嗜鹽四聯球菌與多變假絲酵母強化發酵對蠶豆醬風味品質的影響

摘要：為探究郫縣豆瓣內源性優勢微生物嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus MK063724）與多變假絲酵母（Candida versatilis MK063708）強化發酵對蠶豆醬風味品質的影響，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術（HS-SPME-GC-MS）分析不同接種方式強化發酵蠶豆醬的揮發性風味化合物差異。結果表明，所有樣品中共檢測出69種揮發性化合物，且不同發酵組揮發性化合物含量差異明顯。相較于傳統發酵組，嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母共接組、多變假絲酵母組和嗜鹽四聯球菌組的含量分別提升了60.49%、30.09%和27.05%，主要集中在酯類和醇類化合物含量的提升。偏最小二乘判別分析表明，同時接種嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母樣品的香氣屬性顯著區分于其他發酵組，結合氣味活性值分析，同時接種兩種菌可形成更豐富的特征香氣物質，尤其是2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、苯乙酸乙酯等酯類化合物，從而有利于花果香氣的提升。該研究結果可為郫縣豆瓣風味品質的提升提供理論指導。

關鍵詞：蠶豆醬；嗜鹽四聯球菌；多變假絲酵母；強化發酵；特征風味化合物

中圖分類號：TS201.3 """""文獻標志碼：A """"文章編號：1000-9973（2024）12-0060-07

Effect of Enhanced Fermentation by Tetragenococcus halophilus

and Candida versatilis on Flavor Quality of Broad Bean Paste

WANG Kun， LU Yun-hao， CHENG Jie*

（College of Food and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu 610106， China）

Abstract： To investigate the effect of enhanced fermentation of the endogenous dominant microorganisms Tetragenococcus halophilus MK063724 and Candida versatilis MK063708 in Pixian soybean paste on the flavor quality of broad bean paste， headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS） is used to analyze the differences of volatile flavor compounds in enhanced fermented broad bean paste by different inoculation methods. The results show that a total of 69 volatile compounds are detected in all samples， and there are significant differences in the content of volatile compounds among different fermentation groups.Compared with the traditional fermentation group， the content of volatile compounds in the co-inoculation group of Tetragenococcus halophilus and Candida versatilis， Candida versatilis group and Tetragenococcus halophilus group increases by 60.49%， 30.09% and 27.05% respectively， mainly concentrates in the increase of the content of esters and alcohols. Partial least squares discriminant analysis indicates that the aroma properties of samples inoculated with both Tetragenococcus halophilus and Candida versatilis are significantly different from those of other fermentation groups. Combined with odor activity value analysis， simultaneous inoculation of both bacteria can form richer characteristic aroma substances， especially esters such as 2-methylbutanoate ethyl ester， hexanoate ethyl ester and phenylacetate ethyl ester， which is beneficial for enhancing the aroma of flowers and" fruits. The research results can provide theoretical guidance for the improvement of flavor quality of Pixian soybean paste.

Key words： broad bean paste; Tetragenococcus halophilus; Candida versatilis; enhanced fermentation; characteristic flavor compounds

收稿日期：2024-05-23

基金項目：四川省自然科學基金青年科學基金項目（2022NSFSC1624）

作者簡介：汪坤（1997—），男，碩士，研究方向：發酵食品加工。

*通信作者：程杰（1989—），男，副研究員，博士，研究方向：肉制品加工。

郫縣豆瓣是我國傳統的發酵調味品之一，具有味辣香醇和瓣粒酥脆等特點，是川菜中不可或缺的調味料，被譽為“川菜之魂”［1-2］。在傳統發酵工藝中，郫縣豆瓣以去皮蠶豆瓣和辣椒為主要原料，經蠶豆發酵和辣椒發酵后，分別得到蠶豆醬和辣椒胚，再以特定的比例將兩者進行混合發酵，最終得到郫縣豆瓣［3-4］。在蠶豆發酵階段，內源性微生物會分泌大量酶系，將蛋白質、碳水化合物等大分子物質水解成小分子肽類和氨基酸并產生大量風味獨特的化合物，是郫縣豆瓣生產的關鍵階段［5-6］。然而，由于采用高鹽和半密閉的發酵環境，蠶豆醬的制備存在生產周期長、質量不穩定等問題，影響了郫縣豆瓣產業的進一步發展。

