紫花苜蓿NAC基因家族鑒定及在非生物脅迫下的表達模式分析

摘要：NAC是植物特有轉錄因子，在調控植物生長發育及響應非生物脅迫等方面發揮作用。為挖掘紫花苜蓿（Medicago sativa）響應干旱等非生物脅迫的NAC轉錄因子，本研究利用生物信息學方法在‘中苜4號’紫花苜?；蚪M中鑒定出143個NAC家族轉錄因子。研究表明，紫花苜蓿MsNAC基因在染色體上不均勻分布，MsNAC基因存在片段重復，并與大豆（Glycine max （Linn.） Merr.）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）存在共線性關系，基因保守基序及基因結構分析表明MsNAC基因多數含有Motif1，Motif3保守基序及3～6個外顯子。大多數MsNAC蛋白定位于細胞核中。系統進化樹分析結果表明MsNACs聚類為8個亞家族。順式作用元件分析表明MsNAC基因含有響應干旱及脫落酸、生長素等順式作用元件。熒光定量分析結果顯示部分MsNAC基因響應干旱、鹽脅迫及脫落酸處理，大部分MsNAC候選基因在干旱、鹽及ABA處理后上調表達。本研究結果可為紫花苜?？购?、耐鹽分子育種提供候選基因。

關鍵詞：紫花苜蓿；NAC；轉錄因子；生物信息學；非生物脅迫；表達模式

中圖分類號：S514.9""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）08-2440-19

Identification of Alfalfa NAC Gene Family and Analysis of Their

Expression Patterns under Abiotic Stress

ZOU Wei-peng， ZHAI Jia-xing， LI Di-na， HUANG Jie-qiong， GUO Kang-jie，

CEN Hui-fang*， ZHU Hui-sen*， XU Tao

（College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：The NAC transcription factors are specific to plants and play a crucial role in regulating plant growth，development，and response to abiotic stresses. A total of 143 NAC family transcription factors were identified in the ‘Zhongmu No.4’ alfalfa （Medicago sativa） genome using bioinformatics methods，specifically in response to abiotic stress such as drought. The distribution of MsNAC genes on the chromosomes of alfalfa was found to be uneven，with fragment repetition and collinear relationships with soybean （Glycine max） and Medicago truncatula. Gene conserved motifs and gene structure analysis revealed that most MsNAC genes contain Motif1 and Motif3 conserved motifs and 3～6 exons，most MsNAC proteins are localized in the nucleus. The results of phylogenetic tree analysis showed that MsNACs were clustered into 8 subfamilies. The analysis of cis-acting elements showed that MsNAC genes contain cis-acting elements to drought，abscisic acid and auxin. Fluorescence quantitative PCR analysis showed that some MsNAC genes were responsive to drought，salt stress，and ABA treatment，most MsNAC candidate genes were up-regulated after drought，salt and ABA treatment. These findings provide valuable candidate genes for breeding alfalfa with improved drought and salt tolerance.

Key words：Alfalfa;NAC;Transcription factor;Bioinformatics;Abiotic stress;Expression pattern

植物在生長過程中容易受到干旱、鹽堿等非生物脅迫和病蟲害等生物脅迫的危害，植物通過調控相應基因的表達來調節植物的生化代謝途徑及生長發育過程來抵御及適應脅迫對其產生的影響。NAC轉錄因子家族是植物特有的基因家族，也是植物體內最大的轉錄因子家族之一［1-3］。NAC蛋白具有高度保守的N端DNA結合區以及可變的C端轉錄調控區，N端大約由150個氨基酸殘基組成且又分為高度保守的A，C，D及多變的B，E共5個亞結構域，不同亞結構域發揮不同的功能，其中A亞結構域與功能二聚體有關，B，E亞結構域與蛋白質功能的多樣性有關，C，D亞結構域則與DNA結合有關［4-5］。自1996年Souer等在矮牽牛中分離到第一個屬于NAC轉錄因子家族的NAM后，越來越多的NAC轉錄因子被發掘出來，并且證明其在調控植物生長發育、響應逆境脅迫、參與次生物質代謝、影響細胞發育等方面發揮著重要作用［6-8］。如在水稻（Oryza sativa）中OsNAC2基因可以結合生長素失活相關基因GH3.6/GH3.8和信號傳導相關基因ARF25以及細胞分裂素氧化酶基因的啟動子，從而調控水稻生長素及細胞分裂素途徑，影響水稻根系生長［9］；西瓜（Citrullus lanatus）ClNAC68轉錄因子通過抑制ClINV和ClGH3.6的表達正向調控西瓜的含糖量和種子發育［10］；在小麥（Triticum aestivum）中過表達TaNACL-D1轉錄因子可以增強小麥對赤霉病的抗逆性［11］；草莓（Fragaria×ananassa）FaRIF轉錄因子是草莓成熟以及色素生成和糖分積累的關鍵調控因子［12］；在番茄（Solanum lycopersicum）中，NAC轉錄因子NOR-like1通過調節番茄細胞層數和細胞面積來調節果實大?。?3］；油菜（Brassica rapa）BraNAC87基因的過表達導致了油菜葉片葉綠素的降解及花青素積累，調控活性氧的積累和細胞死亡［14］。

