基于化學計量學和COX-2抑制活性篩選紅樹共生放線菌中防治藥源性聽力損失成分

摘要：目的 利用代謝組學技術和藥源性聾細胞模型尋找紅樹共生放線菌鏈霉菌屬Streptomyces sp.（No. 1624117）代謝產物中防治藥源性聽力損失成分。方法 從菌株粗提物中篩選具有抗炎活性的極性分段樣，采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS）對菌株粗提物和活性分段樣的化學成分進行數據采集；通過主成分分析法（PCA）與正交偏最小二乘法-判別分析法（OPLS-DA）進行多元統計學分析，篩選差異成分；經過柱層析和高效液相色譜（HPLC）定點分離目標差異點，利用核磁和質譜鑒定結構；最后通過順鉑誘導的HEI-OC1細胞損傷模型考察化合物對耳蝸毛細胞的保護作用。結果 代謝組學分析有38個差異代謝物，結合抗炎活性測定結果，分離純化出6個化學成分并確定了結構。在順鉑誘導的HEI-OC1細胞損傷模型中，化合物1，2，3，4和6均顯示出對耳蝸毛細胞具有保護作用。結論 本研究建立了一種基于代謝組學技術挖掘放線菌代謝產物中防治藥源性聽力損失成分的方法，為尋找防治聽力損失活性化合物提供了新途徑。

關鍵詞：共生放線菌；液相色譜-質譜聯用；代謝組學；炎癥；藥源性聽力損失

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Screening of components from a mangrove symbiotic actinomycete against drug-induced hearing loss based on chemometrics and COX-2 inhibition activity

Xiao Suping1， Qian Jinhua2， Wen Dingsheng1， Xu Yuan1， Chen Gang3， Zhang Ming2， and Wen Lu1

（1 School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006; 2 Guangdong Sunho Pharmaceutical Co.， Ltd.， Zhongshan 528437; 3 Center for Drug Research and Development， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006）

Abstract Objective Metabolomics technology and a drug-induced cell injury model of hearing loss were used to screen the metabolites of the mangrove-derived actinomycete Streptomyces sp. （no. 1624117）. Methods Polar segmental samples with anti-inflammatory activity were screened from the crude extract of strain 1624117， and collected by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS）. The metabolic profiles and chemical compositions were clustered differently by multivariate statistical techniques such as principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares-discriminant analysis （OPLS-DA）， and their differential chemical compositions were explored. The target compounds were isolated by column chromatography and semi-preparative HPLC， identified by nuclear magnetic resonance and mass spectrometry. Finally， a cisplatin induced HEI-OC1 cell injury model was used to investigate the protective effect of the compounds on cochlear hair cells. Results The UPLC characteristic spectrum of Streptomyces sp. （no. 1624117） was established to identify 38 differential markers， respectively. Six compounds were identified based on the results of their anti-inflammatory activity， and their structures were determined. In the cisplatin induced HEI-OC1 cell injury model， all compounds showed protective effects on cochlear hair cells except compound 5. Conclusion In this study， a metabolomic method was established to mine drug-induced hearing loss components from actinomycetes metabolites， which provided a new way to search for active compounds for the prevention and treatment of hearing loss.

Key words Symbiotic actinomycetes; Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Metabolomics; Inflammation; Drug-induced hearing loss

聽力損失（亦稱“耳聾”）是目前世界上最普遍的感覺障礙之一。耳毒性藥物、噪聲、感染性疾病、衰老或先天遺傳等都會導致聽力損失，其中因藥物毒性作用致聾者約占總數的1/3，因此藥物的耳毒性越來越多地受到醫學界的關注[1]。哺乳動物的內耳是一種高度專業化的感覺器官，毛細胞是內耳中重要的功能細胞，在正常情況下能將聲音產生的機械信號轉換為電信號并經聽覺神經傳遞到中樞， 從而產生聽覺。耳毒性藥物會導致聽覺毛細胞的損傷，并且毛細胞無法自發修復或再生，最終導致不可逆的聽力損失[2]。順鉑是臨床常見的化療藥物，對腫瘤患者具有良好的治療效果，但同時會造成嚴重的聽力損失。2022年，美國FDA批準了第一個也是迄今為止唯一一個藥品——硫代硫酸鈉作為順鉑誘導聽力損失的治療劑[3]。因此，針對藥源性耳聾的機制研究和內耳保護藥物的探索具有重要的臨床意義。