風味是評定發酵食品質量的重要指標，也是影響消費者購買的重要因素［7］。近年來，大量研究表明引入特定的微生物強化發酵傳統釀造食品，不僅可以顯著縮短發酵周期，有效抑制雜菌污染，而且能提升產品的風味品質及其穩定性［8］。Li等［9］利用嗜鹽四聯球菌與異常威克漢姆酵母對醬油進行強化發酵，發現酚類、酯類、醛類、酸類化合物含量分別增加了482%、258%、137%和93%。Zhang等［10］利用魯氏接合酵母與多變假絲酵母對醬油進行強化發酵，發現酮類、酯類、酚類、醇類化合物含量分別增加了307%、191%、136%、123%。然而目前關于蠶豆醬的研究主要集中在優勢微生物的分離鑒定和特征風味化合物的挖掘， 鮮有關于不同強化發酵方式對蠶豆醬風味品質調控作用的研究。

嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus）和多變假絲酵母（Candida versatilis）是前期從郫縣豆瓣中分離出的內源性優勢耐鹽微生物，能代謝形成不同的揮發性風味化合物，且具有一定的“互補”作用。基于此，本文以嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母為強化發酵菌株，采用單獨接種和共同接種等不同方式制備蠶豆醬，探索不同強化發酵方式對蠶豆醬揮發性風味化合物的影響，以期為郫縣豆瓣的風味品質提升提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：嗜鹽四聯球菌（MK063724）、多變假絲酵母（MK063708），分離自成都市郫縣豆瓣樣品。

MRS肉湯：杭州百思生物技術有限公司；YPD液體培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司；2-辛醇：上海麥克林生化科技有限公司；正構烷烴（C7～C30）標準品：Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司；3，5-二硝基水楊酸：上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、37％～40％甲醛溶液（均為分析純）：成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

L500-A臺式低速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；FiveEasy Plus臺式pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DF-101T集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；UV-6000PC紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；GCMS-QP2010SE氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；BG-160隔水式恒溫培養箱 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的制備

嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母經2次活化后，分別采用MRS和YPD液體培養基在30 ℃條件下培養72，36 h，隨后在4 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，棄上清，利用無菌生理鹽水清洗菌體2～3次，備用。

1.3.2 蠶豆醬的制備

制備工藝流程：蠶豆→浸泡→混合面粉→制曲→接種→發酵→成品。

將去皮的蠶豆在95 ℃左右水中浸泡約3 min，冷卻至30 ℃后，將拌好曲精的面粉均勻地撒在蠶豆瓣上，充分混合均勻后，于32～37 ℃條件下制曲，每10 h左右進行翻曲并通風，48 h左右出曲，保證出曲時曲料水分≤15%。

發酵前，向曲瓣子中加入適量已完全溶解的食鹽水溶液，保證最終的食鹽含量為12%，然后接種相應的菌種（接種量均為106 CFU/g）。本實驗設置4個批次的實驗組，分別為不接種的傳統發酵組（TF）、單獨接種嗜鹽四聯球菌組（TH）、單獨接種多變假絲酵母組（CV）、共同接種嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母組（TC），另外，發酵第1天的樣品記錄為CD。混合均勻后，將樣品置于30 ℃條件下發酵60 d，定期攪拌，發酵完成后，在發酵罐的上、中、下層均等采樣并混合均勻，隨后將樣品保存于－18 ℃凍庫中，并盡快用于后續實驗分析。

1.3.3 理化指標的測定

pH采用pH計測量；總酸、氨基酸態氮的測定分別依據GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》和GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》；還原糖含量的測定采用3，5-二硝基水楊酸法［11］。

1.3.4 揮發性化合物的測定

揮發性化合物的測定參考Jiang等［12］報道的方法并略作修改：準確稱取5.0 g預先研磨均勻的樣品于20 mL頂空瓶中，添加10 μL內標（4 μg/mL 2-辛醇溶液），密封頂空瓶。將頂空瓶置于55 ℃水中平衡15 min，隨后將活化后的萃取頭插入頂空瓶內并推出纖維頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS），在55 ℃條件下吸附30 min，吸附結束后立即插入GC進樣口解吸5 min。

GC條件：選用Agilent DB-5MS氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件：初始柱溫40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持4 min；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；不分流模式進樣。

MS條件：采用電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV；掃描范圍（m/z）：41～330 u；離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃。

1.4 數據處理

揮發性化合物的定性分析通過NIST 17標準數據庫進行比對（相似度≥80％），化合物的保留指數（retention index，RI）由正構烷烴（C7～C30）標準品計算得到。揮發性化合物的相對含量由待測物的峰面積與內標物2-辛醇的峰面積確定。所有實驗重復3次，采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），采用SIMCA 14.1軟件進行偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），并利用Origin 2021進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 理化指標分析

