路南腐乳中優(yōu)勢菌株的篩選及其前發(fā)酵工藝優(yōu)化

摘要：以云南路南腐乳為研究對象，對毛坯樣品中的優(yōu)勢菌株進行分離純化，采用優(yōu)勢菌株對腐乳進行單菌和雙菌混合發(fā)酵，以蛋白酶活力為評價指標，進行前發(fā)酵工藝優(yōu)化，旨在提升路南腐乳的品質。研究結果：采用獲得的5株優(yōu)勢菌株對腐乳進行單菌、雙菌混合接種發(fā)酵，得到單菌株R1與R2分別接種發(fā)酵時第3天的蛋白酶活力較高，分別為160.5 U/g和156.05 U/g。后續(xù)選擇R1與R2菌株進行混菌發(fā)酵，發(fā)現當R1∶R2為2∶1時，第3天時蛋白酶活力最高，為197.17 U/g。R1菌株與R2菌株經形態(tài)學結合分子生物學分別鑒定為白地霉和巢狀毛霉。在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析對菌液濃度、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間進行優(yōu)化，以蛋白酶活力為指標，得到最佳發(fā)酵條件為菌液濃度106 CFU/mL、接種量2%、發(fā)酵溫度28.3 ℃、發(fā)酵時間3 d，此時蛋白酶活力達到215.5 U/g。該研究可為路南腐乳品質的提升提供一定理論指導和數據參考。

關鍵詞：腐乳；混菌發(fā)酵；前發(fā)酵；工藝優(yōu)化

中圖分類號：TS214.2 """""文獻標志碼：A """"文章編號：1000-9973（2024）12-0030-06

Screening of Dominant Strains in Lunan Sufu and Optimization of Pre-Fermentation Technology

CHEN Chen， REN Yan-lin， CHEN Zhong-ai， PI Yu-ran， TIAN Juan， HU Yong-jin*

（College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

Abstract： Taking Yunnan Lunan sufu as the research object， the dominant strains in the blank samples are isolated and purified， and the dominant strains are used for single strain and double strains mixed fermentation of sufu， and the protease activity is used as the evaluation index for the optimization of pre-fermentation process， aiming to improve the quality of Lunan sufu. Research results： the five dominant strains obtained are used for fermentation of sufu inoculated with single strain and double strains， it is determined that the protease activity on the 3rd day of fermentation is 160.5 U/g and 156.05 U/g for inoculation with single strain R1 and R2 respectively，" and then R1 and R2 strains are selected for mixed fermentation， it is found that when R1∶R2 is 2∶1， the protease activity is the highest of 197.17 U/g on the 3rd day of fermentation. R1 and R2 strains are identified as Geotrichum candidum and Mucor nidus respectively by morphology and molecular biology. On the basis of single factor test， response surface analysis is used to optimize the concentration of bacterial solution， inoculation amount， fermentation temperature and fermentation time.Taking protease activity as the index， it is determined that the optimal fermentation conditions are bacterial solution concentration of 106 CFU/mL， inoculation amount of 2%， fermentation temperature of 28.3 ℃， and fermentation time of 3 d. At this time， the protease activity reaches 215.5 U/g. This study can provide some theoretical guidance and data references for the improvement of the quality of Lunan sufu.

Key words： sufu; mixed bacteria fermentation; pre-fermentation; process optimization

收稿日期：2024-05-16

基金項目：科技人才與平臺計劃（202105AF150049）；云南省高校食品微生物資源與利用重點實驗室（云教發(fā)［2018］135號）

作者簡介：陳晨（2000—），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學。

*通信作者：胡永金（1971—），男，教授，博士，研究方向：食品微生物學。

腐乳是以大豆為原料制成豆腐后接種微生物發(fā)酵制得的，其主要營養(yǎng)成分類似于大豆［1］。在歐美，許多人將其稱作“中國干酪”［2］。大豆制成腐乳后，不僅保留了大豆中的天然營養(yǎng)物質，而且大量降低了大豆中的胰蛋白酶抑制物［3］，成熟的腐乳還消除了大豆本身的豆腥味以及大豆中的抗營養(yǎng)因子（如腹瀉因子、脹氣因子等），使得大豆中的營養(yǎng)物質更易被人體吸收［4］。腐乳的發(fā)酵過程涉及微生物群落的演替過程［5］，其生產過程主要包括前期發(fā)酵和后期發(fā)酵兩個階段［6］。腐乳的前期發(fā)酵是整個生產的關鍵步驟，菌株在豆腐坯體上生長，形成茂密的菌絲后包裹坯體，使得蛋白質部分降解［7］，且前期發(fā)酵分泌的酶系直接影響腐乳后期發(fā)酵產香物質的降解與酯化［8］，所以腐乳的前酵工藝將直接影響腐乳的品質［9］。

