大狼毒次生代謝物分析及主要物質化感效應研究

摘要：為探究有毒植物大狼毒（Euphorbia jolkinii） 含有的主要化感活性物質及化感效應，本試驗運用超高效液相色譜-串聯質譜技術（UPLC-MS/MS） 對大狼毒次生代謝物進行分析，并采用生物測試法，開展3種代表性次生代謝物對多年生黑麥草（Lolium perenne） 和紅三葉（Trifolium pratense） 種子萌發及幼苗生長的影響研究。結果表明：大狼毒根、莖葉分別含有898種和1025種次生代謝物，分屬酚酸類、氨基酸及其衍生物、脂質、黃酮和生物堿等。4-硝基苯酚、奎寧酸和2-苯乙胺等代謝物在根、莖葉中均有檢測到且相對豐度較高，對多年生黑麥草和紅三葉種子萌發及生長均起到顯著的抑制作用（Plt;0.05），抑制效果存在代謝物差異和“濃度效應”，以4-硝基苯酚抑制最強，2-苯乙胺次之，奎寧酸最弱。綜上，大狼毒植株體內次生代謝物種類多，其中4-硝基苯酚和2-苯乙胺等代謝物化感效應較明顯，為大狼毒潛在化感活性物質資源化開發利用提供參考依據。

關鍵詞：大狼毒；次生代謝物；種子萌發；幼苗生長；化感效應

中圖分類號：S481""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）08-2599-08

Analysis and Study of Secondary Metabolites and Allelopathic Effects of

Main Substances of Euphorbia jolkinii

DUAN Rui1#， LUO Qin1#， XIAO Xue1， NIU Qiong-mei1， LIU Yang2，

GUI Bao-lin3， ZHONG Li-qiong4， CHU Xiao-hui1*， SHAN Gui-lian1*

（1. Department of Grassland Science， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan Province 650201， China;

2. Forestry and Grassland Bureau of Yunnan Province， Kunming， Yunnan Province 650224， China; 3. Soil and Fertilizer

Workstation， Xundian County Agriculture and Rural Bureau，Xundian， Yunnan Province 655200， China; 4. Agricultural

Comprehensive Service Center of Yangjie Town in Xundian County， Xundian， Yunnan Province 655209， China）

Abstract：In order to investigate the main allelopathic active substances and allelopathic effects of toxic plant Euphorbia jolkinii，we used UPLC-MS/MS to analyse the secondary metabolites of E. jolkinii and bioassay to carry out a study on the effects of three representative secondary metabolites on seed germination and seedling growth of Lolium perenne and Trifolium pratense. The results showed that the roots，stems and leaves of E. jolkinii respectively contained 898 and 1 025 secondary metabolites，which belonged to phenolic acids，amino acids and their derivatives，lipids，flavonoids，alkaloids，organic acids，etc. 4-nitrophenol，quinic acid and 2-phenylethylamine were all detected in roots，stems and leaves with relatively high abundance，and had significant inhibitory effects on seed germination and growth of Lolium perenne and Trifolium pratense （Plt;0.05）. The inhibitory effects existed in the differences of metabolites and the \"concentration effect\"，with 4-nitrophenol inhibiting the strongest，following by 2-phenylethylamine and quinic acid. In conclusion，there were many types of secondary metabolites in E. jolkinii plants，among which 4-nitrophenol and 2-phenylethylamine had obvious allelopathic effects，which provided reference for resource utilization of potential allelopathic active substances in E. jolkinii.