由表1可知，隨著發酵的進行，體系中微生物代謝產生各種酶系水解蠶豆中的大分子物質，從而引起理化指標的顯著改變，pH顯著下降，而總酸、氨基酸態氮和還原糖的含量呈現不同程度的上升。發酵60 d后，單獨接種嗜鹽四聯球菌組（TH）的pH略低于其他發酵組，這可能與嗜鹽四聯球菌的產酸能力較強相關［13］。氨基酸態氮是衡量蠶豆醬的重要指標，整體上，強化發酵的蠶豆醬氨基酸態氮含量與傳統發酵組（TF）相當，TH組的氨基酸態氮含量略低于TF組，該結果與Cui等［14］的研究結果相似。課題組前期研究發現［13］，嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母產蛋白酶的能力非常弱，這也與強化發酵不能顯著提升蠶豆醬的氨基酸態氮含量相匹配。此外，不同組別中還原糖含量的差異可能是由于體系中微生物利用還原糖進行繁殖代謝，隨著還原糖的消耗量不斷增加，導致TF組的還原糖含量最高，TC組的還原糖含量最低［14］。

2.2 揮發性化合物分析

不同組蠶豆醬樣品的GC-MS總離子流圖見圖1。

5組樣品中共鑒定出69種揮發性化合物，其中酯類28種、醇類9種、醛類10種、酸類3種、酮類4種、酚類3種、雜環類化合物5種、含硫化合物1種以及其他類6種，見表2。

由圖2中A可知，發酵60 d后，TF組、TH組、CV組和TC組中分別鑒定出44，50，41，45種揮發性化合物，數量較發酵第1天的樣品CD均有大幅度增加。由圖2中B可知，從含量上看，樣品CD揮發性化合物總含量為157.80 μg/kg，主要為醇類、酯類和醛類化合物，其中己醛（61.15 μg/kg）占比（38.75%）最高；而發酵結束后，4個組別樣品揮發性化合物含量較發酵初期樣品有顯著性增加（Plt;0.05），介于328.83～527.75 μg/kg之間，集中在酯類、醇類和酸類化合物含量的提升。同時接種嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母對揮發性化合物的含量提升效果最顯著（Plt;0.05），相較于傳統發酵組（TF），TC組總含量提升了60.49%，其中酯類、醇類和酸類化合物含量分別增加了138.42%、51.74%、93.22%。

酯類化合物主要由酸類和醇類物質通過酯化反應生成［15］，而嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母分別具有很強的產酸和產醇能力，可以高效富集多種酯類化合物。實驗結果也證實了相較于TF組，TC組樣品中的苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯等酯類化合物都呈現顯著性上升趨勢，苯乙酸乙酯含量更是提升了1 567.05%，是蠶豆醬重要的香氣活性物質。此外，TC組酯類化合物的含量相比單獨接種嗜鹽四聯球菌或多變假絲酵母的樣品有顯著性增加（Plt;0.05）。這些酯類化合物賦予了蠶豆醬獨特的花果香味和甜味，并能掩蓋游離氨基酸和脂肪酸帶來的苦味和刺鼻性氣味［8］，可見共同接種嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母強化發酵對蠶豆醬風味品質的提升發揮了重要作用。

醇類化合物一般由醛類或酮類物質還原生成，能賦予產品令人愉悅的芳香氣味［15］。發酵結束后，TC組醇類化合物的含量為174.62 μg/kg，占總含量的33.09%。其中，苯乙醇的含量增加最顯著（Plt;0.05），較TF組提升了181.06%，它已被大量文獻證實是蠶豆醬中重要的特征風味化合物，能賦予蠶豆醬濃郁的花香［16-17］。

適量的酸類物質能賦予蠶豆醬一定的酸香味，但過量的積累會帶來令人不愉快的酸味［18］。發酵完成后，TC組酸類化合物的含量雖顯著高于傳統發酵TF組，但相較于單獨接種發酵的TH組或CV組卻呈現顯著性下降的趨勢（Plt;0.05），這可能是部分酸類化合物被微生物利用，用于合成酯類化合物所致。該結果表明同時接種嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母進行強化發酵，不僅有助于芳香風味的產生，而且可以避免產品產生濃郁的酸味。

醛類和酮類化合物主要來源于脂類物質的氧化降解［19］，相比于酯類化合物，它們對蠶豆醬的香氣貢獻相對較小。由圖2中B可知，在不同發酵方式下，醛類和酮類化合物的總含量差異較小，但相較于TF組，TC組樣品中苯乙醛和2-苯基-2-丁烯醛含量分別增加了21.50%、2 231.25%。其中，苯乙醛是很多發酵食品重要的香氣來源，可以呈現濃郁的蜂蜜味［20］。