NAC基因在多種植物中完成功能驗證及全基因組分析，包括擬南芥（Arabidopsis thaliana）［15］、玉米（Zea mays）［16］、梭梭（Haloxylon ammodendron）［17］、月季（Rosa chinensis）［18］、山茶（Camellia sinensis）［19］等。在擬南芥中鑒定出117個NAC基因，其中AtNAC092調控由鹽脅迫引發的衰老過程［20］；玉米中鑒定出148個非冗余的NAC基因，ZmNAC20能提高玉米耐旱性［21］；在月季中鑒定出116個NAC基因，其中RcNAC091直接靶向RcWRKY71啟動子區域激活RcWRKY71表達，RcWRKY71正向調控月季脫落酸信號傳導及月季耐旱性［22］；在獼猴桃中鑒定出142個NAC基因，其大多調控獼猴桃果實成熟過程［23］；在山茶中鑒定出104個NAC基因，過表達CsNAC28可增強山茶耐旱性［19］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科苜蓿屬多年生牧草，是我國栽培面積最大的牧草之一，具有營養品質高、產量高、適應性強、適口性好的特點，被稱為“牧草之王”［24-25］。隨著我國畜牧業發展，優質豆科牧草的需求量逐年升高。我國紫花苜蓿多種植于干旱半干旱地區種植區，干旱遏制了我國紫花苜蓿種植及生產［26］。因此培育耐旱紫花苜蓿新品種是發展我國畜牧業的關鍵。目前，多個品種紫花苜蓿的全基因組已得到解析，為進一步挖掘分析抗旱相關基因家族提供了便利。NAC基因在調控其他植物生長發育與非生物脅迫響應等方面已得到驗證，本研究利用生物信息學方法對紫花苜蓿MsNAC基因家族進行鑒定和分析，并對其在干旱、鹽脅迫及脫落酸（Abscisic acid，ABA）處理下的響應模式進行研究，為后續進一步探究NAC基因在紫花苜蓿中的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 NAC轉錄因子的鑒定

利用紫花苜?；蚪M數據（https：//figshare.com/s/fb4ba8e0b871007a9e6c）和NAC轉錄因子保守結構域的隱馬爾可夫模型文件，用hmmsearch命令鑒定紫花苜蓿NAC家族成員；并且從Phytozom（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov）和Tair（https：//www.arabidopsis.org）數據庫獲取擬南芥、水稻及蒺藜苜蓿的基因組文件，與紫花苜蓿基因組進行Blast比對，得到紫花苜蓿NAC蛋白序列。以上獲得的序列進行合并及去冗余分析，并且利用NCBI-conserved domain（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）及SMART（https：//smart.embl.de/）和Pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）進行蛋白質保守結構域的鑒定，再根據NAM結構域氨基酸序列長度約為150 bp進行篩選［27］，最終獲得紫花苜蓿NAC轉錄因子。

1.2 蛋白理化性質、亞細胞定位分析

利用ExPasy（https：//www.expasy.org）在線蛋白質分析工具ProtParam和ProtScale預測氨基酸數目、分子量等信息。利用Cell-Ploc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）及Wolf-psort（https：//wolfpsort.hgc.jp）對蛋白序列進行亞細胞定位分析。

