副干酪乳桿菌FG-14發酵萬壽菊工藝及益生的研究

摘要：研究了副干酪乳桿菌FG-14發酵萬壽菊工藝，以葉黃素酯含量為評價指標，通過單因素試驗和響應面試驗設計優化發酵工藝，接種量5%、發酵溫度36 ℃、發酵時間95 h時獲得了較好的發酵結果，葉黃素酯含量達到30.85 mg/L。發酵過程中pH值下降，還原糖含量先下降后上升，葉黃素酯含量上升，推測副干酪乳桿菌FG-14發酵萬壽菊加速了葉黃素酯的溶出。在上述研究的基礎上，將副干酪乳桿菌FG-14發酵萬壽菊產物復配成復合粉，結果表明該產品對緩解視疲勞有積極效果，推測與副干酪乳桿菌FG-14、提高溶出的葉黃素酯含量和副干酪乳桿菌FG-14代謝產物有關。

關鍵詞：副干酪乳桿菌；葉黃素酯；萬壽菊；視疲勞

中圖分類號：TS201.1 """""文獻標志碼：A """"文章編號：1000-9973（2024）12-0100-05

Study on Fermentation Process of Tagetes erecta with Lactobacillus

paracasei FG-14 and Its Probiotic Effect

LI Xiu-juan1， LIN Feng-xiang1， HOU Ying1， ZHANG Xing-liang1， HAN Xue1，

YIN Yan-yang1， FAN Hong-chen2， QIN Qi1*

（1.Harbin Meihua Biotechnology Co.， Ltd.， Harbin 150010， China; 2.College of Food

Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin 150028， China）

Abstract： The fermentation process of Tagetes erecta with Lactobacillus paracasei FG-14 is studied. With the content of lutein ester as the evaluation index， the fermentation process is optimized through single factor test and response surface test design， the better fermentation results are obtained when the inoculation amount is 5%， the fermentation temperature is 36 ℃ and the fermentation time is 95 h， the content of lutein ester reaches 30.85 mg/L. During the fermentation， pH value decreases， reducing sugar content firstly decreases and then increases， and lutein ester content increases. It is speculated that the fermentation of Tagetes erecta with Lactobacillus paracasei FG-14 accelerates the dissolution of lutein ester. On the basis of the above studies， Tagetes erecta product fermented with Lactobacillus paracasei FG-14 is synthesized into complex powder， and the results show that the product has a positive effect on alleviating visual fatigue， which is presumed to be related to Lactobacillus paracasei FG-14， increasing the content of dissolved lutein ester and metabolites of Lactobacillus paracasei FG-14.

Key words： Lactobacillus paracasei; lutein ester; Tagetes erecta; visual fatigue

收稿日期：2024-05-20

基金項目：黑龍江省教育廳重點研發項目（YQJH2023241）

作者簡介：李秀娟（1989—），女，工程師，博士研究生，研究方向：生物與醫藥。

*通信作者：秦琦（1990—），女，工程師，博士研究生，研究方向：微生物。

副干酪乳桿菌廣泛存在于醬油渣、酒和飼料中，在人體口腔和腸道中也有大量發現，它具有平衡腸道菌群、抑菌、降血壓、抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇等益生功能，因此，在食品、醫療保健等領域發揮著重要作用［1］。劉婉琳等［2］將從貴州傳統特色酸湯中分離出的功能性微生物副干酪乳桿菌用于發酵生產特色香菇酸辣醬調味品，得到色澤紅潤、香味濃郁、酸辣可口的香菇酸辣醬調味品；方冠宇等［3］在浙江玫瑰醋發酵過程中發現副干酪乳桿菌的豐度較高，對醋風味的貢獻較大；唐素婷等［4］從醬油渣中分離鑒定出的副干酪乳桿菌具有較高的抗氧化特性。副干酪乳桿菌除了在調味品中大量應用外，在發酵萬壽菊中也有報道［5-7］。萬壽菊是一種普遍種植的經濟植物，含有豐富的葉黃素和生物堿類成分，其中葉黃素酯（lutein ester）在萬壽菊中含量最高，是重要的類胡蘿卜素脂肪酸酯，具有抗氧化、抗炎和抗血管生成的特性；葉黃素酯除了對老年性黃斑退化病和白內障等視力疾病起到預防作用外，其提取物還可以緩解視疲勞，對眼脹、眼痛、畏光、視物模糊、眼干澀等視疲勞癥狀有改善作用［5］。

