雞血制備肉味香精前體物酶解工藝的優化

摘要：為建立和優化肉味香精前體物的最佳酶解工藝，該試驗利用蛋白水解酶制備肉味香精前體物，以雞血的理化分析為基礎，以雞血蛋白水解度為水解參考指標，通過單因素試驗研究酶解時間、酶解溫度、加酶量和酶種類4個因素對水解度的影響；在單因素試驗的基礎上，采用響應面法設計四因素三水平的優化方案，為避免試驗條件下工藝參數在實際生產過程中缺乏適應性的問題，參考層次分析法確定酶解生產過程中模糊優選因素的權重值，通過模糊數學決策法結合響應面多元二次回歸模型進行矩陣變換運算，建立多元回歸模型，確定最佳的酶解工藝參數。結果表明，雞血蛋白質含量為（16.53±0.41）%，經預處理后蛋白質含量高達（48.65±0.28）%，表明雞血具有良好的制備肉味香精的應用潛力；層次分析得出權重集C=（生產效率0.32，原料利用率0.14，原料及設備成本0.24，能耗0.30），對多元二次回歸模型得到的排名前20的工藝條件進行模糊數學決策法矩陣變換計算，得到最佳酶解工藝為酶解時間3 h、酶解溫度37 ℃、加酶量3 605 U/g、酶種類胰蛋白酶，此工藝條件下分數最高，為0.713分。通過驗證，此最佳酶解工藝方案可行，對于雞肉香精的制備具有良好的實踐參考價值。

關鍵詞：雞血；肉味香精；酶解；模糊數學決策法

中圖分類號：TS264.3""""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）12-0124-08

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process for Preparation of

Meat-Flavor Essence Precursor with Chicken Blood

YUE Hui1，2，3， ZOU Meng-lin3， MA Ji-yuan3， HAN Hao-lan3， FENG Yan-li3， HU Yuan-liang3， LIU Jun1，2，3*

（1.Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation and Utilization， Hubei Normal

University， Huangshi 435002， China; 2.Hubei Engineering Research Center of

Characteristic Wild Vegetable Breeding and Comprehensive Utilization

Technology， Huangshi 435002， China; 3.College of Life Sciences，

Hubei Normal University， Huangshi 435002， China）

Abstract： In order to establish and optimize the optimal enzymatic hydrolysis process of meat-flavor essence precursor， in this study， meat-flavor essence precursor is prepared using protein hydrolase. Based on the physicochemical analysis of chicken blood， with the degree of hydrolysis of chicken blood protein as the hydrolysis reference index， single factor test is conducted to investigate the effect of four factors such as enzymatic hydrolysis time， enzymatic hydrolysis temperature， enzyme addition amount and enzyme type on the degree of" hydrolysis. Based on the single factor test， a four-factor and three-level

optimization scheme is designed through response surface method. In order to avoid the problem of lack of adaptability of process parameters under test conditions in actual production process， the weight values of fuzzy selected factors in enzymatic hydrolysis production process are determined by referring to the analytic hierarchy process. A multiple regression model is established using fuzzy mathematics decision method combined with response surface multiple quadratic regression model for matrix transformation operation to determine the optimal enzymatic hydrolysis process parameters. The results show that the protein content of chicken blood is （16.53±0.41）%， which increases to （48.65±0.28）% after pretreatment， indicating that chicken blood has great application potential for preparing meat-flavor essence. Through analytic hierarchy，" a weight set C is obtained （C=production efficiency 0.32， raw material utilization rate 0.14， cost of raw material and equipment 0.24， energy consumption 0.30）. Fuzzy mathematics decision method matrix transformation calculation is conducted on the top 20 process conditions obtained from the multiple quadratic regression model， and the optimal enzymatic hydrolysis process is obtained as follows：" enzymatic hydrolysis time is 3 h， enzymatic hydrolysis temperature is 37 ℃， enzyme addition amount is 3 605 U/g， and enzyme type is trypsin. Under such process conditions， the score is the highest of 0.713 points.Through verification， it is found that the optimal enzymatic hydrolysis process is feasible and has good practical reference value for the preparation of chicken essence.