1.3 基因結構及蛋白質基序分析

利用保守基序在線預測工具MEME（https：//meme-suite.org/meme）對MsNAC蛋白序列進行預測，保守基序數設置為10，其他參數設置為默認；從紫花苜蓿注釋文件中獲得MsNAC的基因結構信息，使用TBtools工具將MsNAC的基因結構（外顯子-內含子、保守結構域）及保守基序結構進行可視化分析。

1.4 系統發育進化樹分析

使用MEGA7.0軟件對紫花苜蓿MsNAC基因和蒺藜苜蓿MtNAC基因的氨基酸序列的多序列比對，構建系統進化樹，采用鄰接法（Neighbor-Joining），泊松校正，成對刪除，1000次Bootstrap重復［28］，利用iTOL（https：//itol.embl.de/）及Evolview（https：//www.evolgenius.info/evolview/）進行系統發育樹美化。

1.5 順式作用元件分析

從紫花苜蓿注釋文件中選取MsNAC基因起始密碼子上游2000 bp的序列，利用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）工具預測并分析啟動子順式作用元件。將預測獲得的數據利用TBtools工具進行可視化分析［29］。

1.6 染色體定位及基因共線性分析

從紫花苜蓿基因注釋文件中獲取紫花苜蓿的染色體信息及MsNAC基因的染色體定位信息，根據MsNAC基因在染色體上的位置進行編號命名。利用TBtools工具對MsNAC基因進行共線性及基因重復事件和染色體定位的可視化分析［30］。

1.7 紫花苜蓿MsNAC基因的組織表達特異性及響應不同非生物脅迫的表達模式分析

從紫花苜蓿轉錄組數據庫（PRJNA450305）中獲取不同非生物脅迫下紫花苜蓿的轉錄組數據。通過Hisat2建立索引，將紫花苜蓿基因組數據與RNA-seq數據進行比對，使用StringTie計數，計算每百萬條閱讀映射的轉錄本（Transcript per million，TPM）值，以log2（TPM+1）值表述紫花苜蓿MsNAC基因不同非生物脅迫下的響應模式，并利用TBtools進行可視化［31］。

植物材料為‘中苜1號’紫花苜蓿，于2023年10月種植于蛭石∶泥炭=1∶1的基質中，置于人工氣候箱中，光周期為光照∶黑暗=16 h∶8 h，培養溫度為25℃，濕度為60%。待幼苗生長至4周齡，取出植株于1/2 Hoagland營養液中緩苗24 h，于1/2 Hoagland營養液中分別進行干旱脅迫（15% PEG-6000）、鹽脅迫（250 mmol·L-1 NaCl）和ABA處理（150 μmol·L-1）。分別取脅迫處理不同時間下（0 h，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h）紫花苜蓿幼苗同一部位葉片提取RNA進行qRT-PCR分析。

總RNA提取采用植物RNA提取試劑盒（0416-50，北京華越洋生物科技有限公司），利用Nanodrop 2000檢測RNA濃度，利用PrimeScriptRTreagen kit with gDNA eraser（Perfect Real Time）（RR047，TaKaRa）將總RNA反轉錄成cDNA。利用Primer 5設計引物，引物列表見表1，其中MsActin為內參基因。qRT-PCR采用Bio-Rad CFX96系統，每個反應體系含有cDNA模板1 μL、上下游引物各0.5 μL、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）10 μL和ddH2O 7 μL。qRT-PCR反應循環條件為：95℃，30 s；95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，10 s；40個循環。試驗設置3次重復，基因相對表達量使用差異倍數（Fold change，FC）=2-ΔΔCt方法計算。

1.8 數據處理

qRT-PCR數據使用Excel 2022及SPSS 26.0軟件進行整理分析。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿NAC家族候選基因鑒定