路南腐乳作為云南本地特色產品，是自然發(fā)酵而成的，開放式的生產環(huán)境和不可控的發(fā)酵方式會導致產品安全問題［10］。腐乳的營養(yǎng)和風味受多種因素的影響，如原料類型、生產工藝和發(fā)酵菌株等［11］。20世紀八九十年代以來，我國便已廣泛使用人工接菌的方式發(fā)酵腐乳［12］。在自然界中，微生物與微生物、環(huán)境之間密切相聯，混合發(fā)酵更符合自然規(guī)律［13］。混合發(fā)酵能提高發(fā)酵效率［14］和縮短發(fā)酵周期［15］。與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，基于微生物調控的現代發(fā)酵技術可以精確控制腐乳的發(fā)酵過程，該結果對提高產品質量和安全性至關重要［16］。基于以上原因，本課題擬從云南路南當地傳統(tǒng)自然發(fā)酵的腐乳中篩選出高產蛋白酶活性的優(yōu)良菌株，將篩選出的菌株進行復配接種發(fā)酵，提升路南腐乳的品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

路南腐乳：云南省昆明市石林彝族自治縣某農家傳統(tǒng)自然發(fā)酵腐乳；福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水碳酸鈉、硼酸、硫酸鉀：天津市風船化學試劑科技有限公司；三氯乙酸：廣東光華科技股份有限公司；酪氨酸、干酪素：上海源葉生物科技有限公司；37%甲醛溶液：成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800紫外可見分光光度計 翱藝儀器（上海）有限公司；PHS-3C臺式pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；101-2電熱鼓風干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HH-B11-BS-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；GL-6250A磁力攪拌器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TF-B60超低溫冰箱 廣州瑞合化工科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 路南腐乳發(fā)酵菌株的篩選純化及鑒定

1.3.1.1 采樣與菌株分離純化

稱取1 g自然發(fā)酵而成的不同時間階段（3，5，7 d）的腐乳毛坯樣品于10 mL無菌生理鹽水中搖蕩，調節(jié)菌液濃度為102～108 CFU/mL。吸取0.5 mL不同濃度梯度的稀釋液于凝固的孟加拉紅平板內，并使用涂布棒進行涂布，使其在平板內混合均勻。混勻后倒置平板（不同稀釋度做3個平行），于28 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2～3 d。挑選生長良好的單菌落，采用平板劃線法在孟加拉紅培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，然后于28 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2～3 d。菌株純化3代后，轉接到試管斜面上培養(yǎng)2 d。

1.3.1.2 菌株的形態(tài)學鑒定

在菌株生長過程中，觀察菌株的生長形態(tài)，初步確定菌株的屬。為觀察菌絲形態(tài)，使用接種環(huán)挑取少量菌絲體，使用乳酸酚棉藍染色液進行染色處理后，在電子顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)并拍照記錄。

1.3.1.3 菌株的分子生物學鑒定

選取能夠挑選單菌落并無雜菌生長的平板送至北京擎科生物科技股份有限公司進行DNA提取，R1菌株和R2菌株分別以IT（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）為引物進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，進行18S rDNA基因測序。

將菌株的基因測序結果與NCBI網站中的GenBank數據庫經BLAST程序進行基因對比分析，確定菌株的種屬后，選取同源性高的10株菌株，利用同源性高的10株菌株的基因序列進行同源性分析，通過MEGA-X構建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 優(yōu)勢發(fā)酵菌株的篩選

1.3.2.1 菌懸液的制備

使用接種環(huán)挑取培養(yǎng)良好且無污染的菌株于無菌生理鹽水中，制備成一定濃度的菌懸液。

1.3.2.2 毛坯的制備

將豆腐切成2 cm×2 cm×2 cm的小方塊，將制備好的一定濃度的菌懸液均勻地噴灑在豆腐坯體的表面，于28 ℃培養(yǎng)5 d，每天觀察豆腐表面菌絲的生長情況并測定不同菌株發(fā)酵毛坯的蛋白酶活力。