將益生菌與萬壽菊結合，開發成后生元，來自菌體與萬壽菊的代謝產物（胞外多糖、多肽、細菌素、有機酸、短鏈脂肪酸、寡聚多糖、酶、維生素、氨基酸等）和滅活菌體成分（肽聚糖、磷壁酸、多糖、脂質、細胞膜蛋白等）發揮后生元多種益生功效，如對胃腸道系統的作用（改善便秘、預防結腸炎）、對機體代謝的作用（緩解肥胖、Ⅱ型糖尿病）、改善皮膚屏障功能和對神經系統的作用等［8］。隨著社會的進步與發展，工作競爭激烈，人們長期過度用眼、疲勞用眼，導致視疲勞的發生率逐年上升，相關數據顯示，我國目前有1.5億以上視疲勞患者［9-10］，緩解現狀刻不容緩。

本研究采用副干酪乳桿菌FG-14發酵萬壽菊，研究發酵溫度、發酵時間和接種量對萬壽菊葉黃素酯含量的影響，在此基礎上將發酵液冷凍干燥成粉，復配制成復合粉，并研究其對緩解視疲勞的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

萬壽菊粉：陜西斯諾特生物技術有限公司；3，5-二硝基水楊酸：湖北科沃德化工有限公司；氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉：天津金匯太亞化學試劑有限公司；結晶酚：北京華越洋生物科技有限公司；無水硫酸鈉：壽光市邦澤化工有限公司；乙醇：山東誠泰化工有限公司；葡萄糖標準品：壇墨質檢標準物質中心；葉黃素標準品：四川普西奧標物科技有限公司；菊粉、萬壽菊粉、枸杞粉、桑葚粉、藍莓粉：天津真如果食品工業有限公司；低聚果糖、低聚異麥芽糖：陜西百川生物科技有限公司；副干酪乳桿菌FG-14：哈爾濱美華生物技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

0～100 ℃溫度計 衡水市博德福儀器儀表有限公司；PHS-3E pH計 北京時代新維測控設備有限公司；752N紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵液的制備

稱取100 g萬壽菊粉，加入200 mL蒸餾水，在121 ℃下滅菌20 min，接種副干酪乳桿菌FG-14發酵。

1.3.2 單因素試驗

接種量分別為3%、4%、5%、6%、7%，發酵時間分別為85，90，95，100，105 h，發酵溫度分別為32，34，36，38，40 ℃，以葉黃素酯含量為評價指標，確定各因素范圍。

1.3.3 工藝優化響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以接種量、發酵溫度、發酵時間作為響應變量，以葉黃素酯含量為響應值，利用Design-Expert 8.0.6.1進行三因素三水平的Box-Behnken試驗，試驗因素水平見表1。

1.3.4 測定指標

1.3.4.1 pH值的測定

根據GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》。

1.3.4.2 活菌數的測定

參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》。

1.3.4.3 還原糖含量的測定

采用比色法，在540 nm波長處測定還原糖的含量［11］。

1.3.4.4 葉黃素酯含量的測定

取適量的提取物，按照測定葉黃素酯含量的標準曲線制作方法，在443 nm處測其吸光度值，代入回歸方程，求出發酵液中葉黃素酯的含量［12］。

1.3.4.5 復合粉的制備

將低聚果糖、低聚異麥芽糖、菊粉、添加2%副干酪乳桿菌FG-14的萬壽菊發酵液凍干粉、枸杞粉、桑葚粉、藍莓粉充分混合均勻即為復合粉。

1.3.4.6 復合粉人群試食試驗

受試品：復合粉；對照品：復合粉中萬壽菊發酵液凍干粉以萬壽菊粉替代。

受試人群分組：隨機選擇50名志愿者，均有不同程度的眼部不適；試驗組和對照組各25人，其中對照組25人，男13人，女12人；試驗組25人，男12人，女13人。兩組每天2次分別服用受試品和對照品，每次服用2 g，連續服用30 d。

1.3.4.7 視覺疲勞癥狀判定方法

視覺疲勞癥狀判定方法見表2。

1.4 數據處理

采用Excel 2016、SPSS 26.0軟件進行數據統計，采用Origin 2019b軟件作圖，使用Design-Expert 8.0.6.1軟件對響應面試驗進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 接種量對葉黃素酯含量的影響

由圖1可知，隨著接種量的增加，葉黃素酯含量先上升后下降。當接種量為5%時，葉黃素酯含量最高，為25.56 mg/L。當接種量低于5%時，發酵過程緩慢，發酵不充分，影響葉黃素酯含量；當接種量高于5%時，葉黃素酯含量下降。發酵液中葉黃素酯的含量與溶出和損耗有關，原因可能是接種量適當時，乳酸菌將植物組織中可溶性碳水化合物轉化成有機酸，有利于葉黃素酯的溶出，同時菌代謝也會對葉黃素酯轉化造成損耗，當接種量為5%時，溶出與轉化達到最高［13］。因此，根據葉黃素酯含量，選擇接種量為4%～6%進行響應面試驗。