研究表明，耳蝸炎癥是順鉑導致永久性聽力損失的重要因素[4]。炎癥可導致微血管損傷和動脈粥樣硬化造成缺血，且循環的炎癥因子對耳蝸脈管系統有害，在耳蝸中供血的是單一微血管迷路動脈，減少順鉑誘導的炎癥能有效防治聽力損失[5]。環氧合酶-2（COX-2）是參與炎癥過程的一種重要酶，也是催化花生四烯酸合成前列腺素的關鍵限速酶[6]。研究表明，順鉑會增加COX-2在耳蝸中表達和轉錄激活因子1（STAT1）下游靶點的水平，促使耳蝸毛細胞凋亡從而誘發聽力損失，抑制COX-2可有效減少毛細胞凋亡[7]。因此，以抑制COX-2活性為切入點有望成為挖掘防治藥源性聽力損失活性成分的有效途徑。

紅樹林是生長在熱帶和亞熱帶地區陸地和海洋過渡帶的一種耐鹽植物。位于南海海岸的湛江市有著我國紅樹林面積最大的自然保護區，蘊藏著多種生物資源。為適應高溫、高鹽、低氧和強光照的特殊生境帶來的巨大壓力，紅樹林形成了復雜而獨特的生態系統，并創造出極為豐富又極具特色的微生物資源[8]。紅樹共生放線菌具有代謝途徑獨特的優勢，能夠產生結構新穎，活性多樣的次級代謝產物，已從中發現大量抗炎活性成分，揭示了我國南海紅樹共生放線菌具有極大的藥用開發前景[9-10]。本研究通過COX-2抑制劑篩選實驗，從紅樹共生放線菌鏈霉菌屬Streptomyces sp.（no. 1624117）次級代謝產物中篩選有抗炎活性的極性分段樣；利用代謝組學技術包括主成分分析（principal component analysis， PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis， OPLS-DA），從7個抗炎活性分段樣代謝輪廓的偏移找出放線菌1624117的差異點；進而通過柱層析和制備HPLC定點分離獲得6個化合物，結合核磁共振（NMR）和電噴霧電離質譜（ESI-MS）確定了所有化合物的結構；通過順鉑誘導的HEI-OC1細胞損傷模型測定6個化合物防治藥源性聽力損失活性，驗證了方法的可靠性，為基于代謝組學手段尋找新型防治藥源性聾天然產物提供了新思路。

1 材料和儀器

1.1 試劑

色譜純甲醇（美國Merck公司）；柱層析硅膠（200-300目，青島海洋化工有限公司）；塞來昔布（美國Sigma公司）；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，美國Sigma公司）；順鉑（CDDP，美國Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四唑溴化銨（MTT，美國Sigma公司）；高糖DMEM培養基（美國Thermo公司）；胎牛血清（FBS，美國Thermo公司）；COX-2抑制劑篩選試劑盒（美國Cayman Chemical公司）；UPLC-MS所用試劑為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

ACQUITY超高效液相色譜串聯質譜儀（美國Waters公司）；LC-10A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Bruker 500 MHz核磁共振儀（德國Bruker公司）；LCQ-DECA-XP質譜儀（美國Thermo公司）；FC酶標儀（美國Thermo公司）；RE-52旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；TOP-870數控超凈工作臺（廣潔凈化設備有限公司）；TCYQ搖床（太倉市實驗設備廠）；YM75立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海三申醫療器械設備有限公司）。

1.3 培養基

改良高氏1號培養基：可溶性淀粉20.0 g/L、KNO3 1.0 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，瓊脂