在‘中苜4號’紫花苜?；蚪M中鑒定NAC基因家族成員，通過HMM及結構域分析，共鑒定出143個非冗余MsNAC基因，按照在染色體上的分布位置依次命名為MsNAC001～MsNAC143（表2）。對紫花苜蓿MsNAC蛋白的理化性質及亞細胞定位分析結果表明，MsNAC的理化性質存在較大差異，其中分子量最大的是MsNAC016，編碼1034個氨基酸，分子量為117.27 kDa，分子量最小的是MsNAC123，編碼150個氨基酸，分子量為17.60 kDa。蛋白疏水性指數介于-1.02（MsNAC067）和-0.05（MsNAC010）之間，表明MsNAC蛋白均為親水性蛋白。蛋白質理論等電點（Isoelectric point，pI）介于4.16（MsNAC056）和10.24（MsNAC041）之間，70個（48.9%）MsNAC蛋白為酸性蛋白（pIlt;6.5），55個（38.4%）MsNAC蛋白為堿性蛋白（pIgt;7.5）。對MsNAC蛋白進行亞細胞定位預測，發現MsNAC蛋白主要定位于細胞核中，共有139個MsNAC定位于細胞核中，占總數的97.2%，少數定位于細胞質、葉綠體中，如MsNAC004定位于細胞質中，MsNAC003，MsNAC010，MsNAC121定位于葉綠體中，推測大多數MsNAC轉錄因子在細胞核中發揮生物學功能（表2）。

2.2 紫花苜蓿MsNAC基因家族保守基序及結構域分析

利用MEME工具對紫花苜蓿保守基序（Motif）進行預測分析，依次命名為Motif1～Motif10（圖1A）。如圖1B所示，保守基序在不同MsNAC蛋白中存在分布差異，大多數Motif保守程度較高，少部分Motif存在特異性。其中Motif1存在于絕大多數MsNAC成員中，僅MsNAC068及MsNAC079中不存在Motif1，除MsNAC033，MsNAC052，MsNAC064，MsNA-C105及MsNAC112外，其余成員都擁有Motif3，其中Motif8，9，10在MsNAC中保守性較差，分別只存在于11，12及38個MsNAC成員中，大多數MsNAC成員都包含Motif1～Motif7。

保守結構域分析表明，MsNAC家族成員共鑒定出7種結構域，其中所有MsNAC蛋白都含有NAM結構域，而MsNAC121含有Glyco_hydro_100結構域，Glyco_hydro_100結構域主要存在于堿性蔗糖轉化酶基因INV（Invertase）中，該基因能夠將蔗糖水解為葡萄糖和果糖，并且參與糖分運輸，從而調控植株生長發育及響應非生物脅迫［32］。MsNAC044和MsNAC050含有Zinc_peptidase結構域，而MsNAC115，MsNAC129和MsNAC056分別具有PHA02682和PHA03269結構域，MsNA-C127和MsNAC035，MsNAC043分別具有RPA_2b-aaRSs_OBF和LIM結構域（圖1C），LIM結構域蛋白是一種肌動結合蛋白，在植物生長發育過程中可促進肌動蛋白束的形成［33］。這些結構域可能賦予這些MsNAC基因特殊的生物學功能。

利用TBtools對MsNAC基因家族成員進行基因結構可視化分析，結果顯示MsNAC基因的外顯子數目在2～17個之間，其中外顯子數目在3～6個的MsNAC成員有124個，MsNAC16基因含有17個外顯子，MsN-AC11，MsNAC38，MsNAC88，MsNAC97，MsNAC101，MsNAC123，MsNAC143基因僅含有2個外顯子（圖2）。

2.3 紫花苜蓿MsNAC家族系統進化分析

為進一步研究紫花苜蓿MsNAC基因家族的進化關系，對紫花苜蓿MsNAC蛋白與模式植物蒺藜苜蓿的NAC蛋白構建系統進化樹。結果表明，紫花苜蓿的143個MsNAC蛋白被分為8個亞族。其中第Ⅴ亞族包含的NAC家族成員最多，包含34個MsNAC及35個MtNAC。第Ⅱ亞族包含的NAC家族成員最少，包含12個MsNAC及4個MtNAC。在Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ和Ⅶ亞族中，MsNAC成員與MtNAC成員較均勻分布，而在第Ⅰ，Ⅷ亞族中MsNAC成員明顯多于MtNAC成員（圖3）。綜上，紫花苜蓿MsNAC家族成員與蒺藜苜蓿MtNAC家族成員分布較為均勻，顯示紫花苜蓿與蒺藜苜蓿親緣關系較近且存在相似蛋白質。

