植物分子標記高通量快速檢測技術的研究進展

摘要：分子標記是DNA水平遺傳變異的直接反映，被廣泛應用于分子育種、物種多樣性分析及親緣關系鑒定、雜種優勢分析等研究。以高通量植物樣本采集、高通量提取植物基因組DNA以及高通量快速檢測技術這三大關鍵環節為主，全面梳理分子標記檢測的完整流程，并深入剖析當前各個環節的現狀與挑戰。同時，對植物分子標記的高通量快速檢測過程進行了歸納與展望，旨在為未來檢測流程的優化與創新提供有力的理論支撐，推動相關技術的不斷進步與完善。

關鍵詞：分子標記；高通量；SNP；KASP

Research Progress on High-Throughput Rapid Detection

Technology for Plant Molecular Markers

WANG Pan

（Shanghai ZKW Molecular Breeding Technology Co.，Ltd.，Shanghai 200030）

全球種業的發展經歷了原始育種、雜交育種、分子育種3個時代，正在邁向更為前沿的4.0智能育種時代[1-3]。從當前的育種形勢可以看出，一些大型的跨國種子公司和國外規模較大的實驗室已較早地進入種業4.0時代。相較之下，我國種業尚處在從雜交選育為主導，逐步融入分子技術輔助選育的2.0到3.0過渡階段[4]。在分子標記的輔助下，育種工作者可實現高密度遺傳圖譜的構建、QTL定位與主效基因的挖掘、物種進化分析及親緣關系鑒定、作物種群劃分、雜種優勢分析及分子育種等研究。

遺傳標記是在遺傳分析上能反映遺傳多樣性并用作標記的基因，能表述出生物的某一獨特特征，更能將生物性狀具象化。從技術水平上看，遺傳標記可被細致地劃分為形態學標記、細胞學標記、生物化學標記以及分子標記等類型[5]。分子標記自出現以來，具有數量多、檢測周期短、可高通量檢測和對環境影響小等諸多優勢[6]。這些特點使得分子標記在育種工作中得到了迅猛的發展，為遺傳研究帶來了革命性的變革。分子標記短時間內迅猛發展，類型可達數十種，根據檢測原理和染色體特性的不同，分子標記可進一步細分為多種類型，例如基于限制性內切酶和PCR技術的分子標記有RFLP、AFLP和CAPS；基于PCR技術和分子電泳的分子標記則有RAPD、SSR、ISSR和SRAP等；而基于高通量測序或芯片雜交的分子標記技術則包括SNP，這些分子標記為遺傳分析和育種工作提供了強有力的工具

支持[7]。

分子標記的深入開發與日益廣泛的應用也對其高通量快速檢測技術提出了更高需求。高通量檢測技術是能同時對多個樣本或多個指標進行檢測的先進技術與方法，以其高檢測量、低成本、高效率的顯著優勢，成為檢驗檢測方法研發與標準制定的重要發展趨勢，更是國內外相關研究的熱點與焦點[8]。植物分子標記的高通量快速檢測技術可大致分為3個主要步驟：植物樣本獲取，植物DNA提取，植物樣本檢測。本文以高通量植物樣本采集、高通量提取植物基因組DNA及高通量快速檢測技術3個方面對分子標記檢測的整個過程進行綜合描述，并對植物分子標記的高通量快速檢測過程做出總結與展望，以期對未來檢測流程的改良優化及創新提供理論參考。

1 高通量植物樣本采集

植物樣本的類型豐富，包括葉片、芽、根、種子等。相對來說，葉片采集更便捷，且用葉片提取的DNA純度更高，所以通常采集植物新鮮葉片來提取DNA以便后續檢測。植物葉片采集通常采用兩種方式，分別是人工取樣和智能采集系統。

1.1 人工取樣 無論是實驗室作物還是大田作物，傳統人工取樣仍舊是育種工作者的首要選擇。人工取樣靈活性強、準確度高、具有可控性，但是速度慢，耗費更多時間和精力，人工成本相對較高，且由于人為因素的干擾，樣本可靠性和一致性有待提高。