20 g/L，pH 7.2。用于放線菌的保藏。

ISP2培養基：酵母提取物4.0 g/L、麥芽提取物10.0 g/L、葡萄糖4.0 g/L，現配現用，蒸餾水定容至

1 L。用于放線菌種子培養及發酵。

1.4 菌株來源

放線菌1624117分離自廣東省湛江市紅樹林國家級自然保護區的Phasolosma esculenta樣品，經上海美吉生物醫藥科技有限公司采用16S rRNA基因序列鑒定，該菌株確定為鏈霉菌屬（Streptomyces sp.），由改良高氏1號培養基保藏在廣東藥科大學藥學院。

2 方法

2.1 菌株發酵及次級代謝產物的提取

從改良高氏1號培養基挑取菌株1624117接種到含100 mL ISP2液體培養基的250 mL搖瓶中，

28 ℃、200 r/min培養3 d，取5 mL種子液轉接到

200 mL ISP2液體培養基的500 mL搖瓶中，于28 ℃、200 r/min發酵14 d，共發酵100 L。發酵液在55 ℃水浴中濃縮，3500 r/min離心20 min得濃縮液。濃縮液用兩倍體積乙酸乙酯萃取3次后，減壓濃縮合并萃取液得到36 g粗提物。粗提物依次使用石油醚/乙酸乙酯（90：10，70：30，50：50，30：70，0：100，V/V），乙酸乙酯/甲醇（50：50，0：100，V/V）進行硅膠色譜層析分離，得到極性分段樣1～12。

2.2 抑制COX-2活性的測定

精密稱取凍干的粗提物及極性分段樣各5 mg，加1 mL DMSO溶解配成母液，加入PBS制成20 mg/mL

溶液，即得樣品。按照COX-2抑制劑篩選試劑盒說明對樣品進行活性篩選，設置空白組、陽性對照組和樣品組，每組設置復孔3個，塞來昔布為陽性對照，具體操作嚴格按照產品說明書進行，使用酶標儀在405 nm處讀取吸光度（A值），并計算每個樣品的抑制率。

抑制率（%）=（X100%酶活性對照－X樣品組）/（X100%酶活性對照－X空白組）。

2.3 UPLC-MS指紋圖譜的建立

精密稱取放線菌1624117極性分段樣凍干粉適量，加甲醇溶解，配制成濃度為20 mg/mL的溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。電噴霧離子源（ESI），采用正負離子模式掃描，數據采集范圍m/z 100～1000。參數如下：毛細管電壓，3 kV；取樣錐孔電壓，30 V；離子源溫度，100 ℃；脫溶劑氣溫度，350 ℃；霧化氣（N2）流速，60 L/h；脫溶劑氣（N2）流速，600 L/h；碰撞能量（CE），10～40 eV。

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×

2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸溶液（A）和甲醇（B）。梯度洗脫程序：0～3.8 min，10% B；3.8～

21.8 min，10%～90% B；21.8～25.8 min，90%～100% B；25.8～26.8 min，100% B；流速：0.208 mL/min。進樣量5 μL，柱溫箱30 ℃。

2.4 數據處理與分析

將UPLC-MS采集的質譜原始數據導入MassLynx V4.1中進行數據基線過濾和校準、峰提取、峰校準、峰識別和歸一化等一系列數據預處理，得到包括質荷比m/z、保留時間和峰面積等信息的數據矩陣，然后將數據導入SIMCAP 14.1（Umetrics，瑞典）進行多維建模分析。無監督的PCA對各組的總體代謝分布情況進行考察，有監督的OPLS-DA進一步篩選組間差異較大的生物標志物。依據變量對分組貢獻得分（VIPgt;1）和組間變化的差異檢驗（t檢驗）顯著性（Plt;0.05）為差異性代謝產物的篩選標準[11]。

2.5 目標化合物的分離與鑒定

PCA和OPLS-DA分析所得差異代謝物，結合極性分段樣抗炎活性結果，確定目標化合物。根據目標離子的保留時間和質荷比，運用柱色譜層析和半制備HPLC對目標化合物進行定點分離，利用NMR和ESI-MS進行結構鑒定。

2.6 化合物對CDDP誘導的HEI-OC1細胞損傷模型的保護作用

HEI-OC1細胞是從小鼠耳蝸中分離并構建的永生化毛細胞，可特異性表達耳蝸毛細胞的經典標志物，是一種用于篩選藥物潛在耳毒性或耳保護特性的體外系統[12]。參考課題組前期建立的方法[13]，

