結論一致。CT組氨、胺類化合物含量最高，說明大量雜菌通過脫羧機制生成生物胺等化合物，進一步證明發酵劑對雜菌的抑制作用。

由圖4可知，PC1的貢獻率為 98.29%，PC2的貢獻率為0.96%，總貢獻率達到99.25%（＞85%），說明PC1和PC2具備反映樣品特點的要求，且發酵兔肉糜的風味變化主要由PC1決定。同一樣品的數據點聚集狀態越高，說明同一組的重復性和穩定性越好，不同組的距離是分散的，沒有重疊，表明不同組之間的風味組成存在差異［42］。可以看出新鮮兔肉組和CT組與3組混菌發酵組（RT、ZT、QT）風味類型相差較大，RT組、ZT組和QT組發酵兔肉糜發生重疊或接近，說明它們產生的揮發性風味物質相似。結合雷達圖可知新鮮兔肉沒有突出的風味特征，CT組氨、胺類化合物含量最高，ZT組硫化氫、硫磺、芳香族化合物、醇類、有機溶劑含量高。

3 結論

本研究在發酵菌株蛋白酶活性、脂肪酶活性和氨基酸脫羧酶活性研究的基礎上，篩選出發酵能力弱的RT組（表皮葡萄球菌SCFF102、植物乳植桿菌SCFF200、釀酒酵母菌SCFF211）、發酵能力中的ZT組（表皮葡萄球菌SCFF108、植物乳植桿菌SCFF107、釀酒酵母菌SCFF216）和發酵能力強的QT組（表皮葡萄球菌SCFF59、植物乳植桿菌SCFF19、釀酒酵母菌SCFF205）3組混合發酵劑。通過3組發酵劑對兔肉糜進行發酵，結果發現40 h為發酵兔肉糜成熟期的終點。QT組發酵劑對發酵兔肉糜的硬度、咀嚼性影響較大。混菌發酵組丙二醛含量顯著低于自然發酵組（Plt;0.05）。5組發酵兔肉糜樣品共檢出41種揮發性風味物質，混菌發酵組風味物質種類顯著多于新鮮兔肉組和自然發酵組。ZT組發酵兔肉糜的風味物質不僅總含量較高，而且酸類、醛類、醇類、其他類種類均高于其他組。電子鼻測定結果顯示ZT組中硫化氫、硫磺、芳香族化合物、醇類、有機溶劑含量高，說明該組發酵劑對發酵兔肉糜揮發性風味物質的累積產生了積極作用。

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