2.4 紫花苜蓿MsNAC基因啟動子順式作用元件分析

為進一步探究MsNAC基因的生物學功能，對MsNAC基因起始密碼子（ATG）上游2000 bp進行預測及分析，共鑒定出包括脫落酸響應元件、水楊酸響應元件、赤霉素響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、應急防御響應元件等22種順式作用元件，其中共有108個MsNAC基因啟動子上含有脫落酸響應元件，134個MsNAC基因含有光響應元件，66個成員含有應急防御響應元件，99個成員含有茉莉酸甲酯響應元件，7個成員含有細胞周期調控元件，54個成員擁有低溫響應元件，65個成員擁有MYB結合位點響應干旱脅迫的順式作用元件（圖4），這些順式作用元件可能在MsNAC參與非生物脅迫及生長發育過程中起到關鍵作用。

2.5 紫花苜蓿MsNAC基因染色體定位及共線性分析

依據紫花苜蓿MsNAC基因在染色體上的位置及順序依次命名，由染色體定位圖可知（圖5），133個MsNAC基因不均勻地定位到32條染色體上，chr8.1染色體上分布的MsNAC基因最多，每條染色體含有至少2個MsNAC基因，另外，有10個MsNAC基因未定位到紫花苜蓿染色體上。

利用MCScanX軟件分析MsNAC家族成員的共線性關系，如圖6所示，在紫花苜蓿MsNAC基因家族中共鑒定出40個基因片段重復事件，表明MsNAC基因在進化過程中發生了一定的基因復制事件，使得MsNAC基因家族迅速擴張。

在此基礎上，為進一步探究NAC基因家族在不同植物進化過程中基因的親緣關系，對紫花苜蓿以及大豆、蒺藜苜蓿、擬南芥中的NAC基因進行共線性分析。結果表明，49個MsNAC基因與擬南芥存在共線性關系，72個MsNAC基因與大豆存在共線性關系，73個MsNAC基因與蒺藜苜蓿存在共線性關系（圖7）。紫花苜蓿NAC基因與蒺藜苜蓿和大豆親緣關系更近，說明進化過程中NAC基因在豆科植物中保守演替。

2.6 紫花苜蓿MsNAC基因在不同組織及非生物脅迫處理下的表達模式分析

為探究MsNAC基因在紫花苜蓿不同組織中的表達模式，利用‘中苜1號’紫花苜蓿RNA-seq數據進行分析。如圖8A所示，有12個MsNAC基因在花中有較高的表達水平，其中MsNAC040及MsNAC054的表達量明顯高于其他紫花苜蓿MsNAC基因；有18個MsNAC基因在莖中具有較高的表達量，其中MsNAC057及MsNAC042在莖中的表達量最高；有17個MsNAC基因在葉片中有較高的表達水平，MsNAC031及MsNAC065在葉中擁有最高的基因表達量，而在花中的表達量最低，說明發生基因重復事件的基因具有相似的組織表達模式。另外，有6個MsNAC基因在花、莖、葉中的表達量無顯著差異。大部分MsNAC基因在紫花苜蓿不同組織中均有表達但存在組織特異性，說明MsNAC基因功能存在多樣性，在調控紫花苜蓿生長發育過程中起到重要作用。