Key words：Euphorbia jolkinii;Secondary metabolite;Seed germination;Seedling growth;Allelopathic effect

大狼毒（Euphorbia jolkinii） 為大戟科大戟屬多年生草本植物，廣泛分布于滇西北亞高山草甸、山坡、灌叢等地［1-3］。該物種根系發達，全株具有毒性，抗寒抗旱性強，其在退化草地上的滋生蔓延會導致伴生植物密度下降，生物量降低［4-5］，進而引起草地群落結構發生改變，嚴重影響當地草地畜牧業發展和生物多樣性保護。

化感作用（Allelopathy） 是植物或微生物的代謝分泌物（化感物質）對周圍環境中其他植物或微生物有利或有害的作用。化感物質大致可歸為水溶性有機酸、脂類、長鏈脂肪酸和多炔、醌類、氨基酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素、黃酮、單寧、萜烯和甾族化合物、氨基酸和多肽、生物堿和氰醇、硫化物和芥子油苷和嘌呤和核酸等14類［6］，其作為植物化感作用的媒介，通過揮發、雨霧淋溶、殘體或凋落物分解和根系分泌等自然途徑釋放并進入環境，被受體植物吸收而起作用［7］。

化感作用是毒害草占據入侵地群落優勢地位的有效工具［8-10］。就滇西北亞高山草甸“霸主”植物大狼毒而言，課題組前期研究發現大狼毒根、莖葉浸提液含有的化感物質會打破受體植物的生理平衡［11］，抑制其幼苗激素合成［3］，影響受體植物的種子萌發和幼苗生長。除化感作用外，課題組前期通過測定大狼毒入侵及非入侵地土壤微生物種類及群落結構，發現大狼毒會通過向土壤環境釋放化感物質的方式改變入侵地土壤微生物優勢菌組成、占比及群落結構［12］。前期的這些研究結果充分說明化感作用是造成大狼毒入侵擴散區草地植物多樣性下降的原因之一。然而，大狼毒植株體內究竟含有哪些主要化感活性物質？這些次生代謝物化感強度如何？據此，本研究采集旺盛生長期大狼毒植株，運用UPLC-MS/MS對其體內含有的次生代謝物進行測定。根據測定結果，選取4-硝基苯酚、2-苯乙胺和奎寧酸3種代表性次生代謝物，采用生物測試法開展其對多年生黑麥草（Lolium perenne） 和紅三葉（Trifolium pratense） 的化感強度。通過研究探討大狼毒主要化感活性物質及其化感強度，為大狼毒潛在化感活性物質資源化開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 大狼毒植株的獲取 2022年8月中上旬大狼毒生長旺盛期，于云南省迪慶州香格里拉市托木南國家級草原固定監測樣點（27°29′00″N，99°52′16″E） 挖取3年生以上大狼毒完整植株，將根和莖葉分開，洗凈，置于干冰中封存送至北京百邁克生物科技有限公司，運用UPLC-MS/MS對其次生代謝物進行鑒定。

1.1.2 受體材料來源及特性 受體材料為‘麥迪’多年生黑麥草（L. perenne ‘Mathilde’，千粒重約3.17 g，純凈度98%） 和‘炫麗’紅三葉（T. pratense ‘Brilliant’，千粒重約1.68 g，純凈度98%），由北京正道種業有限公司提供。

1.2 試驗設計

本試驗運用UPLC-MS/MS對大狼毒根、莖葉中的次生代謝物進行檢測，根據測定結果，明確大狼毒次生代謝物。依據相對定量值及其物質類別，從相對豐度排名前30的物質中篩選出根、莖葉均有檢測到的具有化感活性的3大類物質，分別為：酚酸類（4-硝基苯酚）、生物堿（2-苯乙胺）和有機酸（奎寧酸），以分析純化學試劑代替其進行化感強度的生物測試［13］。

開展3種主要次生代謝物化感強度的生物測試時，依據預試驗及各次生代謝物的豐度，將4-硝基苯酚的濃度設定為0（設為對照），10，30，50，70 mg·L-1，2-苯乙胺的濃度設定為0（設為對照），100，400，800，1200 μL·L-1，奎寧酸的濃度設定為0（設為對照），100，400，800，1200 mg·L-1，每個處理設3次重復。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 大狼毒次生代謝物測定 將大狼毒根、莖葉樣品置于凍干機中真空冷凍干燥，然后用研磨機研磨成粉末。稱取100 mg粉末，溶于1.2 mL70%甲醇提取液中，每30 min渦旋一次，每次持續30 s，共6次。將樣品置于4℃冰箱中過夜，離心，吸取上清液并用微孔濾膜過濾，儲存在注射瓶中按照儀器工作條件測定。

