結縷草屬種質資源EST-SSR遺傳多樣性分析

摘要：本研究以43份不同來源的結縷草屬種質為材料，利用表達序列標簽-簡單重復序列（Expressed Sequence Tag-Simple sequence repeat，EST-SSR）引物對其進行遺傳多樣性分析。結果表明：從125對EST-SSR引物中篩選出30對能穩定擴增、條帶清晰的引物；共檢測到124個標記，平均每對引物檢測到4個，多態性標記有108個，多態性位點百分率為88.60%；種質間遺傳相似性系數為0.530～0.864，平均為0.711；共檢測到104個觀察等位基因，平均每對引物檢測到3個；有效等位基因數范圍為0～5，平均為3；Shannon信息指數變化范圍為0～1.593，平均為0.940。Nei’s基因多樣性指數范圍為0～0.793，平均為0.541；在遺傳相似性系數為0.800時，利用非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）法將43份種質劃分為4個類群，聚類結果與種質地理位置有一定的關聯，但聯系不緊密。本研究結果表明43份種質的遺傳多樣性處于上等水平，EST-SSR標記能有效地評價結縷草屬種質的遺傳差異，為結縷草屬種質資源的鑒定評價及分子標記輔助育種提供參考依據。

關鍵詞：結縷草屬；EST-SSR；分子標記；遺傳多樣性；群體結構

中圖分類號：S543""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）08-2386-08

Genetic Diversity Analysis of Zoysia willd. Accessions by EST-SSR Markers

HUANG Chun-qiong1， HE Xiao1，2， LUO Li-juan2*， DONG Rong-shu1， LIU Guo-dao1

（1. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop

Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikouu，

Hainan Province 571101， China; 2. College of Tropical Crops Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China）

Abstract：In the present study，43 Zoysia willd. accessions from different sources were used to detect the genetic diversity using Expressed sequence tag-simple sequence repeat（EST-SSR）primers. The results showed that 30 pairs of primer from the original 125 pairs of primer were selected based on the polymorphic，clear and reproducible bands amplified by them. A total of 124 bands were amplified by 30 primer pairs from 43 accessions with 4 bands per primer pairs，and 108 （88.60%） out of them were polymorphic. The genetic similarity coeffcients （GSC） among the 43 accessions ranged from 0.530 to 0.864 with an average of 0.711. A total of 104 observing alleles were amplified by 30 pairs of primer from 43 accessions with 3 observed alleles per pairs of primer. The range of effective number of alleles was 0 to 5 with an average of 3. The range of shannon information index was 0～1.593 with an average of 0.940. The Nei’s genetic diversity index was 0～0.793 with an average of 0.541. Cluster analysis conducted by the unweighted pair-group method with arithmetic averages （UPGMA） separated the 43 accessions into 4 groups when the genetics similarity coefficient was 0.800. The clustering results were somewhat correlated with the geographical location of the accessions，but not closely related. The results indicated that the genetic diversity of Zoysia willd. accessions was rich，which laid a foundation for the identification and evaluation of Zoysia willd. accessions and molecular marker-assisted breeding.

Key words：Zoysia willd；EST-SSR；Molecular makers;Geneic diversity;Population structure

結縷草屬（Zoysia Willd.）系禾本科（Gramineae）畫眉草亞科（Chloridoideae）的多年生草本，有匍匐根莖，是一種優良的暖季型草坪草，部分種還可以作為牧草［1-2］；能適應各種類型的土壤，有較強的抗逆性，耐粗放管理，廣泛應用于小區及公園綠化、各種類型的運動場草坪、休憩草坪及保土草坪等的建植［3-4］。結縷草屬植物通?？煞譃?6個種，多個變種以及變型。中國分布著5個種，2個變種以及1個變型［5-8］。中國擁有豐富的縷草屬種質資源，分布地域廣泛，對其進行遺傳多樣性研究，有助于探究其起源與進化關系，同時為良種選育、資源保護等提供基礎材料。

植物種質資源遺傳多樣性的評價可以利用表型性狀或分子標記技術等手段。表型性狀一般具有不穩定性，容易受到外界環境的干擾，從而導致評價結果不準確；而分子標記技術是從分子水平上研究種質資源的遺傳差異情況，受外界環境的干擾較小，分析結果穩定［9］。分子標記技術在草坪植物種質資源評價研究中有比較廣泛的應用，也被應用在結縷草屬植物種質資源親緣關系鑒定、遺傳多樣研究、指紋圖譜構建等研究中。Yaneshita等［10］ 利用限制片段長度多態性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術分析了來自日本的17份結縷草種質的遺傳變異情況。Choi等［11］和Weng等［12］利用隨機擴增多態性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）標記分別對來自韓國西南沿海地區的68份和來自臺灣的131份結縷草屬植物種質資源進行了遺傳多樣性研究。Cai等［13］利用擴增片段長度多態性（Amplified restriction fragment polymorphism，AFLP）標記構建了78份結縷草種質資源的遺傳連鎖圖譜。Cai等［14］開發了結縷草屬種質資源的1044個簡單序列重復（Simple sequence repeats，SSR）標記。