Key words： chicken blood; meat-flavor essence; enzymatic hydrolysis; fuzzy mathematics decision method

收稿日期：2024-05-13

基金項目：國家星火計劃（2015GA880005）;湖北省高等學校優秀中青年科技創新團隊計劃項目（T2022028）;湖北師范大學人才引進項目（20230050）

作者簡介：樂惠（2000—），女，碩士研究生，研究方向：微生物及農產品資源加工利用。

*通信作者：劉軍（1993—），男，講師，博士，研究方向：微生物及農產品資源加工利用。

血液作為維持機體運轉的重要運輸介質，其營養元素豐富，具有高蛋白質、低脂肪等特點，還含有氨基酸、礦物質、維生素和血紅素鐵等多種活性物質，特別是血紅蛋白含量豐富，高達17%，因此血液被稱為“液體肉”［1］。雞血作為肉雞屠宰過程中的主要副產物，占胴體質量的6%～8%，2019年我國肉雞產量為1 380萬噸，可產雞血約110萬噸［2］。由于飲食習慣和深加工技術等因素的限制，雞血副產品長期以來并未受到市場關注和利用，這在一定程度上限制了肉雞產業鏈的發展，同時屠宰時雞血的傳統處理方式也給環境帶來了一定的污染［3］。

近年來，已有學者對雞血的利用進行了探究，鄭召君等［4］以雞血為原料，利用蛋白酶酶解雞血制備抗氧化肽；呂永平等［5］以制作符離集燒雞產生的雞血為原料進行鹵制，探索醬鹵雞血軟包裝食品；劉宇佳等［6］以雞血和大豆為原料，制作雙蛋白雞血內酯豆腐，所得產品的膠凝效果好，品質細嫩、柔軟；梁肖娜［7］以雞血為原料，研究雞血發酵液作為液體肥料的應用潛力。目前，對雞血的可食用性研究依舊較少，導致雞血的利用程度仍然較低［8］。現階段制備肉味香精的前體物多為植物蛋白，其天然風味成分在生產過程中極易改變，使得肉味香精圓潤、細膩的口感和芳香味等存在不足［9］。研究表明，利用酶解技術對扇貝［10］、雞骨［11］、豬血［12］進行處理制備的肉味香精味道鮮美、肉味濃郁。因此，利用酶解處理屠宰過程中的副產物——雞血制備肉味香精，能有效利用雞血，提高雞血的附加值。

目前有關肉味香精前體物酶解工藝的研究主要集中在實驗室階段，盡管基礎理論的研究是工業生產的基礎，但實際生產所面臨的生產效率、工藝復雜程度及各項成本也是重要的影響因素。本研究在對雞血中蛋白、脂肪、無機鹽等進行理化分析的基礎上，利用木瓜蛋白酶（M）、胰蛋白酶（Y）、堿性蛋白酶（J）、胃蛋白酶（W）和風味蛋白酶（F）對雞血蛋白進行酶解，篩選得到最適水解酶；以水解度（氨基態氮含量）為指標，確定酶解最佳工藝條件和酶解條件的多元二次回歸模型；以生產效率、原料利用率、原料及設備成本、能耗為酶解工藝選擇權重因子，通過模糊數學決策法的矩陣變換原理篩選雞血蛋白的最佳酶解工藝。本研究結果為充分利用肉雞屠宰過程中的副產物雞血、肉味香精的工業化生產提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞血：取樣于實驗室屠宰的白羽肉雞;肉雞：購于濟南市歷下區十里河社區農貿市場;木瓜蛋白酶（M，5萬U/g）、胰蛋白酶（Y，2.5萬U/g）、風味蛋白酶（F，6萬U/g）、堿性蛋白酶（J，9萬U/g）、胃蛋白酶（W，3萬U/g）（均為食品級）：北京聯立信生物技術有限公司;檸檬酸三鈉（食品級）：河北鵬宇生物科技有限公司;生理鹽水（食品級）：山東華魯制藥有限公司。