此外，酚類、雜環類化合物、含硫化合物等物質在樣品中所占的比例雖然不高，但由于其閾值較低，通常也被認為是發酵食品中非常重要的香氣來源［21］。研究結果表明，TC組中4-乙基愈創木酚和丁香酚的含量較TF組有顯著性增加（Plt;0.05），分別提升了112.99%、36.42%。其中，4-乙基愈創木酚已被證實是豆瓣醬的標志性風味成分，可賦予產品獨特的烤大豆氣味［2］。而其他發酵食品中重要的風味化合物，如3-甲硫基丙醛，在單獨接種多變假絲酵母組的樣品中含量更高，具體原因還有待進一步探究。

為進一步考察不同發酵方式對蠶豆醬揮發性風味化合物的影響，以檢測到的69種化合物作為自變量，不同條件的蠶豆醬樣品作為因變量，對樣品及檢測到的化合物進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），見圖3。

其中，R2X（cum）=0.968，R2Y（cum）=0.99，均接近1，同時Q2（cum）=0.96gt;0.5，表明該模型質量良好［22］；R2X［1］和R2X［2］方差分別為60.1%和24.0%，兩者之和為84.1%，能較好地解釋相關變量。由圖3可知，不同發酵方式的樣品位于不同的區域，其中CD組分布于pc［1］的正半軸，TC組位于pc［1］的負半軸，而其他3組樣品聚集在坐標軸的中央位置，該結果表明同時接種嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母的蠶豆醬風味成分可以顯著區別于其他組別，而單獨接種發酵的樣品揮發性化合物與傳統發酵的差異較小。同時，圖3可以體現揮發性化合物和各組樣品的相關性，一般X值和Y值越接近，表示相關性越高［22］。結果表明，更多的揮發性化合物主要聚集在TC組樣品附近，包括2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、丁二酸乙酯、辛酸乙酯、3-苯丙酸乙酯和2-苯基-1-丁醇，表明同時接種嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母有利于多種揮發性化合物的累積。

2.3 特征風味化合物分析

為了進一步探究不同發酵方式對蠶豆醬香氣的影響，對蠶豆醬的特征風味化合物進行氣味活性值（odor activity value，OAV）分析，見表3。

由表3可知，共有17種化合物（OAV≥1）被定義為特征風味化合物［23］。其中，己醛、正己醇和1-辛烯-3-醇等化合物在發酵初期樣品中含量較高，這與課題組的前期研究結果一致［4，23］，可能與米曲霉的代謝相關［21］。經60 d發酵后，異戊醇、苯乙醛、壬醛、癸醛、對乙烯基愈創木酚和3-甲硫基丙醛在不同發酵組別中均被檢測到，可以賦予產品花果香、煙熏味、焦香味和烤土豆味等香氣屬性。值得注意的是，2-甲基丁酸乙酯和己酸乙酯僅在TC組中被檢出；此外，相較于傳統發酵，苯乙酸乙酯、苯乙醛等在TC組中顯著提升，呈現濃烈的花果香。該結果表明同時接種嗜鹽四聯球菌和多變假絲酵母強化發酵有利于酯類特征香氣化合物的富集，賦予產品更豐富的甜味和花果香。

3 結論

本文采用GC-MS探索了嗜鹽四聯球菌與多變假絲酵母強化發酵對蠶豆醬揮發性風味化合物的影響。結果表明，酯類、醇類和酸類化合物是蠶豆醬中含量最豐富的揮發性化合物，且不同接種方式對蠶豆醬揮發性化合物含量的影響顯著。相較于傳統發酵組，同時接種嗜鹽四聯球菌與多變假絲酵母的樣品（TC組）揮發性化合物含量提升了60.49%，遠高于單獨接種的樣品，PLS-DA表明TC組樣品的揮發性化合物屬性可顯著區別于其他發酵組。進一步通過OAV分析確定了17種特征香氣化合物，其中2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、苯乙酸乙酯等酯類化合物在TC組中含量顯著增高，表明同時引入嗜鹽四聯球菌與多變假絲酵母強化發酵蠶豆醬有助于富集揮發性香氣化合物，尤其是酯類化合物，從而賦予產品更豐富的甜味和花果香氣。本研究可為蠶豆醬及其他發酵食品的風味調控提供理論指導。

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