在96孔板中分別設置對照組、模型組（40 μmol/L CDDP）、陽性藥組（1 mmol/L NAC）、待測組（濃度分別為10，20和40 μmol/L）、空白組（DMSO）。取生長狀態良好的對數生長期HEI-OC1細胞制成懸液，以1×105 /mL的濃度在96孔板每孔加入100 μL，孵育12 h。分別于每孔加入100 μL高糖DMEM培養基（對照組和模型組），100 μL NAC（陽性藥組）或100 μL目標化合物（待測組），預處理1 h后，空白組加入100 μL

高糖DMEM培養基，其他組加入100 μL CDDP，共孵育24 h后棄去藥液，再向每孔加入100 μL MTT

（0.5 mg/mL）繼續孵育4 h。棄去MTT，每孔加入

100 μL DMSO，將96孔板置于37 ℃恒溫振蕩箱中，以100 r/min的速度振搖10 min后使用酶標儀在490 nm處讀取A值，將對照組平均A值視為存活率100%，A值越大說明化合物的細胞保護作用越強。使用Origin軟件進行數據統計分析，組間比較采用單因素方差分析。Plt;0.05被認為有顯著性差異。

3 結果

3.1 放線菌1624117粗提物及其分段樣對COX-2活性的抑制作用

放線菌1624117粗提物（A0）利用硅膠柱層析分離得到12個分段樣，極性從小到大編號為A1、A2、A3、B4、B5、B6、C7、C8、D9、D10、D11和E12。COX-2抑制劑篩選試劑盒活性測定結果顯示，放線菌1624117粗提物的COX-2抑制率為92.75%，各分段樣的活性有明顯差異，樣品A2（68.01%）和C7（67.11%）抑制率較大，樣品B4（26.98%），B5（20.03%），C8（23.86%）和D9（8.04%）抑制率較小（圖1）。

3.2 放線菌1624117粗提物UPLC-MS結果

采用UPLC-Q-TOF-MS對放線菌1624117粗提物進行檢測，正、負離子模式下的總離子流色譜圖（TIC）見圖2。從圖中可以看出各組樣本代謝輪廓存在明顯差異，正離子模式下響應值較高。低極性成分較多，主要集中在保留時間16.0～26.7 min。

3.3 PCA和OPLS-DA分析

選取高活性的放線菌1624117粗提物（編號定為XY-1）以及活性差異大的6個分段樣，包括高活性A2和C7，低活性B4、B5、C8和D9作為測試樣品（編號為XY-2～XY-7），每個樣品隨機采集2次數據，剔除1個無效數據，實際參與分析的數據量為13個。因UPLC-MS結果中正離子模式下響應值較高，故僅考察正離子模式下的模型。將MassLynx V4.1處理后的數據導入SIMCA-P 14.1軟件，對數據進行Log transform和UV scaling處理，然后進行自動建模分析。使用無監督的PCA評估樣本的分類趨勢和組間差異，可看出參與分析的樣本全部處于95%橢圓形置信區內，無異常數據點；同組間兩個樣本點距離較近，不同組間分布有明顯的分離趨勢，說明所含化學成分存在一定差異（圖3）。此外，當模型概括X矩陣解釋率R2Xgt;0.4時說明該模型可靠，本實驗中生成的PCA模型的質量參數R2X=0.778，因此所建立的模型可以很好地解釋各組間差異。

PCA多用于考察樣本之間相關性，還需要應用有監督的OPLS-DA進一步進行二維數據分析，可以通過正交化篩選數據信息中與類別信息無關的數據，去除PCA中無關的差異信息，從而更加精準地篩選出各類樣本的特征變量[14]。OPLS-DA分析以變量重要性為依據進行差異代謝物篩選，更能把握多位數據整體特征和變異規律[15]。如圖4A所示，在95%置信區間內，OPLS-DA模型顯示的可接受值為R2X（0.782）、R2Y（0.971）和Q2（0.965），高活性樣本組XY-1、XY-2和XY-5落在右側t[1]值較大且為正數的區域，低活性樣本組XY-3、XY-4、XY-6和XY-7則落在坐標軸左側，提示該模型對組間樣本有良好的區分度，各分段樣的次級代謝產物存在差異。為防止模型過擬合，采用7次循環交互驗證和200次響應排序檢驗（response permutation testing，RPT）的方法來考察模型的質量。由七次循環交互驗證的方差分析可知P= 3.951×10-4lt;