1.2 儀器與設備

AL-204型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;DF-Ⅱ型集熱式磁力攪拌器 常州諾基儀器有限公司;HHS-21-6型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;精科N4型紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;ZDDN-Ⅱ型全自動凱氏定氮儀 浙江托普云農科技股份有限公司;BCD-216STPT型家用冰箱 青島海爾股份有限公司;MDF-86V588E型-80 ℃超低溫保存箱 安徽中科都菱商用電器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雞血預處理

在新鮮雞血中加入0.6%檸檬酸三鈉抗凝，以5 000 r/min離心15 min，取下層凝聚物，加二倍體積的生理鹽水，以5 000 r/min離心15 min清洗除雜，收集下層雞血蛋白凝聚物于－20 ℃冷凍保藏［13］。

1.3.2 雞血理化性質的測定

參考閆向民等［14］的方法，按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中的方法測定水分含量；參考孫曉明等［15］的方法，按照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中的方法測定脂肪含量；參考劉博等［16］的方法，按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中的方法測定蛋白質含量；參考魏金濤等［17］的方法，按照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》中的方法測定無機鹽含量。

1.3.3 雞血蛋白酶解工藝流程

稱取20 g左右的冷凍保藏雞血蛋白凝聚物，按2∶1的比例加入超純水（雞血蛋白溶液濃度為25%），磁力攪拌1 h復溶，95 ℃水浴處理10 min，向水浴鍋內加入自來水，將溫度降至50 ℃以下，加入一定量的蛋白水解酶，在特定溫度條件下酶解一定時間，然后加熱至90 ℃保持10 min滅酶，即得到雞肉香精前體物雞血蛋白酶解液。

1.3.4 雞血蛋白水解度的測定

采用茚三酮比色法，參考鄭麗波等［12］的方法測定雞血蛋白水解度（DH），計算公式如下：

DH（%）=D2－D1D0－D1×100%。

式中：DH表示水解度（%）；D0表示酶解液中總氨基氮質量濃度（mg/L）；D1表示酶解前酶解液中游離氨基氮質量濃度（mg/L）；D2表示酶解后酶解液中游離氨基氮質量濃度（mg/L）。

1.3.5 雞血蛋白酶解單因素試驗

參考柳倩［13］、張崟等［18］的方法制備雞血肉味香精工藝，加酶量3 500 U/g（以蛋白計），既能保證香精風味又能節約時間，實際工業化生產過程中，在保證工藝的前提下，能耗和原料及設備成本是需要考慮的重要因素，固定底物濃度，設置酶解時間、酶解溫度、加酶量和酶種類為單因素，進行酶解工藝優化，工藝優化固定條件由預試驗的結果確定。

酶解時間的優化：固定酶解溫度為40 ℃、加酶量為3 500 U/g、酶種類為風味蛋白酶，將酶解時間分別設置為2，2.5，3，3.5，4 h進行酶解，測定雞血蛋白的水解度。

酶解溫度的優化：固定酶解時間為3 h、加酶量為3 500 U/g、酶種類為風味蛋白酶，將酶解溫度分別設置為35，40，45，50，55 ℃進行酶解，測定雞血蛋白的水解度。

加酶量的優化：固定酶解時間為3 h、酶解溫度為40 ℃、酶種類為風味蛋白酶，將加酶量分別設置為1 500，2 500，3 500，4 500，5 500 U/g進行酶解，測定雞血蛋白的水解度。

酶種類的優化：固定酶解時間為3 h、加酶量為3 500 U/g、酶解溫度為不同酶的最適推薦溫度（酶活說明推薦的最佳酶解溫度為木瓜蛋白酶50 ℃、堿性蛋白酶55 ℃、風味蛋白酶45 ℃、胰蛋白酶37 ℃、胃蛋白酶37 ℃）、加酶量3 500 U/g（以蛋白計）進行酶解，測定雞血蛋白的水解度。