液相條件主要包括：色譜柱：Agilent SB-C18 （2.1 mm∶100.0 mm，1.8 μm）；流動相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%，9.00 min內B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00—11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40℃；進樣量4 μL。

質譜條件主要包括：LIT和三重四極桿（QQQ） 掃描是在三重四極桿線性離子阱質譜儀（Q TRAP），AB6500 Q TRAP UPLC/ MS/ MS系統上獲得的，該系統配備了ESI Turbo離子噴霧接口，可由Analyst 1.6.3軟件（AB Sciex） 控制運行正負兩種離子模式。

基于百邁客平臺代謝數據庫，對樣本的代謝物進行了質譜定性定量分析。通過三重四級桿篩選出每個物質的特征離子，在檢測器中獲得特征離子的信號強度（CPS），用MultiaQuant軟件打開樣本下機質譜文件，進行色譜峰的積分和校正工作。

1.3.2 主要次生代謝物化感強度測定 采用培養皿濾紙法進行種子萌發試驗。分別挑選100粒飽滿種子，用2%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，浸泡20 min，用自來水沖洗3次，蒸餾水沖洗2次，放入培養皿中，以雙層濾紙作為培養基，用相應濃度的次生代謝物溶液濕潤濾紙，在溫度（25±1）℃，14 h光照/10 h黑暗，光強6000 lx的人工智能光照培養箱中進行發芽試驗。每處理設置3次重復。發芽試驗開始時添加3 mL相應濃度的次生代謝物溶液（對照組添加等量蒸餾水），逐日觀察記錄發芽種子并補充蒸發的水分，使各處理液濃度維持不變，計數持續進行到經過3 d再無種子發芽為止。發芽結束后參照李春英等［14］的方法計算發芽率。參照單貴蓮等［3］的方法取樣測定單株鮮重、株高和根長。

1.4 數據處理

采用Excel 2016軟件進行數據處理及作圖，用SPSS 27.0統計軟件對數據進行One-way ANOVA方差分析及Duncan多重比較。

2 結果與分析

2.1 大狼毒次生代謝物分析

如表1所示，通過對大狼毒生長旺盛期的根、莖葉進行分析，檢測出大狼毒根部含有898種次生代謝物，莖葉含有1025種次生代謝物，它們分屬于酚酸類、氨基酸及其衍生物、脂質、黃酮、生物堿、有機酸、核苷酸及其衍生物、木脂素和香豆素、鞣質、萜類、醌類和其他類12大類。其中，以酚酸類數量最多，其在根、莖葉中的種數分別有190種和220種，分別占總量的21.158%和21.463%；其次是氨基酸及其衍生物和脂質，分別有129種和174種，分別占總量的14.365%和16.976%；脂類和黃酮類物質種類也較多，相對占比在12%以上。

表2是依據總離子流程圖各色譜峰篩選獲得的大狼毒根、莖葉中豐度前30的次生代謝物。由表2可知，在大狼毒根和莖葉兩個組織中次生代謝物有所不同，具體如下：大狼毒根部豐度前30的次生代謝物包含酚酸類（10種），有機酸（4種），鞣質（4種），脂質（3種），氨基酸及其衍生物（3種），生物堿（2種），核苷酸及其衍生物（1種），以及其他類（3種）。大狼毒莖葉中豐度前30的次生代謝物包含酚酸類（9種），氨基酸及其衍生物（7種），黃酮（5種），生物堿（4種），脂質（2種），有機酸（1種），木脂素和香豆素（1種），以及核苷酸及其衍生物（1種）。可以看出酚酸類、氨基酸及其衍生物、生物堿、有機酸、脂質五大類物質是大狼毒根、莖葉均有檢測到且含量最高的次生代謝物，其中4-硝基苯酚、L-正亮氨酸*、2-苯乙胺、棕櫚醛、奎寧酸是共有且豐度最高的酚酸類、氨基酸及其衍生物、生物堿、脂質、有機酸代表物質。