1.3.2.3 蛋白酶活力的測定

蛋白酶活力參照GB/T 23527—2009進行測定［17］。

1.3.2.4 前發(fā)酵階段發(fā)酵條件優(yōu)化的單因素試驗

以蛋白酶活力為指標，以菌液濃度（104，105，106，107，108 CFU/mL）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵溫度（24，26，28，30，32 ℃）、發(fā)酵時間（1，2，3，4，5 d）為單因素，研究不同發(fā)酵條件下混合菌株發(fā)酵腐乳的前發(fā)酵情況。

1.3.2.5 響應面法優(yōu)化腐乳前發(fā)酵條件

在單因素試驗的基礎上，以蛋白酶活力為指標，合理選取對腐乳前發(fā)酵階段腐乳毛坯的蛋白酶活力影響較顯著的幾個因素，并選取合理的水平，采用響應面分析法對毛霉腐乳前發(fā)酵條件進行優(yōu)化，研究混菌發(fā)酵腐乳前酵階段的最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.3.3 數據處理與分析

使用Design-Expert 11進行數據分析，使用Origin 9.0、Excel 2020、MEGA-X進行制表繪圖，數據結果以平均值±標準偏差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

從采集的3種不同發(fā)酵階段的路南腐乳毛坯樣品中共篩選出5株優(yōu)勢菌株，其中包括3株霉菌和2株酵母菌。

2.2 單菌發(fā)酵腐乳蛋白酶活力的測定

將分離得到的5株菌株進行單菌發(fā)酵制成腐乳毛坯，測定一定發(fā)酵時間內的蛋白酶活力，見圖2。

蛋白酶可將豆腐中的大豆蛋白等分解成肽和氨基酸等小分子物質，并促進生成氨基酸態(tài)氮和水溶性蛋白質等［18］，其酶活越高表示蛋白酶水解大豆蛋白的速率越快［19］。通過對5株菌株進行單菌發(fā)酵，所得毛坯的蛋白酶活力均呈現先上升后下降的趨勢，5株菌株的蛋白酶活力均在第3天時達到最大值。其中R1和R2菌株的蛋白酶活力較高，在第3天時分別達到160.5 U/g和156.05 U/g，另外兩株酵母菌（R3、R4）的酶活力分別為141.06 U/g和146.06 U/g。霉菌的蛋白酶活力高于酵母菌的蛋白酶活力，故選取R1和R2菌株為主要發(fā)酵菌株進行后續(xù)的混菌發(fā)酵。

2.3 混菌發(fā)酵腐乳蛋白酶活力的測定

將R1和R2菌株設置成10種不同的比例進行混菌發(fā)酵，另外包括R1、R2單菌發(fā)酵組和空白對照組，測定其不同發(fā)酵階段的蛋白酶活力，見圖3。

與單菌發(fā)酵腐乳相比，混菌發(fā)酵腐乳可以明顯提高腐乳前酵階段毛坯的蛋白酶活力，這是因為混合發(fā)酵的菌株酶系更全面，彌補了單菌發(fā)酵腐乳中蛋白酶系較單一的不足。當R1與R2的比例為2∶1時，在第3天時蛋白酶活力達到最高，為197.17 U/g，當R1與R2的比例為3∶1、3∶2、2∶1、1∶2、2∶3時，蛋白酶活力均高于單菌發(fā)酵，但當R1與R2的比例為1∶1、1∶3時，其蛋白酶活力不及單菌發(fā)酵時的蛋白酶活力，這可能是由于菌株之間存在爭奪營養(yǎng)的關系，而不同菌株的競爭能力不同，毛霉生長旺盛，抑制了白地霉的生長［20］，導致酶活力不升反降。因此，選取R1與R2的比例為2∶1進行后續(xù)的響應面優(yōu)化發(fā)酵條件試驗。

2.4 菌株基因序列測定

以菌株的基因序列為模板，R1和R2菌株分別以ITS1和ITS4為引物進行PCR擴增，對產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分離，18S rDNA PCR電泳結果見圖4。