1.2 智能采集系統 2017年法國ALCI公司研發出高通量植物樣品智能采集系統SAS，利用自動化機械臂采集植物葉片，轉移至多孔板中，技術采樣通量是人工采樣的5倍。美國Brooks公司研發的手持式植物葉圓片采樣及編碼系統PlantTrak Hx，可用于實驗室或野外，采樣量每臺可達1188個，適用于玉米、棉花、大豆等幾乎所有植株葉片。這些智能采集系統相較于人工取樣來說，雖省工省時，提高了樣本采集一致性，但同時，也存在必須單個取樣并轉移，且轉移過程中會出現樣本污染的情況。因此為實現更加便捷、快速的高通量檢測，研發一種低成本、高通量、高效率的葉片采集裝置是非常必要的。

2 高通量提取植物基因組DNA

隨著植物分子標記及檢測技術的發展，對大規模植物DNA提取的需求急劇上升，因而開發出高通量快速DNA抽提的方法尤為重要。在眾多提取方法中，十二烷基硫酸鈉（SDS）法、TPS法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、磁珠法及堿煮法均展現出廣泛的應用前景。這些方法在原理上殊途同歸，均涵蓋細胞裂解破碎、DNA釋放、雜質去除及DNA純化等核心步驟[9]，確保了高效、準確地獲取純凈的植物DNA。

單志等[9]結合了傳統SDS法提取DNA的穩健性與Silica吸附柱純化DNA的高效性，成功創設了一種改良版的SDS法，此法具備廣泛適用性，經過實踐驗證，該方法成功地從23種植物中提取出了高質量的基因組DNA。侯澤菁等[10]在對多種提取方法進行系統分析的基礎上，亦對SDS法進行了優化與創新，成功打造了一種既低成本又高質量的快速提取方法，此方法在保障DNA提取質量的同時，還能有效簡化操作流程、降低試驗成本，為高通量樣本DNA的提取工作提供了強有力的支持。

張友昌等[11]深入比較了多種植物DNA提取方法，經過精心優化與改進，在提取流程中引入了緩沖液預處理技術，并在TPS緩沖液中加入PVP40，這種新方法不僅支持批量取樣，還極大地簡化了操作步驟，摒棄了氯仿和異戊醇的使用，從而實現了低成本、快速、高通量的棉花葉片DNA提取。藍碧秀等[12]對CTAB法進行了改進，能夠同時提取不同樣本的基因組DNA，簡便、快捷、高通量，特別是在微量提取微胚乳玉米基因組DNA方面，充分滿足了以PCR為基礎的分子生物學研究的需求，為相關領域的研究提供了有力支持。

磁珠法提取DNA主要有兩種類型：直接磁珠法和間接磁珠法。直接磁珠法是指磁珠直接與DNA結合，然后通過磁場將磁珠—DNA復合物從混合物中分離出來。間接磁珠法是指磁珠先與某種能夠與DNA結合的物質（抗體或生物素等）結合，然后再通過這種物質與DNA結合，最后通過磁場將磁珠—物質—DNA的復合物從混合物中分離出來。周悅等[13]在磁珠法的基礎上，開發了一套半自動DNA提取儀及不同作物基因組提取流程，具有簡單、高效、準確的優勢，且提取過程無毒，安全系數高。

堿煮法是通過高溫強堿溶液破除植物細胞壁、變性蛋白質，促使DNA釋放。徐宗昌等[14]利用改良堿裂解法，提取轉基因煙草基因組DNA，無需加熱煮沸，上清液可直接用于PCR反應。朱先飛

等[15]則對堿煮法進行了深入的改進，創制出一種更為快速、高通量且低成本的油菜DNA提取方法，該方法無需研磨，流程更加簡化，成本更為低廉，非常適合品種篩選和分子標記輔助選擇等大規模應用。俎峰等[16]則進一步通過簡化堿裂解法與高通量研磨器樣品混勻儀的結合，提供了一套集成化快速、高通量、低成本油菜DNA提取方案，該方法可在10h內完成上萬份DNA樣品的提取，極大地提高了DNA獲取效率。

3 分子標記的高通量快速檢測技術

3.1 CAPS標記檢測技術與dCAPS標記檢測技術 酶切擴增多態性序列標記檢測技術（CAPS，Cleaved amplified polymorphic sequence），又稱限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP），是PCR技術與RFLP技術相結合的方法[17]。其運作原理在于，針對DNA片段在特定酶切位點的堿基變異情況設計PCR引物，采用專一性的限制性內切酶，對PCR擴增后的DNA片段進行酶切處理。這一過程導致不同的電泳圖譜的產生，從而實現對樣本多態性的準確鑒定。CAPS技術在應用上存在固有的局限性，即只能有效檢測位于酶切位點的單核苷酸多態性（SNP），而對于酶切位點之外的SNP則無能為力。為了彌補這一不足，研究人員進行了深入改造，通過人為引入錯配堿基構建新的酶切位點，對SNP位點進行特定的酶切處理，再通過凝膠電泳技術對這些多態性進行準確檢測，這一標記技術被稱為衍生限制性內切酶多態性標記（稱為dCAPS，Derived cleaved amplified polymorphic sequences）[7]。