0.01，達顯著水平，說明該模型充分提取了不同樣本間的差異信息，預測性能力強。RPT是一種用來評價OPLS模型準確性的隨機排序方法，用來避免監督性學習方法獲得分類不是偶然的。建立對應的OPLS-DA模型以獲取隨機模型的R2和Q2值，與原模型的R2Y、Q2Y進行線性回歸，得到的回歸直線與y軸的截距值分別為R2和Q2，如圖4B所示，R2Y和Q2Y直線的斜率均大于0，不存在過度擬合，模型穩健性良好，可用于組間代謝物的差異分析。

3.4 差異代謝物分析

為進一步分析具體的差異物質，采用載荷圖（loading圖）和S型曲線圖（S-plot）標識差異代謝物。在載荷圖（圖5A）中，接近于-0.1或0.1的載荷表明變量對分組影響越強，紅色點代表的物質對分組影響較強，藍色點代表的物質對分組的影響很弱。S型曲線圖（圖5B）中，數據點離原點越遠，則該變量對樣本分組差異的貢獻越大，因此，越靠近右上角和左下角的代謝物（紅色點）表示其差異越顯著，是組間差異標志物。OPLS-DA分析中，變量權重值VIP可用來衡量各代謝物的表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，VIP越大，說明該變量對分組的貢獻越大，從而挖掘具有生物意義的差異代謝物。每個樣本對OPLS-DA模型的貢獻都按VIP進行排序，以VIPgt;2.5為閾值進行篩選，共得到38個差異變量。

3.5 目標化合物的分離與鑒定

結合各極性分段樣的COX-2抑制活性測定結果，對38個差異變量進行分析篩選，從中尋找出高活性極性分段樣與低極性分段樣高含量差異代謝物，最終確定6個化學成分，依次對應色譜峰保留時間為9.12，16.29，20.36，21.56，23.08和26.75 min，

這些成分是放線菌1624117次級代謝產物中具有COX-2抑制活性的極性分段樣中主要標志性成分。極性分段樣先經柱色譜分離，再使用Ultimate C18制備色譜柱（250 mm×10.0 mm，10 μm）上HPLC純化，最后通過NMR和ESI-MS測定，與文獻對照后確定結構[16-21]，結果見表1。

化合物1：白色晶體，ESI-MS m/z：211.2 [M+H]+，分子式為C11H18O2N2。1H NMR （500 MHz， CDCl3） δH： 6.80 （1H， s， NH）， 4.07 （1H， t， J=8.0 Hz， H-6）， 3.96 （1H， dd， J=4.0， 12.0 Hz， H-9）， 3.55 （1H， m， H-3a）， 3.49 （1H， m， H-3b）， 2.29 （1H， m， H-5a）， 2.07 （1H， m， H-5b）， 2.00 （1H， m， H-10）， 1.95 （2H， m， H-4a， 4b）， 1.49 （1H， m， H-11a）， 0.95 （3H， d， J=4.0 Hz， H-12）， 0.91 （3H， m， H-13）。13C NMR （125 MHz， CDCl3） δC： 170.7 （C-1）， 165.2 （C-7）， 60.6 （C-6）， 58.8 （C-9）， 45.1 （C-3）， 35.4 （C-11）， 29.6 （C-5）， 24.0 （C-10）， 22.4 （C-4）， 15.7 （C-12）， 12.1 （C-13）。