1.4 響應面試驗酶解工藝優化

在1.3.5試驗的基礎上，確定4個因素的最適范圍，建立四因素三水平的響應面優化試驗。以水解度為指標，優化肉味香精前體物的酶解工藝條件，響應面試驗因素水平見表1。

1.5 酶解工藝模糊數學決策法綜合優選

在響應面試驗優化的基礎上，利用模糊數學決策法綜合優選酶解方案，旨在避免水解度的單一效率分析在整個工業化生產中的局限性，因此，采用能將效率分析和生產工藝相結合進行多因素綜合比較分析的方法，即模糊數學決策法，對最佳酶解工藝范圍進行對比分析，以尋求高效、合理、經濟的肉味香精前體物酶解工藝。

模糊數學決策法的主要步驟如下：

確定酶解工藝選擇比較的單因素集和成本指標，建立水解度的二次多項回歸模型優化酶解工藝，通過響應面回歸模型和方差分析確定影響酶解工藝的關鍵因素，參考生產效率、原料利用率、能耗、原料及設備成本等指標確定各因素的權重值，包括酶解工藝在內的其他各項參數的重要程度有所不同，影響因素也各有差異，而且相互之間并非完全獨立，因此，需確定各因素的權重［19］。用層次分析法確定各因素的權重值，首先依據各因素的隸屬關系建立各自的層次結構模型，見圖1。

每個層次對各因素的含義見表2，1～5表示標度的比較方法，進行綜合性評定，得出模糊判斷矩陣。

對工藝進行模糊優選前，需對各因素指標進行無量綱化，使各因素之間具有可比性。定量指標Xuv通過下式確定：

Xuv=0.1+fvmax－fuvdt，fv為負指標0.1+fuv－fvmindt，fv為正指標。

dt（極差）=fvmax－fvmin1－0.1。

式中：fvmax為v因素指標的最大值；fvmin為v因素指標的最小值；fuv為u方案的v因素指標值。

工藝的選取需要利用數值語言代替選擇語言進行定性指標賦值，對定性指標采用等級評定的方法，按五級賦值標準設計評定值，見圖2。

1.6 數據統計及分析

利用 Microsoft Office Excel 2010對數據進行統計和繪制表格，表3中的數據表示為平均值±標準差；利用Origin 2018b進行作圖，利用響應面軟件Design-Expert 8.0.6進行響應面回歸方差分析、建立二次回歸多項式模型、Contour和3D Surface作圖，利用MatrixUser 2.0進行模糊優選的矩陣計算；所有試驗數據每組測試3次。

2 結果與分析

2.1 雞血理化性質

對屠宰后的雞血及雞血預處理后的蛋白凝聚物組成進行檢測分析，結果見表3。

由表3可知，雞血中主要成分為水分，含量為（81.21±0.14）%，蛋白質含量為（16.53±0.41）%，脂肪含量和無機鹽含量較低，均不足1%；通過預處理得到蛋白凝聚物的蛋白質含量高達（48.65±0.28）%。分析發現雞血最主要的加工資源是蛋白質，以轉運蛋白為主，負責機體的物質轉運和代謝廢物的排出，還有一部分蛋白質具有免疫功能，因此，雞血中蛋白質含量占比較高，還有微量的脂肪和無機鹽。若對雞血進行有效的開發利用，可實現雞血蛋白質的二次利用，充分發揮其附加值，具有經濟和環保效益。研究發現，盡管雞血中蛋白質含量較高，但由于人體消化率很低，不能被人體直接利用，因此，對其開發需充分考慮這一特性。利用蛋白水解酶將雞血蛋白質進行水解，制備雞肉香精前體物，對生產高附加值的肉味香精具有較高的可行性。