dCAPS技術的出現，不僅克服了CAPS技術的局限，而且在操作流程上顯得更為簡便，對DNA模板的純度要求也相對較低，僅需借助常規的實驗儀器即可順利完成。該技術的缺點是有概率形成一些非常用的限制性內切酶位點，增加了檢測成本。

王亦學等[18]通過克隆得到谷子SiSAP8基因，經多態性分析后，在第81位的SNP位點上成功開發了dCAPS標記，這一研究為后期谷子功能鑒定及關聯分析提供了有力依據。在植物育種領域，dCAPS技術同樣展現出了其強大的潛力。郭嗣斌等[19]利用dCAPS分子標記定位了一個穗長主效QTL——PL9，通過篩選合適的標記，成功地提高了水稻穗長這一重要產量性狀的育種效率，為育種工作者節約了成本。楊廣闊等[20]通過雙重參考日本晴序列和93-11序列，針對一個涉及稻瘟病抗性材料P400突變基因所定位區間，結合dCAPS策略，展示了高效開發SNP-dCAPS標記的實例，結果表明，建立的方法對利用93-11為親本，開展水稻功能基因分離等工作有積極的借鑒意義。綜上所述，dCAPS技術雖然存在一定的局限，但其在遺傳研究和作物育種領域應用廣泛，產生了深遠影響。

3.2 KASP基因分型技術 競爭性等位基因特異性PCR（KASP，Kompetitive allele specific PCR），即KASP技術，最初由英國KBioscience公司研發，這種技術利用等位基因特異性寡核苷酸延伸和熒光共振能量轉移（ERET）來進行基因分型[21]。KASP技術原理是針對于目標序列的SNP位點，設計3條引物，其中2條特異性上游引物僅在引物末端有堿基差異且攜帶特殊接頭，第3條引物是通用的下游引物，最終根據擴增產物的熒光信號來確定基因型，實現準確的基因分型。KASP技術的研發開創了一種高效、精準的基因分型技術，通過在PCR過程中引入熒光信號，KASP技術大大簡化了基因分型的操作流程，降低了成本，適用于各種通量的基因分型試驗，并提高了分型的準確性和靈敏度[22]。這項技術在分子育種、疾病診斷、人類遺傳學等領域具有廣泛的應用前景。總的來說，KASP技術的出現為基因分型提供了一種快速、可靠的解決方案，不僅可以幫助科研人員更深入地了解等位基因間的差異，還可以在醫學和農業領域為疾病診斷和作物改良提供有力支撐。隨著科學技術的不斷發展，KASP技術將在未來發揮更加重要的作用，推動基因分型領域的持續發展。

鄧釗等[23]借助參考基因組及水稻測序數據庫進行SNP變異位點分析，開發出3個KASP連鎖標記，可用于水稻Bph43基因型鑒定。趙傳超等[24]成功開發了水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP分子標記，建立了水稻Pi2基因的KASP基因分型體系，對遺傳育種及品種改良研究有重要的應用價值。Kang等[25]開發并驗證了水稻條紋病毒抗性基因的KASP分子標記，具有高通量、準確性高等優點。Addison等[26]利用KASP技術分析了水稻香味基因BADH2的297個基因組位點，最終確定了9個SNP的KASP標記，并成功鑒定水稻香味基因。通過該檢測技術，研究人員可精確進行水稻基因分型，也可以更好地了解水稻基因的遺傳多樣性，加速了從實驗室到田間的轉換過程，為育種改良奠定了基礎。這些研究為水稻育種研究提供了重要的技術支持，有助于培育出更優良的水稻品種，推動了水稻種質資源的合理利用和保護。