化合物2：無色晶體，ESI-MS m/z：165.1 [M-H]-，分子式為C9H10O3。1H NMR （500 MHz， CD3OD-d4） δH： 7.20 （5H， m， Ar-H）， 4.33 （1H， dd， J=4.0， 8.0 Hz， H-2）， 3.10 （1H， dd， J=4.0， 12.0 Hz， H-3）， 2.90 （1H， dd， J=8.0， 12.0 Hz， H-3）。13C NMR （125 MHz， CD3OD-d4） δC： 177.2 （C-1）， 138.9 （C-1'）， 130.6 （C-2'， 6'）， 129.2 （C-3'， 5'）， 127.5 （C-4'）， 72.8 （C-2）， 41.6 （C-3）。

化合物3：白色晶體，ESI-MS m/z 271.1 [M+H]+，293.1 [M+Na]+，分子式為C15H10O5。1H NMR （500 MHz， CD3OD-d4） δH： 8.05 （1H， s， H-2）， 7.37 （2H， d， J=8.0 Hz， H-2'， 6'）， 6.85 （2H， d， J=8.0 Hz， H-3'， 5'）， 6.35 （1H， d， J=4.0 Hz， H-8）， 6.23 （1H， d， J=4.0 Hz， H-6）。13C NMR （125 MHz， CD3OD-d4） δC： 154.8 （C-2）， 123.3 （C-3）， 182.3 （C-4）， 163.9 （C-5）， 100.1 （C-6）， 166.0 （C-7）， 94.8 （C-8）， 158.8 （C-9）， 106.3 （C-10）， 124.8 （C-1'）， 131.4 （C-2'， 6'）， 116.3 （C-3'， 5'）， 159.7 （C-4'）。

化合物4：白色固體，ESI-MS m/z：255，[M+H] +，

分子式為C16H30O2。1H NMR （500 MHz， CDCl3） δH： 3.59 （1H， m， H-4）， 2.34 （2H， t， J=8.0 Hz， H-1）， 1.63 （2H， m）， 1.43 （4H， s）， 1.30 （18H， m）， 0.88 （3H， t， J=8.0 Hz）。13C NMR （125 MHz， CDCl3） δC： 178.5 （C-2）， 72.2 （C-1）， 37.6 （C-4）， 34.0 （CH2）， 32.0 （CH2）， 29.7 （CH2）， 29.5 （CH2）， 29.3 （2CH2）， 29.1 （2CH2）， 25.8 （CH2）， 25.7 （CH2）， 24.8 （CH2）， 22.8 （CH2）， 14.2 （CH3）。

化合物5：白色固體，EI-MS m/z：256[M] +，分子式為C16H32O2。1H NMR （500 MHz， CDCl3） δH： 2.34 （2H， t， J=8.0 Hz， H-2）， 1.63 （2H， m， H-3）， 1.25 （24H， m， H-4～15）， 0.88 （3H， t， J=8.0 Hz， H-16）。13C NMR （125 MHz， CDCl3） δC： 179.4 （C-1）， 34.1 （C-2）， 32.1 （C-3）， 29.8 （C-4～8）， 29.7 （C-9）， 29.6 （C-10）， 29.5 （C-11）， 29.4 （C-12）， 29.2 （C-13）， 24.8 （C-14）， 22.8 （C-15）， 14.3 （C-16）。

化合物6：白色固體，ESI-MS m/z：243[M-H]-，分子式為C14H28O3。1H NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 3.96 （1H， m， H-3）， 2.44 （1H， dd， J=8.0， 4.0 Hz， H-2a）， 2.36 （1H， dd， J=8.0， 4.0 Hz， H-2b）， 1.47 （2H， s， H-4）， 1.30 （18H， s， H-5～13）， 0.90 （3H， t， J=8.0 Hz， H-14）。13C NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 175.8 （C-1）， 69.6 （C-3）， 43.7 （C-2）， 38.1 （C-4）， 33.1 （C-5）， 30.8 （C-6）， 30.7 （C-7～9）， 30.5 （C-10）， 26.7 （C-11， 12）， 23.7 （C-13）， 14.4 （C-14）。