表達序列標簽-簡單重復序列（Expressed sequence tag-Simple sequence repeat，EST-SSR）是基于表達序列標簽開發的一種微衛星分子標記，與基因組SSR標記相比具有突出的優越性［15-19］。EST-SSR標記是一類功能標記，在同科不同屬或同屬不同種間具有良好的通用性。Yan等［20］利用EST-SSR標記的18對引物對75份鴨茅（Dactylis glomerata L.）種質資源進行了遺傳多樣性評價。趙巖等［21］利用58對來自小麥（Triticum aestivum L.）、大麥（Hordeum vulgare L.）、玉米（Zea mays L.）、高粱［Sorghum bicolor （L.） Moench］、水稻（Oryza sativa L.）的EST-SSR引物對結縷草屬植物種質資源進行了分子系統發育分析。基于EST-SSR標記的許多優良特性，為了解不同地理來源的結縷草屬不同種間及同種不同種質間的遺傳多樣性及親緣關系，本研究利用EST-SSR標記對43份結縷草屬植物種質的遺傳多樣性和群體結構進行了系統分析，通過遺傳相似系數進行聚類分析，以期對43份種質的遺傳差異進行研究，為結縷草屬種質評價及新品種選育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料種植于海南省儋州市中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所草業研究中心草坪草種質資源圃，43份結縷草屬種質包括溝葉結縷草15份（海南11份，廣東1份，福建2份，斯里蘭卡1份）、細葉結縷草1份（廣東深圳）、結縷草27份（海南4份、山東14份、廣東1份、福建1份、江蘇3份、浙江2份、上海1份、安徽1份）。具體來源見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 以43份結縷草屬種質為材料，選取健康幼嫩葉片提取DNA。具體提取方法參照Huang等［22］的試驗方法進行，將提取的DNA濃度稀釋到約50 ng·μL-1，置于-20℃冰箱中保存備用。

1.2.2 EST-SSR標記分析 引物參考Zhang等［23］、Brian等［24］、Terry等［25］的研究結果，選取EST-SSR引物共125對，由金斯瑞生物科技公司合成。選擇來源不同的6份結縷草屬種質（海南樂東的4號、山東青島的9號、山東青島31號、福建同安的37號、浙江仙居的40號、上海金山的42號），對125對引物進行篩選，篩選出重復性較好、條帶清晰的引物，用于后續評價43份結縷草屬種質資源的遺傳多樣性。

EST-SSR PCR反應體系總體積為20 μL，包括10 μL 2×Easy Taq PCR Supermix（北京全式金生物），0.5 μmol·L-1正向引物、0.5 μmol·L-1反向引物、2 μL樣品DNA、6 μL無菌水。擴增程序參考崔蓉菁［26］的試驗方法進行。PCR擴增產物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳完成后，利用AgNO3染色、NaOH和甲醛顯色，最后拍照記錄。

1.3 數據統計與分析

統計清晰穩定的電泳條帶，同一位置有擴增條帶的記為1，無擴增條帶記為0，建立分子數據庫，用于條帶多態性分析和聚類分析。利用Popgen 32計算每對引物的觀察等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、Shannon信息指數（I）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Nei基因多樣性指數（H）等遺傳多樣性參數。采用NTSYS-pc2.1計算遺傳相似性系數，并進行UPGMA聚類分析。利用Sturcture 2.3.4軟件進行遺傳結構分析，綜合結果作出群體結構分析圖。

2 結果與分析

2.1 結縷草屬種質EST-SSR引物的篩選

選取地理位置相隔較遠的6份結縷草屬種質，包括4號（海南樂東）、9號（山東青島）、31號（山東青島）、37號（福建同安）、40號（浙江仙居）、42號（上海金山）對125對引物進行篩選，最終篩選出了30對條帶清晰、多態性好、主帶明顯的EST-SSR引物。