2.1.2 發酵時間對葉黃素酯含量的影響

由圖2可知，隨著發酵時間的增加，葉黃素酯含量先上升后下降。當發酵時間為95 h時，葉黃素酯含量最高，為27.89 mg/L。發酵時間過短，溶出不完全，導致葉黃素酯含量低；發酵時間過長，導致葉黃素酯降解［14］。因此，根據葉黃素酯含量，選擇發酵時間為90～100 h進行響應面試驗。

2.1.3 發酵溫度對葉黃素酯含量的影響

由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，發酵液中葉黃素酯含量先上升后下降。當發酵溫度為36 ℃時，葉黃素酯含量最高，為25.55 mg/L。發酵溫度較低，發酵過程緩慢，產酸速度較慢，葉黃素酯含量低；發酵溫度較高，導致葉黃素酯含量下降，可能是由于過高的發酵溫度使菌種大量繁殖，長時間高溫發酵使葉黃素酯分解［15］。因此，根據葉黃素酯含量，選擇發酵溫度為34～38 ℃進行響應面試驗。

2.2 響應面試驗設計與結果

2.2.1 響應面試驗設計

利用Design-Expert 8.0.6.1進行三因素三水平的Box-Behnken試驗，試驗設計與結果見表3。

2.2.2 模型的建立及顯著性分析

根據表3中的結果，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行二元回歸方程擬合和方差分析，得到回歸方程：Y=30.41+1.00A－1.08B+0.25C+1.05AB－1.20AC－0.22BC－4.10A2－0.46B2－1.77C2，方差分析結果見表4。

由表4可知，該模型達到極顯著水平（P＜0.01），說明該模型的擬合程度較好，適用于復合飲料工藝參數的優化。在回歸方程中，A、B、C、BC、A2、B2、C2對葉黃素酯含量的影響極顯著（Plt;0.01），AB、AC對葉黃素醋含量的影響顯著（Plt;0.05）。F值越大，表明其對應因素對試驗指標的影響越大，對葉黃素酯含量的影響大小為接種量gt;發酵時間gt;發酵溫度。

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行預測，最佳的復合飲料發酵工藝條件為發酵溫度36.54 ℃、發酵時間93.83 h、接種量4.81%，此時葉黃素酯含量為31.05 mg/L。為了方便試驗操作，將優化條件調整為發酵溫度36 ℃、發酵時間95 h、接種量5%，此時葉黃素酯含量平均值為30.85 mg/L，與預測結果相差不大，可以將其定為最佳發酵條件。

2.3 發酵過程中pH值和還原糖含量的變化

由圖4可知，隨著發酵時間的增加，pH值先降低后升高，在發酵30 h時pH值達到最低，為5.18，隨后略有升高，推測原因是副干酪乳桿菌FG-14發酵萬壽菊過程中將還原糖轉化成有機酸，導致pH值在30 h內降低并達到最低，隨后隨著還原糖的溶出減少和葉黃素酯的溶出增多，改變了副干酪乳酪桿菌FG-14代謝，使pH值略有回升［16-19］。隨著發酵時間的增加，還原糖含量先降低后逐漸升高，在發酵30 h內，還原糖含量驟降，在發酵30 h時達到最低值1.2%。發酵過程中還原糖含量與還原糖的溶出和消耗有著直接關系，發酵前期，乳酸菌利用溶出的還原糖代謝生成乳酸及其他代謝產物，消耗大于溶出，還原糖含量大幅降低［19-20］；后期由于pH值的降低，乳酸菌代謝緩慢，還原糖的溶出大于消耗，導致發酵液中的還原糖含量略有回升。

2.4 緩解視覺疲勞癥試驗

對照組和試驗組服用前后結果見表5和表6。

由表5和表6可知，對照組服用對照品前后視疲勞癥狀評分無變化，試驗組的視疲勞癥狀評分降低至16分，試驗組的視疲勞癥狀評分均低于對照組。上述結果表明，服用含副干酪乳酪桿菌FG-14復合粉后，可優先緩解眼部不適問題，葉黃素酯在抗氧化維護視網膜功能和肌肉退化所導致的盲眼病方面有著廣泛的生物活性［21-22］，可協同保護眼部健康，緩解視疲勞。

3 結論

選取副干酪乳桿菌FG-14對萬壽菊粉進行發酵，最佳發酵工藝條件為發酵溫度36 ℃、發酵時間95 h、接種量5%，此時葉黃素酯含量為30.85 mg/L。通過檢測發酵過程中pH值、還原糖含量的變化反映副干酪乳桿菌FG-14的產酸生長情況，并將發酵液與菌體凍干粉制成復合粉，有良好的緩解視疲勞功能，為今后緩解視疲勞功能產品的研發提供了參考依據。

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