3.6 化合物對順鉑誘導的HEI-OC1細胞損傷模型的保護作用

在順鉑誘導的HEI-OC1細胞損傷模型中，與模型組相比，化合物1，2，3，4和6分別在40，40，10，10和10 μmol/L使細胞存活率顯著提高（Plt;0.05），化合物3在較高濃度（40 μmol/L）時可能會產生一定的細胞毒性。因此，通過COX-2抑制活性篩選所得化合物，也能夠有效減輕順鉑引起的耳蝸毛細胞損傷（圖7）。

4 討論

本研究利用COX-2抑制活性實驗篩選放線菌1624117粗提物中有效的極性分段樣，并建立UPLC-MS總離子流色譜圖，結合PCA和OPLS-DA分析確定差異代謝物，通過定點識別與分離，從放線菌1624117粗提物中獲得6個化合物，并通過NMR和ESI-MS進行了結構鑒定。首次發現化合物1，2，3，4和6對順鉑誘導的HEI-OC1細胞損傷有保護作用，具有潛在的防治順鉑耳毒性效果。

炎癥和氧化應激是順鉑耳毒性的兩個主要機制[22]。順鉑產生炎癥導致聽力損失的過程是通過調節多種炎癥因子的表達來實現[23]。已有的研究表明所得6個化合物中，化合物1為環二肽類化合物，具有兩個氫供體和氫受體，表現出較高的與酶或蛋白質結合的潛力[24]。化合物2為芳香烴衍生物，通過下調促炎細胞因子水平發揮消除炎癥的作用[25]。化合物3屬于異黃酮類化合物，已發現可以恢復抗氧化酶活性[26]，并通過抑制炎癥因子TNF-α分泌來減輕炎癥[27]，推測化合物3通過抗氧化減少順鉑誘導產生的活性氧自由基，抑制TNF-α等兩種以上的途徑實現防治藥源性聽力損失。此外，研究表明G蛋白耦聯受體在耳保護中起著重要作用[28]，化合物6為羥基脂肪酸類化合物，可能通過激活G蛋白耦聯受體發揮生物活性[29]。化合物4是內酯類化合物，在細胞內容易被水解成羥基脂肪酸[30]，轉化為和6同類型化合物。化合物5也是脂肪酸類化合物但沒有活性，結合化合物6的結構特點，推測脂肪酸結構中羧基旁羥基的存在對活性起到重要作用。

參 考 文 獻

World Health Organization. Deafness and hearing loss. 2021.[EB/OL]. https：//www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss.

陳小祝. 載中藥成分納米制劑對順鉑所致耳聾的防治及其機制研究[D]. 廣州： 廣東藥科大學， 2020.

Freyer D R， Brock P R， Chang K W， et al. Prevention of cisplatin-induced ototoxicity in children and adolescents with cancer： A clinical practice guideline[J]. Lancet Child Adolesc Health， 2020， 4（2）：141-150.

Gentilin E， Simoni E， Candito M， et al. Cisplatin-induced ototoxicity： Updates on molecular targets[J]. Trends Mol Med， 2019， 25（12）： 1123-1132.

陸翼年， 雍軍， 劉志連. 炎癥、免疫和代謝因素與突發性聾預后的相關性及其生物學機制[J]. 聽力學及言語疾病雜志， 2022， 30（6）： 666-670.

Abdel-Lateff A， Alarif W M， Algandaby M M， et al. Euryops arabicus displays anti-inflammatory activities in experimental models[J]. J Ethnopharmacol， 2020， 247： 112278.

Sun Y， Yu J， Lin X， et al. Inhibition of cyclooxygenase-2 by NS398 attenuates noise-induced hearing loss in mice[J]. Sci Rep， 2016， 6： 22573.

Chen S H， Cai R L， Liu Z M， et al. Secondary metabolites from mangrove-associated fungi： Source， chemistry and bioactivities[J]. Nat Prod Rep， 2022， 39（3）： 560-595.

李俊杰， 林曼佳， 陳海明， 等. 湛江雷州沿海紅樹林放線菌的多樣性、新穎性及其抗腫瘤活性[J]. 農業生物技術學報， 2023， 31（10）： 2176-2189.

Xie C L， Niu S， Xia J M， et al. Saccharopolytide A， a new cyclic tetrapeptide with rare 4-hydroxy-proline moieties from the deep-sea derived actinomycete Saccharopolyspora cebuensis MCCC 1A09850[J]. Nat Prod Res， 2018， 32（14）： 1627-1631.