2.2 大狼毒主要次生代謝物化感效應研究

2.2.1 酚酸類代表物質化感效應研究 由圖1可知，與對照相比，添加質量濃度為10，30，50，70 mg·L-1的酚酸類代表物質4-硝基苯酚顯著降低了多年生黑麥草和紅三葉種子的發芽率（添加10 mg·L-1對多年生黑麥草發芽率的影響除外），降低幅度隨溶液濃度升高而增加（Plt;0.05）。

由表3可知，與CK相比，低于50 mg·L-1的4-硝基苯酚溶液的添加對多年生黑麥草地上部的生長有一定的促進作用，濃度增加至70 mg·L-1時，多年生黑麥草幼苗受到顯著抑制。具體為：10 mg·L-1的濃度顯著增加了多年生黑麥草的單株鮮重（Plt;0.05），30，50 mg·L-1的濃度顯著促進了多年生黑麥草的株高（Plt;0.05），70 mg·L-1的濃度顯著降低了多年生黑麥草的單株鮮重、株高和根長（Plt;0.05）。與CK相比，10，30 mg·L-1的4-硝基苯酚溶液的添加顯著降低了紅三葉單株鮮重、株高和根長（Plt;0.05），降低幅度隨溶液濃度的增加而增加，濃度增加至50 mg·L-1時，紅三葉幼苗無法存活。

2.2.2 生物堿類代表物質化感效應研究 由圖2可知，與對照相比，添加質量濃度為100，400，800，1200 μL·L-1的生物堿類代表物質2-苯乙胺顯著降低了2種牧草種子的發芽率（添加100 μL·L-1對紅三葉發芽率的影響除外），降低幅度隨溶液濃度的升高而增加（Plt;0.05）。

由表4可知，與CK相比，低于800 μL·L-1的2-苯乙胺溶液的添加對多年生黑麥草地上部的生長有一定的促進作用，濃度添加至1200 μL·L-1時，多年生黑麥草幼苗生長受到顯著抑制。400 μL·L-1的濃度顯著促進了多年生黑麥草的株高（Plt;0.05），1200 μL·L-1的濃度顯著降低了多年生黑麥草的單株鮮重和根長（Plt;0.05）。與CK相比，100，400 μL·L-1的2-苯乙胺溶液的添加顯著降低了紅三葉單株鮮重、株高和根長（Plt;0.05），降低幅度隨溶液濃度的增加而增加，濃度增加至1200 μL·L-1時，紅三葉幼苗無法存活。

2.2.3 有機酸類代表物質化感效應研究 由圖3可知，與對照相比，添加質量濃度為100，400，800，1200 mg·L-1的有機酸類代表物質奎寧酸顯著降低了多年生黑麥草種子的發芽率，降低幅度隨濃度升高而增加（Plt;0.05）。就紅三葉種子萌發結果來看，與CK相比，低于800 mg·L-1的奎寧酸溶液的添加顯著提高了紅三葉種子發芽率，當濃度增加至1200 mg·L-1時，紅三葉種子發芽率顯著降低（Plt;0.05）。

由表5可知，與CK相比，低于800 mg·L-1的奎寧酸溶液的添加對多年生黑麥草地上部的生長有一定的促進作用，濃度增加至1200 mg·L-1時，多年生黑麥草幼苗生長受到顯著抑制。具體為：100 mg·L-1的濃度顯著促進了多年生黑麥草的株高（Plt;0.05），1200 mg·L-1的濃度顯著降低了多年生黑麥草的單株鮮重和根長（Plt;0.05）。與CK相比，當濃度增加至1200 mg·L-1時，奎寧酸溶液的添加顯著降低了紅三葉的單株鮮重和根長（Plt;0.05），但不同濃度奎寧酸溶液的添加對紅三葉株高無顯著影響。