由圖4可以看出菌株有較清晰明亮的特異性條帶，由此可進行基因序列測定。

2.5 菌株發(fā)育樹的建立

根據形態(tài)學觀察，結合同源性比對，確立菌株R1為Geotrichum candidum，菌株R2為Mucor nidicola。根據同源性比對結果，采用MAGE-X對菌株建立相對應的系統(tǒng)發(fā)育樹，R1和R2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹分別見圖5和圖6。

2.6 腐乳前酵階段單因素試驗

2.6.1 菌液濃度對前酵階段蛋白酶活力的影響

由圖7可知，當菌液濃度為104 CFU/mL時，腐乳的蛋白酶活力偏低，隨著菌液濃度的升高，蛋白酶活力也相應上升，當菌液濃度為106 CFU/mL時蛋白酶活力最高，達到203.83 U/g；當菌液濃度持續(xù)上升時，蛋白酶活力開始下降，原因可能是菌液濃度較低時，分泌酶系的微生物數量較少，所以測得的蛋白酶活力偏低，當達到較高酶解率時，盡管菌液濃度有所增加，但能夠在豆腐坯上正常生長繁殖的生物數量基本達到飽和，單位時間內酶活力不再明顯提升，而接種量過多可能會影響菌株之間的營養(yǎng)競爭關系，從而影響蛋白酶的分泌量，因此，確定最佳菌液濃度為106 CFU/mL。

2.6.2 接種量對前酵階段蛋白酶活力的影響

由圖8可知，當接種量為1%～2%時，蛋白酶活力呈逐漸上升的趨勢，當接種量為2%時，蛋白酶活力達到最大值，為207.72 U/g。當接種量持續(xù)增加時，蛋白酶活力開始呈現下降趨勢，原因可能是微生物菌群只有處于一定量級水平才具有較旺盛的生長代謝能力，如果超過菌群最佳生長時期的數量水平，菌株之間會爭奪營養(yǎng)，出現拮抗作用，致使蛋白酶活力呈現下降趨勢。特別是在菌株較復雜時，不同菌株之間競爭能力不同，多種菌群共同爭奪營養(yǎng)，導致酶活力下降幅度明顯。因此，確定最佳接種量為2%。

2.6.3 發(fā)酵溫度對前酵階段蛋白酶活力的影響

由圖9可知，溫度過低或過高都將影響微生物的生長代謝，從而使微生物分泌的酶也相應減少。當溫度為24 ℃時，菌株生長較緩慢，不能正常分泌酶系，因此蛋白酶活力處于較低水平。隨著溫度的升高，蛋白酶活力開始逐漸上升。當溫度為26～30 ℃時，蛋白酶活力較高，只有溫度接近最適溫度時，菌株才能迅速生長，從而大量產酶。當溫度升至28 ℃時，蛋白酶活力達到最高，為211.05 U/g。當超過最適溫度時，一定數量的菌株死亡，使得部分酶失活，隨著溫度繼續(xù)升高，死亡和變性失活越發(fā)明顯，另外，溫度太高會導致水分快速損失，加速菌絲的衰老，從而對蛋白酶活力產生影響［21］，導致發(fā)酵減緩甚至停止發(fā)酵。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.6.4 發(fā)酵時間對前酵階段蛋白酶活力的影響

由圖10可知，在5 d時間內，蛋白酶活力呈現先上升后下降的趨勢。在第3天時酶活力達到最高，為212.72 U/g。在前3 d蛋白酶活力呈現快速上升趨勢，這可能是由于腐乳毛坯上的霉菌在發(fā)酵初期至60 h期間處于旺盛期，霉菌和其菌絲不斷地進行代謝繁殖，從而影響蛋白酶活力的持續(xù)增長［22］，而4～5 d內酶活力趨于平緩下降的趨勢。隨著發(fā)酵時間的增加，菌群容易出現老化衰退、難以合成蛋白酶以及代謝副產物增加的現象，酶分泌減慢［22］，導致蛋白酶活力出現下降趨勢，原因可能是不同微生物屬間協同生長需要適應過程，達到一定適應階段才能發(fā)揮協同效應。因此，1～2 d為適應階段，2～3 d為協同階段，超過3 d為老化階段。因此，確定最佳發(fā)酵時間為3 d。