2.2 雞血蛋白酶解單因素分析

依據單因素試驗設置酶解時間、酶解溫度、加酶量和酶種類4個單因素，結果見圖3。商業蛋白水解酶成品具有良好的穩定性和較高的特異性，在溫和的溶液體系中具有良好的催化水解作用，能將大分子蛋白水解成多肽和氨基酸，且不會造成溶液體系穩定性的改變，可以在很大程度上保護雞血中其他營養活性成分。酶解時間決定蛋白水解酶和底物的作用時間，酶解時間越長，水解酶與底物的有效反應時間越長，酶解越充分，酶解體系中游離氨基氮質量濃度越高。

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，水解度呈增加趨勢，但在3.5 h后水解度增加變緩，這是因為底物的水解完成后，水解度不會隨酶解時間的延長而增加。蛋白水解酶的最佳活性范圍受溫度的影響最大，酶解溫度較低時參考阿倫尼烏斯公式［20］，酶解體系內分子的運動和擴散速率較小，酶與底物的結合率降低，加之水解酶活性未被完全激發，此時酶解效率較低；此外，酶的催化活性也需要能量的激發，使之充分活化。隨著酶解溫度的升高，體系內分子的運動和擴散速率增加，當達到酶的最適溫度時，酶的活性達到最大值，酶解溫度能夠使分子之間的鍵更容易結合和被破壞。在一定溫度范圍內，隨著溫度的升高，水解度隨之升高，當酶的活性達到最大值時，酶解溫度的繼續升高會使酶的空間結構發生改變，降低酶的活性，水解度反而降低［21］。

加酶量直接影響酶解體系中底物和酶的濃度比，在較短時間內雞血蛋白溶液中酶的濃度越大，酶解速率越快；隨著時間的延長，體系中底物濃度降低，出現酶過剩的現象，因此，酶解速率和酶濃度并非呈線性相關性。本研究選取了5種商業酶，篩選具有較好水解作用的水解酶；單一的5種酶表現出不同的催化活性：堿性蛋白酶（J）＞風味蛋白酶（F）＞胰蛋白酶（Y）＞木瓜蛋白酶（M）＞胃蛋白酶（W）。Yu等［22］發現木瓜蛋白酶可以有效地鈍化反應體系中其余蛋白水解酶，因為木瓜蛋白酶的結構類似于底物的結構，它可以與底物競爭水解酶的活性中心，從而阻礙酶-底物復合物的形成并降低酶解體系中其他酶的活性；胃蛋白酶在pH低于5.0時才具有較高的活性。通過水解度分析得出堿性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶具有較好的活性。

2.3 響應面酶解工藝與模型的構建

建立響應面優化試驗設計，見表4。以水解度作為擬合模型的指標，應用該模型基于二次多項式方程優化酶解條件，通過多組重復性試驗構建二次多項式回歸模型：水解度（%）=+33.25－0.90A+0.14B+0.13C－1.14D－1.01AB+0.084AC－0.084AD－2.07BC－3.00BD+2.03CD－6.26A2－4.11B2－8.90C2－12.61D2。

通過完整的試驗設計矩陣和基于Box-Behnken試驗運行的結果，方差分析結果見表5。

由表5可知，該模型的P值lt;0.000 1，表明該模型具有99.99%的置信區間，具有統計學意義。模型的F值為78.986 2，表明該模型顯著；回歸分析顯示，決定系數R2為0.994 7，表明該模型無法解釋總變量的0.53%；調整后的決定系數RAdj2為0.994 9，表明試驗值和預測值之間有很好的一致性。如果失擬項值較高，則試驗的可靠性較低。在該研究中，已經實現了較低的失擬項值，且P值gt;0.05，不顯著，表明該模型具有很高的可靠性［23］。

對水解度影響最顯著的因素是D酶種類（Plt;0.01），其次是A酶解時間（Plt;0.01），最后是B酶解溫度（Plt;0.05）和C加酶量（Plt;0.05）。AB、AD、BD、AC、BC、CD的交互作用的P值均lt;0.05，說明酶解時間、酶解溫度、加酶量和酶種類兩兩交互對水解度均有顯著影響［24］。