為進一步分析MsNAC基因在不同非生物脅迫下的響應模式，分析了MsNAC在干旱、鹽及脫落酸脅迫處理下的RNA-seq轉錄組數據［34］。結果顯示，不同MsNAC在不同非生物脅迫處理下存在不同的響應模式。干旱脅迫下，隨著脅迫時間的延長，MsNAC036，MsNAC025，MsNAC070和MsNAC-006基因的表達量逐漸升高，在24 h達到最大值，而MsNAC040，MsNAC056，MsNAC037和MsNA-C098基因的表達量降低，MsNAC057，MsNAC042和MsNAC074等基因的表達量呈現先升高后降低的趨勢（圖8B）。在鹽脅迫下，隨著脅迫時間的延長，MsNAC036，MsNAC044等基因的表達量上調，MsNAC042，MsNAC129和MsNAC019等基因的表達量下調，MsNAC015，MsNAC094等基因的表達量呈現先降低后升高的趨勢（圖8C）。在ABA處理下，隨著處理時間的延長，MsNAC139，MsNA-C063和MsNAC031等基因的表達量上調，MsNAC088，MsNAC118等基因的表達量下調，MsNAC013，MsNAC057和MsNAC050等基因表達量呈現先升高后降低的趨勢（圖8D）。另外，部分基因在不同脅迫處理下表達模式相似，如MsNAC036，MsNAC025和MsNAC044等基因在干旱脅迫和鹽脅迫下均隨著脅迫時間的增加呈現上調表達的趨勢，MsNAC040，MsNAC129等基因在干旱脅迫和鹽脅迫下隨著脅迫時間的增加均下調表達。表明MsNAC基因可能在紫花苜蓿響應不同非生物脅迫過程中發揮重要作用。

為進一步確認紫花苜蓿MsNAC基因在非生物脅迫下的表達模式，選取了9個MsNAC基因驗證其對干旱、鹽脅迫和ABA處理的響應情況。如圖9所示，在干旱脅迫下，隨著脅迫時間增加，MsNAC045，MsNAC138基因呈上調表達，MsNAC042，MsNAC053，MsNAC056和MsNA-C074基因表達量呈現先上調后下調的趨勢；MsNAC006，MsNAC036和MsNAC128基因的表達量呈現先上調后下調再上調的趨勢，其中MsNAC036，MsNAC045，MsNAC056，MsNAC128和MsNAC138基因的表達量在干旱脅迫下顯著上調，說明其在紫花苜蓿干旱脅迫應答中可能發揮重要作用。在鹽脅迫下，隨著脅迫時間增加，MsNAC036，MsNAC042和MsNAC045基因先上調表達而后下調表達；MsNAC006，MsNAC053，MsNAC056，MsNAC074，MsNAC128和MsNAC-138基因表達量波動較大，但總體對鹽脅迫有響應，其中MsNAC045基因的表達趨勢與轉錄組熱圖分析一致（圖10）。在ABA處理下，MsNAC074基因表達量隨著脅迫處理時間增加呈現上調表達趨勢，在24 h達到最大值；MsNAC006，MsNAC036，MsNAC045，MsNAC053，MsNAC056和MsNA-C128基因表達量隨脅迫處理時間的延長波動較大，MsNAC042，MsNAC138基因表達量呈現先上調后下調的趨勢（圖11）。

3 討論

NAC作為植物特有轉錄因子，在植物生長發育及響應脅迫過程中發揮作用，如紫花苜蓿MsNAC051能夠與MsP5CS和MsPOD-P7的啟動子區域相結合，直接激活其表達，增強煙草的抗旱性［35］。目前已在可可（Theobroma cacao）及蒺藜苜蓿中分別鑒定出102及97個NAC基因［36-37］，本研究在紫花苜?！熊?號’基因組中鑒定出143個MsNAC基因，分布在32條染色體上，明顯多于擬南芥［15］及蒺藜苜蓿中鑒定到的NAC基因數量，可能是因為紫花苜蓿為同源四倍體，擁有更多同源基因。

紫花苜蓿和蒺藜苜蓿NAC基因系統發育分析可知，MsNAC基因聚類到8個亞家族中，其中第V家族包含最多的MsNAC成員，位于同族的MsNAC成員擁有相似的Motif及基因結構，在辣椒（Capsicum annuum）［38］及梅花（Prunus mume）［39］中都有相似現象，說明MsNAC基因在進化過程中較為保守。亞細胞定位預測分析表明，大多數MsNAC蛋白定位在細胞核中，說明MsNAC蛋白主要在細胞核中發揮功能，與擬南芥AtNAC蛋白的亞細胞定位結果相似［20］。同時，基因共線性分析表明紫花苜蓿MsNAC基因與大豆及蒺藜苜蓿NAC基因在進化過程中親緣關系更近，表明NAC基因在豆科植物進化過程中相對保守，說明了紫花苜蓿與蒺藜苜蓿等有更近的親緣關系，在紅車軸草［40］（Trifolium pratense）中有類似結果。相同基因功能域預示著可能發揮類似的生物學功能。紫花苜蓿MsNAC蛋白與辣椒［38］、草莓［12］、玉米［16］的NAC蛋白都擁有典型的NAM結構域，說明MsNAC蛋白可能在紫花苜蓿響應非生物脅迫及生長發育等方面發揮作用。不同基因結構也影響基因的表達及蛋白質的功能，大多數MsNAC基因的外顯子數量在3～6個，但序列長度不同，說明MsNAC的基因結構較為相似，并且與擬南芥及蒺藜苜蓿NAC基因結構相似。