2.7 響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵條件

根據單因素試驗的結果，以蛋白酶活力為指標，以菌液濃度、接種量和發(fā)酵溫度為因素進行響應面試驗設計，因素水平見表1。

根據表1的因素水平進行響應面試驗設計，試驗方案及結果見表2。

采用Design-Expert 11分析試驗數據，對結果進行多元二次回歸擬合，建立回歸方程：Y=202.06－0.735X1－7.22X2+16.63X3－2.03X1X2－0.777 5X1X3+1.81X2X3－1.75X12－5.28X22－50.59X32。

回歸方程及偏回歸系數方差分析結果見表3。

由表3可知，此模型極顯著（Plt;0.01）。模型失擬項的P值為0.056 9（Pgt;0.05），差異不顯著，即該方程對試驗的擬合性較好，因此該模型的選擇和建立具備合理性。

由回歸方程系數顯著性檢驗結果可知，一次項X3對蛋白酶活力的影響極顯著（Plt;0.01），X2對蛋白酶活力的影響顯著（Plt;0.05），X1對蛋白酶活力的影響不顯著（Pgt;0.05）；二次項X32對蛋白酶活力的影響極顯著（Plt;0.01）；交互項X1X2、X1X3、X2X3對蛋白酶活力的影響均不顯著（Pgt;0.05）。根據F值分析影響腐乳前發(fā)酵階段蛋白酶活力的因素主次順序為發(fā)酵溫度＞接種量＞菌液濃度。

根據試驗得到的響應曲面圖見圖11，其直接反映了各因素對腐乳前發(fā)酵階段蛋白酶活力的影響。響應面曲面變化越快，表明交互作用越明顯。

整體來看，菌液濃度和接種量對蛋白酶活力的影響不及發(fā)酵溫度的影響。由圖11中a可知，當發(fā)酵溫度保持一定時，接種量的持續(xù)增加抑制了腐乳前發(fā)酵階段的蛋白酶活力；菌液濃度的升高對蛋白酶活力的影響也從促進轉變?yōu)橐种疲簼舛葘γ富盍Φ挠绊懖惶黠@。由圖11中b可知，當接種量保持一定時，菌液濃度和發(fā)酵溫度對蛋白酶活力的影響呈拋物線形狀，當菌液濃度保持一定時，蛋白酶活力隨著發(fā)酵溫度的升高在28 ℃左右達到最大值。蛋白酶活力變化顯示，發(fā)酵溫度對酶活力的影響大于菌液濃度的影響。由圖11中c可知，當菌液濃度保持一定時，發(fā)酵溫度對前發(fā)酵階段蛋白酶活力的影響也是先促進后抑制，接種量的遞增對前發(fā)酵階段蛋白酶活力的影響也與菌液濃度類似。綜合以上結果可以分析得到3個因素對腐乳前發(fā)酵階段蛋白酶活力的影響程度為發(fā)酵溫度＞接種量＞菌液濃度。

綜上所述，經過分析得到混合發(fā)酵腐乳的較優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度28.3 ℃、接種量2.31%、菌液濃度2.53×10 6 CFU/mL，此時蛋白酶活力為214.74 U/g。為檢驗試驗結果與真實情況的一致性，對上述條件進行驗證試驗，并將較優(yōu)結果修正為發(fā)酵溫度28.3 ℃、接種量2%、菌液濃度10 6 CFU/mL，此時蛋白酶活力為215.5 U/g。

3 結論

對云南路南腐乳的生產菌株進行篩選后共得到5株菌株，通過單菌發(fā)酵腐乳并在第2，3，4天分別測定其蛋白酶活力，可初步確定R1與R2為其優(yōu)勢發(fā)酵菌株且兩株菌株均屬于霉菌。其單菌發(fā)酵蛋白酶活力在發(fā)酵第3天時達到最高，分別為160.5，156.05 U/g。當R1∶R2為2∶1時，在第3天時蛋白酶活力最高，為197.17 U/g，表明雙菌混合發(fā)酵的蛋白酶活力遠高于單菌發(fā)酵的蛋白酶活力，故雙菌混合發(fā)酵相比單菌發(fā)酵有較大優(yōu)勢。對路南腐乳前酵階段的發(fā)酵條件設計單因素試驗和響應面試驗進行工藝優(yōu)化，以蛋白酶活力為指標，根據試驗結果分析得到最優(yōu)發(fā)酵條件為菌液濃度106 CFU/mL、接種量2%、發(fā)酵溫度28.3 ℃、發(fā)酵時間3 d，此時蛋白酶活力達到215.5 U/g。

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