Trygg J， Wold S. Orthogonal projections to latent structures （O-PLS）[J]. J Chemometr， 2002， 16：119-128.

Kalinec G， Thein P， Park C， et al. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity[J]. Hear Res， 2016， 33： 105-117.

Chen X Z， Zhang H， Wang C， et al. Curcumin-encapsulated chitosan-coated nanoformulation as an improved otoprotective strategy for ototoxic hearing loss[J]. Mol Pharm， 2022， 19（7）： 2217-2230.

Chen J， Wu F N， Wang H C， et al. Identification of key taste components in Baccaurea ramiflora Lour. fruit using non-targeted metabolomics[J]. Food Sci Hum Well， 2023， 12（1）： 94-101.

李麗， 張英秀， 趙日雜， 等. 基于GC-MS代謝組學的云南紫菀和臭蚤草的多元統計分析及抑菌活性研究[J]. 藥學學報， 2021， 56（11）： 3118-3129.

Ren S， Ma W， Xu T， et al. Two novel alkaloids from the south China sea marine sponge Dysidea sp.[J]. J Antibiot， 2010， 63（12）： 699-701.

Kitamura Y， Nishimi S， Miura H. Phenyllactic acid in Duboisia leichhardtii root cultures by feeding of phenyl [1-14C] alanine[J]. Phytochemistry， 1993， 34（2）： 425-427.

楊曉軍. 一株耐酸鏈霉菌菌絲體化學成分的研究[J]. 第二軍醫大學學報， 2011， 32（5）： 477-481.

Torrenegra R， Pedrozo J A， Robles J， et al. ε-palmitolactone from Ageratina viscosa[J]. Phytochemistry， 1990， 29（1）： 305-306.

Matsuyama K， Ikunaka M. A practical enantioselective synthesis of （S）-3-hydroxytetradecanoic acid[J]. Tetrahedron， 1999， 10（15）： 2945-2950.

Couperus P A， Clague A D H， Van Dongen J. Carbon-13 chemical shifts of some model carboxylic acids and esters[J]. Magn Reson Chem， 1978， 11（12）： 590-597.

Ye R Q， Sun L F， Peng J H， et al. Design， synthesis， and biological evaluation of dexamethasone-salvianolic acid B conjugates and nanodrug delivery against cisplatin-induced hearing loss[J]. J Med Chem， 2021， 64（6）： 3115-3130.

Sheth S， Sheehan K， Dhukhwa A， et al. Oral administration of caffeine exacerbates cisplatin-induced hearing loss[J]. Sci Rep， 2019， 9（1）： 9571.

魏貴香. 環二肽的研究進展[J]. 當代化工， 2020， 49（2）： 406-409.

Zhou Q Q， Gu R C， Xue B Y， et al. Phenyl lactic acid alleviates Samonella typhimurium-induced colitis via regulating microbiota composition， SCFA production and inflammatory responses[J]. Food Funct， 2021， 12（12）： 5591-5606.

Pérez-Torres I， Castrejón-Téllez V， Soto M E， et al. Oxidative stress， plant natural antioxidants， and obesity[J]. Int J Mol Sci， 2021， 22（4）： 1786.

Behloul N， Wu G Z. Genistein： a promising therapeutic agent for obesity and diabetes treatment[J]. Eur J Pharmacol， 2013， 698（1-3）： 31-38.

Yin H Y， Zhang H， Kong Y H， et al. Apelin protects auditory cells from cisplatin-induced toxicity in vitro by inhibiting ROS and apoptosis[J]. Neurosci Lett， 2020， 728： 134948.

Bourboula A， Limnios D， Kokotou M G， et al. Enantioselective organocatalysis-based synthesis of 3-hydroxy fatty acids and fatty γ-lactones[J]. Molecules， 2019， 24（11）： 2081.

桑明敏， 熊友香， 方劍文. 羧酸酯酶對酯類藥物代謝與腸道毒性的影響[J]. 浙江創傷外科， 2023， 28（3）： 596-598.