3 討論

化感物質是植物在生長發育中產生的次生代謝物質［15］。植物次生代謝物在其生長發育時并不是必需的但卻是其與環境相互作用不可缺少的［16-17］，它通過影響受體植物的生理生化活動而實現其化感作用［18］。因此，探究化感作用機制的關鍵就是分析其化感活性物質。本研究檢測出大狼毒植株體內含有1000余種次生代謝物，它們分屬12大類，以酚酸類數量最多，種類占比21%以上，酚酸類次生代謝物中又以4-硝基苯酚豐度最高。酚酸類物質是植物中最常見的化感物質，對植物生長和土壤活性具有破壞性的影響［19］。酚酸類次生代謝物能顯著抑制植物種子萌發及幼苗生長，并引起土壤微生物群落結構發生變化［20-23］。化感效應的強度與來源部位也有關。大狼毒根浸提液對受體植物萌發生長抑制強度大于莖葉浸提液［11，24］。本研究結果發現，在豐度前30的次生代謝物中大狼毒根系的酚酸類物質高于莖葉，這可能是次生代謝物在植物組織中分布不均衡，合成和釋放存在不同，導致根部和莖葉組織中的化感物質有所差異進而影響其化感強度。

種子萌發及幼苗生長抑制試驗是鑒定化感作用存在的最常用方法［25］。化感物質通過影響受體生物膜系統，改變酶及其他蛋白質的活性，調控激素的合成，影響種子的吸脹作用，進而造成細胞傷害，植物體內活性氧自由基代謝失衡，導致膜系統結構、功能受損，最終表現為種子萌發及幼苗生長均受影響［24，26-28］。化感作用還具有一定的濃度效應，低濃度的化感物質可能會促進植物生長，但當其累積量高于某一濃度閾值時就會產生抑制作用，同一種次生代謝物下，不同濃度和受體材料其化感敏感性也存在差異［29-30］。本研究表明，酚酸類代表物質4-硝基苯酚對受體植物的萌發生長均具有顯著抑制作用，高濃度下抑制強度增強，且多年生黑麥草較紅三葉更耐化感。此研究結果與宋亮等［22］、陶茸等［23］研究得出酚酸類次生代謝物對受體植物萌發生長均具有化感自毒作用，抑制效應與濃度顯著相關的結果基本一致。2-苯乙胺和奎寧酸的添加對受體植物萌發及生長表現出明顯的低濃度下促進、高濃度下抑制的雙重作用，此結果與馬銀山等［31］、牛瓊梅等［32］研究受試牧草的化感響應中得出的結論相符，其原因可能是低濃度下的化感物質有限，未能有效抑制受體植物萌發及生長。

本研究通過檢測得出大狼毒植株體內次生代謝物種類多，組成較復雜，并對豐度較高的3種次生代謝物進行了生物活性檢測，表明這些次生代謝物具有化感效應。本研究僅開展了對2種受體試驗植物化感敏感性的比較，材料相對偏少，后續建議進一步開展有針對性的雜草受試材料對大狼毒化感耐受性的比較研究，以促進大狼毒植株體內潛在化感活性物質加以開發利用，為研發植物源新型除草劑提供參考依據。

4 結論

大狼毒植株含有12類1000余種次生代謝物，莖葉所含次生代謝物種類（1025種）高于根（898種）。4-硝基苯酚、奎寧酸、2-苯乙胺等次生代謝物在根、莖葉中均有檢測到且相對豐度較高，對多年生黑麥草和紅三葉均具有不同程度的抑制作用，4-硝基苯酚抑制效果最強，2-苯乙胺次之，奎寧酸最弱。推斷4-硝基苯酚和2-苯乙胺具有開發為植物源除草劑或成為除草劑中間體的潛力，今后需對相應的雜草進行試驗，并對其控草機制機理進行深入研究。

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（責任編輯 彭露茜）