2.2 結縷草屬種質EST-SSR擴增多態性分析

利用篩選出來的30對EST-SSR引物對43份結縷草屬種質DNA進行擴增，共獲得124條條帶，其中多態性條帶108條，多態性條帶比例為88.60%（表2），引物擴增條帶范圍為1～8條，平均為4條。其中，編號ES-091引物擴增的條帶最多，為8條，多態性條帶比例最高的引物有17對（ES-001，ES-003，ES-007，ES-009，ES-013，ES-034，ES-043，ES-047，ES-049，ES-056，ES-057，ES-058，ES-066，ES-089，ES-092，ES-097，ES-100）均為100%，多態性條帶比例最低的引物有2對（ES-021，ES-080），均為50%。

2.3 結縷草屬種質EST-SSR群體遺傳多樣性分析

利用篩選出的30對EST-SSR引物對43份結縷草屬種質的DNA進行EST-SSR的PCR擴增（表3），30對引物共擴增出了104個觀察等位基因，觀察等位基因數變化范圍為1～6個，平均為3個，其中引物ES-012擴增出的觀察等位基因數最多，為6個；引物ES-013及ES-043擴增出的觀察等位基因最少，均為1個。有效等位基因數變化范圍為0～5個，平均為3個，其中引物ES-034擴增出的有效等位基因數最多，為5個；引物ES-007，ES-013，ES-043，ES-006擴增出的有效等位基因數最少，均為1個。Shannon信息指數變化范圍為0～1.593，平均為0.940，其中Shannon信息指數最大的是引物是ES-034，這說明ES-034具有很高的多態性檢測效率；Shannon信息指數最小的引物是ES-013，ES-043。觀測雜合度的變化范圍在0～1，平均為0.201，其中引物ES-006，ES-009，ES-012，ES-047，ES-079，ES-080，ES-091，ES-013的觀測雜合度最小，為0；引物ES-013，ES-043的觀測雜合度最大，為1。期望雜合度的變化范圍為0～0.804，平均為0.547，其中ES-034的期望雜合度最大，為0.804；ES-013，ES-043的期望雜合度最小，為0。Nei’s基因多樣性指數范圍為0～0.793，平均為0.541，Nei’s基因多樣性指數最大的引物為ES-034，為0.793；Nei’s基因多樣性指數最小的引物為ES-043，為0。

2.4 遺傳相似性系數分析

根據30對EST-SSR引物的多態性條帶，通過NTSYS-pc2.1 軟件計算出43份結縷草屬種質間的遺傳相似性系數，得到遺傳相似性系數矩陣。從遺傳相似性系數矩陣可以計算出種質間的遺傳相似系數范圍為0.530～0.864，平均為0.711。19號（山東臨忻）結縷草和的20號（江蘇南京）結縷草的遺傳相似系數最大（0.864），表明這兩份種質間的親緣關系最近；而4號（海南樂東）結縷草和36號（廣東梅州）結縷草遺傳相似系數最?。?.530），表明這兩份種質間的親緣關系最遠。

2.5 聚類分析

對43份結縷草屬種質的EST-SSR分子標記結果進行統計，并進行UPGMA聚類分析（圖1），在遺傳相似性系數為0.800時，分為4個類群。其中第Ⅰ類群包括28份種質，有結縷草18份（9份來自山東，1份來自安徽，3份來自江蘇，4份來自海南，1份來自福建）和溝葉結縷草10份（8份來自海南，1份來自廣東，1份來自斯里蘭卡），來自山東臨沂的19號結縷草和來自江蘇南京的20號結縷草親緣關系最近，來自福建泉州的3號結縷草與其他27份種質親緣關系較遠。第Ⅱ類包括13份種質，其中結縷草7份（山東5份，廣東1份，浙江1份），溝葉結縷草5份（海南3份，福建2份），細葉結縷草1份（廣東），來自海南萬寧的41號溝葉結縷草與其他12份種質親緣關系較遠，來自山東青島的32號結縷草種質與來自海南瓊中的溝葉結縷草33號種質親緣關系較近。第Ⅲ類包括來自浙江開化的24號結縷草1份種質，第Ⅳ類群只有來自上海金山的42號結縷草1份種質。

2.6 群體結構分析

為了進一步了解供試材料的遺傳組成，以EST-SSR標記數據為基礎，使用Structure 2.3.4軟件分析43份結縷草屬種質的遺傳結構，設置K值為1～10，引入ΔK值來確定最佳K值，繪制ΔK值隨著K值增大的變化曲線圖（圖2）。如圖2所示，當K=2時，ΔK值最大，所以將43份材料劃分為2個類群。43份結縷草屬材料群體結構分析如圖3所示，43份材料明顯分為2大類群。