3.3 基于芯片的分子標記檢測技術 在分子育種中，研究者往往需要借助高效的基因分型技術手段，對海量種質資源進行基因型檢測，從而完成更加高效、精準的品種選育。1991年Affymetrix公司的Fordor首次利用光蝕刻技術制備了基于玻片的微陣列，使生物芯片成為可實際應用的分子生物學技術，為高通量分子標記檢測技術開辟了新的道路。如今，芯片技術已經得到了長足的發展。其中DNA芯片是應用最廣泛的一種。DNA芯片可用于SNP位點檢測，為基因定位提供了重要工具[27]。同時，芯片技術的不斷創新和發展進步，進一步提高了基因分型的效率和準確性。基因芯片可分為固相芯片和液相芯片。固相芯片主要用于檢測單核苷酸多態性（SNP）等標記，而液相芯片因其高通量特性在大規模樣本處理中表現優異，研究者可根據試驗目的及自身需求選擇合適的芯片類型，以達到預期效果。綜合來看，DNA芯片技術的發展在基因分型領域發揮著不可替代的作用。通過結合SNP檢測和分型技術，DNA芯片為基因定位和功能基因組學研究提供了重要工具和支撐。隨著技術的不斷進步，基因芯片的應用范圍和效率將進一步提升，為分子育種研究和其他領域的基因分型工作帶來更多的可能性和機遇。

3.3.1 固相芯片檢測技術 固相基因芯片市場中，應用最多的檢測芯片主要來自兩大廠家，Illumina和Affymetrix。Illumina采用微球芯片生產工藝，通過微米級氧化硅微球固定寡核苷酸探針，每個微球耦合多條探針，可檢測1個SNP位點。探針設計中，Address序列識別微球身份，Probe序列與DNA片段雜交[28-29]。掃描儀可檢測紅綠熒光，區分堿基。該技術高通量、準確可靠，但需要高標準的探針設計。在玉米和小麥遺傳研究中[30-31]，Illumina芯片技術可用于構建連鎖圖譜和基因分型，為遺傳機制研究和分子標記輔助育種奠定基礎。

Affymetrix的基因芯片利用原位光刻合成技術，在基片上直接固定和合成探針。在基片上進行羥基化處理，并使用光敏感的保護基團保護羥基；光刻掩膜遮擋，只有受光照射部位的羥基脫保護，激活進行偶聯反應；通過多輪反應，逐步合成DNA探針長鏈；探針鏈與基因組DNA雜交后顯色，激光進行掃描完成SNP位點分析[7]。Affymetrix的Axiom芯片可實現基因組DNA的精準檢測。

3.3.2 液相芯片檢測技術 液相芯片體系由許多均一大小的圓形微球構成，每個微球固定不同的探針分子，懸浮于液相體系形成液相芯片系統，實現多種分子同時檢測，即xMAP技術[32]。1997年Luminex公司推出這項技術，使用不同比例紅色熒光染料標記微球，編碼產生百種以上熒光編號，xTAG技術將特異探針與編碼微球結合，將不同探針通過編碼微球區分，待測樣本與探針—微球復合物雜交，通過流式細胞儀一次完成多種靶序列鑒定，該技術可應用于不同植物，進行種質鑒定、遺傳研究、全基因組分析和育種研究[33-35]。

Illumina的微球芯片、Affymetrix的原位合成芯片以及Luminex公司的液相芯片均可實現高通量快速檢測。微球芯片試驗只需1次雜交，最快2d可得結果，效率高；原位合成芯片需2次雜交，工作流程較復雜，檢測周期較長；液相芯片需要樣本處理、雜交、擴增建庫等步驟，時間較長。無論是固相芯片還是液相芯片，均適用于高通量基因分型，涵蓋幾萬至幾十萬檢測位點。

3.4 靶向測序基因型檢測技術 自1977年第一代測序技術問世以來，測序技術不斷發展，從Sanger測序發展至二代測序，再到如今的三代全長測序，測序成本有所降低。然而，對于大規模育種計劃中成千上萬樣本的全基因組測序仍面臨高成本和數據處理挑戰。為了提高效率、降低成本，簡化的基因組測序技術（GBS，Genotyping by sequence）逐漸受到關注。其中，經典的GBS技術原理是利用限制性內切酶等手段來降低基因組的復雜程度，再結合高通量測序，獲取標記信息，實現基因分型[36]。在高質量參考基因組和圖譜的基礎上，GBS技術能夠用較小的測序量獲取高密度全基因組覆蓋的分子標記，因此得到廣泛應用。冷益豐等[37]利用GBS技術，對大涼山360份玉米地方品種資源進行親緣關系鑒定與遺傳分析，分成兩大類群，并對檢測到的418個基因進行功能注釋，為大涼山地區玉米品種資源的改良及保護提供了理論基礎。