為了進一步了解4個變量對水解度的影響，建立了3D響應面圖和等高線圖，見圖4～圖9。響應面圖有助于揭示兩個變量及其最佳范圍之間的相互作用，在3D響應面圖中，曲線越陡峭、弧度越明顯，表明該因素對水解度的影響越顯著。控制任意兩個自變量不變，其余兩個因素的交互作用對響應值水解度的影響從等高線圖中也能體現，等高線圖能反映出兩因素交互作用的顯著程度，等高線圖中橢圓圖形越扁、離心率越大表示交互作用越顯著，越接近圓形、離心率越小表示交互作用越不顯著［25］。

2.4 酶解工藝模糊決策法優選

依據二次多項式回歸模型利用響應面法優化出50種酶解工藝，優化工藝的可信度皆接近于1，按照水解度的大小排序選取前20種進行模糊決策法優選，見表6。根據1.5所介紹的模糊綜合評判步驟、原理和方法，結合響應面法優化最佳酶解工藝進行模糊決策法優選矩陣R的計算。

參考模糊數學決策法的綜合評判步驟和原理，通過對各因素指標判斷矩陣的無量綱化結合賦值等級評定標準，確定各因素的權重值C=（0.32，0.14，0.24，0.30）。

根據模糊數學決策法的矩陣變換原理K=C×F，C指B1、B2、B3、B4 4個因素所占的權重集（0.32，0.14，0.24，0.30），即生產工藝選取時決策的參考度；F指該工藝在層次結構模型中C1～C6的賦值評定分數，得到模糊矩陣F1～F20，則對第i號樣品評定結果為Ki=C×Fi。第1～20組樣品的綜合評定結果如下所示：

Ki=C×Fi=（0.32，0.14，0.24，0.30）×0.60.30.5… 0.30.40.70.20.70.9… 0.250.40.6。

其中，K1=0.414、K20=0.395表示通過模糊決策法矩陣變換后所得到的工藝1和20的分數；同理可得其他工藝的模糊優選結果，K2=0.345、K3=0.478、K4=0.489、K5=0.327、K6=0.534、K7=0.435、K8=0.512、K9=0.534、K10=0.437、K11=0.697、K12=0.423、K13=0.578、K14=0.345、K15=0.484、K16=0.574、K17=0.611、K18=0.352、K19=0.601、K20=0.395。根據最大隸屬度原則，分析發現K11組在進行模糊優選時獲得最高分數。

2.5 最佳工藝條件的檢驗

通過模糊優選得出酶解時間為3 h、酶解溫度為41.35 ℃、加酶量為3 605 U/g和酶種類為胰蛋白酶（Y），由于胰蛋白酶的最適酶解溫度為37 ℃，因此，在酶解時間為3 h、酶解溫度為37 ℃、加酶量為3 605 U/g和酶種類為胰蛋白酶（Y）的條件下進行酶解效果、生產工藝和成本的評估。結果表明，在此條件下水解度為26.35%、K修正為0.713，雖然酶解速率降低，但應用在實際生產過程中能避免能耗和原料成本的浪費，實際生產指標良好。

3 結論

本研究利用模糊數學決策法綜合優選雞血制備雞肉香精前體物的最佳工藝，旨在改善試驗條件下的工藝參數在實際生產過程中的適應性。通過優選得出生產效率、原料利用率、原料及設備成本、能耗的權重分別為0.32，0.14，0.24，0.30，得到各因素的重要性。在對雞血組分和不同酶組合分析的基礎上，利用響應面法構建酶解時間、酶解溫度、加酶量和酶種類的回歸模型，得出酶種類是影響酶解工藝最重要的因素，其次是酶解時間、酶解溫度和加酶量。通過多元二次回歸模型優化酶解工藝，結合模糊數學決策法綜合優選，得到最佳酶解工藝為酶解時間3 h、酶解溫度37 ℃、加酶量3 605 U/g和酶種類胰蛋白酶（Y）。此工藝下生產效率、原料利用率、原料及設備成本、能耗的權重分值為0.713分，得到的酶解工藝參數真實可靠。

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