由表4結縷草屬種質Q值表可知，類群1中共包含22份材料，Q值在0.693～0.993之間，其中22號、23號種質Q值小于0.7，類群2中包含21份種質，Q值在0.945～0.992之間。

3 討論

3.1 結縷草屬種質資源的多態性及遺傳差異

EST-SSR標記是一種研究植物種質資源遺傳多樣性和群體結構分析的重要工具，本研究選取地理位置相隔較遠的6份結縷草屬種質對125對引物進行篩選，最終篩選出了30對條帶清晰、主帶明顯、重復性好的EST-SSR標記，利用這30對引物對43份結縷草屬種質進行遺傳多樣性分析，共擴增出108條多態性條帶，多態性比率（PPB）為88.60%。Weng等［27-28］和郭海林［29］的研究結果均表明結縷草屬植物種質資源的遺傳變異情況與不同種的植物學分類相關性不高，而與其長期對生長環境的適應性相關性更高。本研究的遺傳相似性變異范圍為0.530～0.864，這與Cai等［13］利用基因組SSR的研究結果一致。本研究利用EST-SSR標記共擴增出104個觀察等位基因，平均每對EST-SSR標記可檢測到3個觀察等位基因，這與Odeny等［30］對木豆［Cajanus cajan （L.） Millsp］的SSR標記研究結果一致，但顯著低于Dutta等［31］的研究結果，這可能是因為選取的種質和引物不同所導致。本研究評估43份結縷草屬種質資源遺傳差異發現Shannon信息指數變化范圍為0～1.593，平均為0.940，高于郭海林等［32］（0.3504）和郭海林等［33］等（0.3746）結果，這與選取試驗種質差異有關。

3.2 結縷草屬種質資源的聚類分析及遺傳結構

聚類分析以及群體結構分析是種質資源遺傳多樣性評價常用的分析方法［34］。本研究通過聚類分析發現，來自山東臨沂的19號結縷草和來自江蘇南京的20號結縷草親緣關系最近聚在一起；而來自同一地區的結縷草屬種質并沒有聚集在同一類群中，比如來自山東的結縷草屬材料在第Ⅰ類群、第Ⅱ類群中均有分布，這說明聚類結果與地理來源關系不緊密。伊然等［35］利用EST-SSR標記對60份葦狀羊茅遺傳多樣性研究、陳志祥等［34］利用SSR標記對72份木豆種質資源的研究以及陳斐等［36］利用SSR標記對82份苜蓿（Medicago sativa L.）種質資源的研究時均發現種質資源的聚類分析結果與地理來源不存在緊密聯系關系。另外，本研究還發現來自浙江開化的24號結縷草種質和來自上海金山的42號結縷草種質分別單獨聚為1類，與其他種質遺傳距離較遠，這2份種質在形態上并沒有明顯的區別特征，但可能在遺傳物質上存在一定差異。這一現象與郭海林等［33］利用SRAP標記對結縷草屬種質資源的遺傳多樣性研究結果一致。此外，本研究發現聚類分析沒能將結縷草屬的3個種（溝葉結縷草、細葉結縷草和結縷草）從種間區分開。郭海林等［32-33］對結縷草屬種質資源的聚類分析時也發現了類似結果。導致這一現象的原因可能與種質數量及所用引物及引物數量有關。

曾美娟等［37］利用EST-SSR標記對茄子（Solanumm elongena L.）進行親緣關系分析，將29份不同的茄子材料劃分為2個類群，這說明EST-SSR分析結果可以較好地反映作物種質資源間的親緣關系，并對其群體結構進行有效劃分，但聚類分析的結果和遺傳多樣性與標記的種類數量及試驗材料的地理來源、數量及親緣關系都有一定的關系。每個群體中測試材料的Q值的分布可以表示每種材料之間的關系，群體結構的Q值越大，亞群分類的可能性就越大，本研究中43份材料中有41份材料的Q值大于0.9，說明本研究的結縷草群體結構相對簡單，適合連鎖不平衡分析，這與董樂等［38］對45份浙江紅花油茶（Camellia chekiangoleosa Hu）經濟性狀與SSR分子標記的關聯分析的結果一致。

4 結論

利用EST-SSR標記對43份結縷草屬種質資源的遺傳多樣性研究發現聚類結果與種質地理位置有一定的關聯，但聯系不緊密，43份種質的遺傳多樣性處于上等水平，EST-SSR標記能有效地評價結縷草屬種質的遺傳差異，本研究結果為結縷草屬分子標記輔助育種提供參考依據。

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（責任編輯 閔芝智）