基于GBS技術的發展，研究者提出了靶向測序基因型檢測技術（GBTS，Genotyping by target sequencing），它針對特定靶向位點進行測序和基因型檢測。這種靶向的簡化基因組測序可對已知區域及位點測序，摒除冗余位點，減少了生信分析數據量，提高了分析效率。GBTS技術包括基于多重PCR的GenoPlexs技術和基于液相探針捕獲的GenoBaits技術。基于多重PCR的靶向測序技術結合了多重PCR和二代測序，首先擴增目標區域，通過PCR或酶連接引入接頭序列，構建擴增子文庫，再進行測序和生物信息學分析，獲取目標區域序列信息，實現基因檢測[38]。基于液相探針捕獲的技術是將目標探針與靶向序列互補結合，基于分子雜交和二代測序，利用生物素探針捕獲目標區域，然后通過鏈霉親和素和磁珠吸附技術完成捕獲和測序，實現基因型分析[39]。以上這些技術均具有高通量、準確度高、成本低等優點。石家莊博瑞迪公司利用GBST技術自主研發了水稻1K和40K、大豆40K、玉米45K、小麥16K和40K的液相芯片，展示了該技術的廣泛應用性[38]。Shen等[40]評估了372份西蘭花材料的遺傳多樣性、親緣關系、群體結構和指紋圖譜，選擇了1067個SNPs通過靶測序（GBTS）進行基因分型，100個SNP通過KASP進行基因型分型，將372材料分為2個主要類群。這是首次對中國西蘭花的多樣性和種群結構進行綜合研究，也是GBTS和KASP技術在西蘭花遺傳特征鑒定中的首次應用，為中國西蘭花的育種研究提供了豐富信息。

4 結語與展望

分子標記具有諸多優勢且在作物遺傳育種中發揮著重要作用，隨著分子生物學技術的發展，分子標記的檢測將更加高效、高通量、成本更低，進一步實現程序化與自動化。

樣本采集作為分子標記檢測流程的第1步，很大程度上制約著檢測流程和育種效率，尤其是目前仍以人工取樣為主的育種實驗室及科研單位。人工取樣成本高、速度慢、效率低，而智能采集系統雖然節省人力資源，但是在對樣本進行多次轉移的過程中容易出現污染，取樣質量及效率上有待改進以實現高通量精準取樣。對此，研究者可針對這些缺陷進行改良及創新，探索新的取樣方法。例如，在目前的基礎上對采樣裝置進行創新，做到連續取樣甚至無限取樣，降低人力和時間成本，甚至在取樣時同時破碎樣本，省去轉移步驟，減少誤差和污染風險。此外，可結合堿煮法等DNA提取方法處理采集的樣本，或簡化處理程序，在添加試劑提取高純度DNA樣本的基礎上，直接進行PCR反應，大幅降低時間和試劑成本。這些創新方法有助于提高樣本取樣和DNA提取過程的效率和質量。

CAPS標記檢測技術、dCAPS標記檢測技術、KASP基因分型技術、基于芯片的分子標記檢測技術與靶向測序基因型檢測技術均可以對DNA樣本進行高通量、高準確性、高靈敏度、快速的多重檢測。但是，這些先進技術存在價格昂貴、設計和操作復雜、擴增產物難以定量、反應容易受污染、無法現場實時檢測、缺乏自動化等問題，并且都依賴于較高素質的專業操作人員與專業的實驗室環境。因此，對這些技術進行降低成本、簡化使用流程、提高靈敏度和準確性方面的優化，可以使其在不同領域中被更廣泛地應用。

未來分子標記的高通量檢測技術的發展方向涵蓋以下幾個關鍵方面。首先，結合CRISPR/Cas系統，能實現高靈敏度、高精度的多種基因修飾產物檢測，與LAMP、RPA等技術結合可快速準確地檢測包括SNP分子標記和基因編輯在內的復雜序列信息[41]。其次，即時檢驗技術（POCT）結合PCR和膠體金免疫層析技術可在田間實現即時檢測，幫助育種工作者實現快速篩查和基因型分析。另外，結合化學發光技術、ELISA和電化學技術等IVD診斷技術以及質譜分析技術，可實現高通量快速篩查和基因型精準分析。在技術創新的基礎上，應著力降低設備和試劑成本，綜合多種技術優勢，研發更經濟、高效、精準的檢測技術，這些發展方向也有望為分子標記的高通量檢測帶來新的突破，助力育種工作的發展和進步。

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