基因啟動子區域的順式作用元件預示著該基因可能在不同脅迫下發揮不同的生物學功能，MsNAC基因在啟動子區域含有多個與植株生長發育及逆境響應相關的順式作用元件，可能與紫花苜蓿抵抗非生物脅迫有重要關聯［36］。如MsNAC001，MsNAC50，MsNAC079和MsNAC106基因含有脫落酸及生長素響應元件，與紫花苜蓿MsNAC051研究結果相似［35］。表明它們可能在多種激素應答及生理代謝過程發揮作用，而MsNAC034及MsNAC085擁有干旱響應元件及應急防御響應元件，說明它們可能在植物抵御干旱脅迫過程中發揮重要作用。

NAC基因在其他物種中的功能也有研究，在水稻中，OsNAC3是鹽脅迫及ABA信號傳導的重要調控因子［41］；有研究表明，GmNAC1～4是調控大豆根瘤高氮響應的中心調控因子［42］；在擬南芥中，AtNAC096與ABF2及ABF4相互作用，激活擬南芥對干旱及滲透脅迫中ABA誘導基因的表達［43］；香蕉（Musa acuminata）中MaNAC1隨著冷脅迫時間的增加，表達量升高，說明MaNAC1是參與香蕉響應冷脅迫的重要基因［44］。

本試驗通過生物信息學方法，將鑒定出的MsNAC與轉錄組數據庫進行整合，分析出與干旱、鹽、ABA處理有關的MsNAC基因家族成員，同時通過分析紫花苜蓿在干旱、鹽和ABA處理后MsNAC基因的表達模式，表明MsNAC可能參與多種脅迫響應。其中，大多數MsNAC在干旱、鹽及ABA處理下呈上升趨勢，僅少量MsNAC呈下降趨勢，如MsNAC128及MsNAC138在干旱脅迫24 h后達到最大值，而MsNAC042及MsNAC074在干旱脅迫12 h后達到最大值，與山茶CsNAC9表達模式相似［45］；大多MsNAC基因在鹽脅迫處理后在12 h達到最大值，表明他們擁有相似的表達模式，MsNAC138在鹽脅迫下與ZmNAC59表達水平相似［45］；而MsNAC128在ABA處理后在24 h表達量下調，MsNAC053及MsNAC056在ABA處理下與CsNAC9響應模式相似，說明它們可能參與脫落酸調控植物生長發育［45］。隨后用qRT-PCR驗證了MsNAC基因能夠響應干旱、鹽脅迫及ABA處理，說明MsNAC基因是紫花苜蓿抵抗非生物脅迫的重要基因，參與紫花苜蓿響應非生物脅迫的應答過程。本研究可為后續針對紫花苜蓿進行抗逆性改良提供候選基因。

4 結論

本研究從‘中苜4號’紫花苜?；蚪M中鑒定出143個擁有完整NAM結構域的MsNAC基因，被分為8個亞族，大都含有3～6個外顯子并在其啟動子區域含有大量響應脫落酸、生長素等激素及干旱和寒冷等脅迫的順式作用元件。同時鑒定出40個基因重復事件，并與蒺藜苜蓿、大豆及擬南芥存在共線性關系。MsNAC基因在紫花苜蓿中存在組織特異性表達，參與調控紫花苜蓿對干旱、鹽、ABA的響應過程，并在干旱、鹽脅迫及ABA處理后大都上調表達，其中MsNAC036，MsNAC045及MsNAC053是響應干旱及鹽脅迫的關鍵基因。

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（責任編輯 閔芝智）