偽結核棒狀桿菌滅活苗對山羊的免疫效果評價

摘要：偽結核棒狀桿菌（Cp）是羊體表膿腫及干酪樣淋巴結炎（CLA）的重要病原， 接種疫苗是防控Cp感染致病最有效的手段之一。 以Cp萬州株（WZ）作為疫苗株， 甲醛為滅活劑， ISA 201 VG為佐劑制備滅活苗， 對山羊進行免疫， 首免后28 d進行二免， 二免后30 d以WZ株攻毒， 連續觀察65 d。 通過檢測免疫和攻毒山羊的增質量、 體溫、 血常規、 血清免疫球蛋白G（IgG）水平、 淋巴結膿腫數量及載菌量等， 綜合評價Cp滅活苗的免疫保護效果。 結果顯示： 與對照組相比， 受免山羊血清IgG抗體在首免后第3、 4周和二免后第2～4周均顯著升高， 且二免IgG抗體明顯高于首免。 攻毒發現， 對照組山羊體溫在攻毒后7 d內均高于免疫組， 攻毒后1～8周內對照組山羊增質量均低于免疫組， 且免疫組山羊膿腫數量及Cp數均明顯少于對照組， 提示該滅活苗免疫可緩解因Cp感染引起的山羊體質量下降及體溫升高， 減少Cp攻毒引起的膿腫數量和淋巴結Cp載菌量。 綜合表明： 所制備Cp滅活苗可提高山羊的免疫水平， 對該病原感染具有較好的保護作用。

關"鍵"詞：偽結核棒狀桿菌； 滅活苗； 山羊； 免疫效果

中圖分類號：S852.61

文獻標志碼：A

文章編號：16739868（2025）01010408

Evaluation of Immune Effect of Corynebacterium pseudotuberculosis Inactivated Vaccine on Goats

ZOU Anlong，"LYU Hong，"WU Chanyu，"LI Xincan，SONG Yan，"QIAN Hongyu，"WANG Zhiying，"ZHOU Zuoyong

College of Veterinary Medicine， Southwest University， Rongchang Chongqing 402460， China

Abstract：Corynebacterium pseudotuberculosis （Cp） is an important pathogen responsible for surface abscesses and caseous lymphadenitis （CLA） of goats， and vaccination is one of the most effective methods to prevent and control Cp infection． In this study， Cp Wanzhou strain （WZ） was used as the vaccine candidate， formaldehyde as the inactivating agent， and ISA 201 VG as the adjuvant to prepare an inactivated vaccine． The goats were immunized with Cp vaccine for twice with 28 d interval， and were challenged with Cp WZ at 30th days after the second immunization． The goats were continuously observed for 65 d． The immunoprotective effect were evaluate by detecting the weight gain， temperature， routine blood， serum IgG levels， the number of lymph node abscesses and the bacterial load in the goats． The results showed that compared with the control group， the serum IgG antibodies of the immunized goats significantly increased at the 3rd and 4th weeks after the first immunization and 2-4 weeks after the 2nd immunization， and the IgG antibodies of the 2nd immunization were significantly higher than those of the 1st immunization． The temperature of goats in control was higher than that of the immuned goats within 7 days after the challenge． The weight gain of goats in control was lower than that of the immuned ones within 1-8 weeks， and the number of abscesses and Cp in the immuned goat group were significantly lower than that of the control． The above results suggested that inactivated vaccine immunization could alleviate the weight loss and the body temperature increase caused by Cp infection in goats， reduce the number of abscesses and Cp bacterial load in lymph node caused by Cp infection． In summary， the prepared Cp inactivated vaccine could improve the immune level of goats and had a good protective effect against Cp infection．

Key words： Corynebacterium pseudotuberculosis； inactivated vaccine； goats； immune effect

偽結核棒狀桿菌（Corynebacterium pseudotuberculosis， Cp）感染可引起小反芻動物山羊和綿羊干酪樣淋巴結炎（CLA）和體表淋巴結膿腫， 這是世界范圍內引起養羊業經濟損失的一種重要慢性傳染病［1］。 Cp感染山羊和綿羊不易直接造成死亡， 危害具有隱蔽性， 易被養殖者忽視， 這些危害主要包括： 生產性能下降、 體表或內臟器官形成膿腫及干酪樣病變， 以及作為人畜共患病病原具有傳播給人的潛在風險等。 近年來， 我國關于山羊和綿羊受Cp感染的報道不斷增多， 重慶［2］、 四川［3］、 云南［4］、 陜西［5-6］、 甘肅［6］、 湖南［7］、 福建［8］等多個省市均有該病原感染的報道， 所檢測膿腫樣本中Cp分離率有的高達100%， 因此， 在羊場中急需探索一種有效防控Cp的方法， 以降低或消除其感染造成的經濟損失。 在防治Cp感染致病的方法中， 因手術排膿治療過程繁瑣且易造成污染， 而抗生素等化學藥物治療存在藥物不易進入膿腫部位、 療效差等問題， 因此接種疫苗成為防控該病原感染的最佳手段［1］。 本研究以前期篩選出Cp萬州株（WZ）為制苗菌株［9］， 以ISA 201 VG為佐劑制備滅活苗， 對山羊進行免疫接種及攻毒評價試驗， 旨在為Cp疫苗研究提供數據支撐。

1"材料與方法

1.1"菌株、 試驗動物及主要試劑

Cp萬州株（WZ）由西南大學動物傳染病防控技術研究室分離鑒定和保存。 4月齡雄性大足黑山羊， 重慶市大足區騰達牧業有限公司； ISA 201 VG佐劑， Seppic； ELISA包被液， 索萊寶科技有限公司； 過氧化酶標記兔抗山羊抗體， Proteintech； 改良馬丁液體培養基， 青島高科園海博生物技術有限公司； 胎牛血清（FBS）， Biological Industries。

1.2"Cp滅活苗的制備與檢驗

挑取Cp萬州株（WZ）單菌落加入含10% FBS的馬丁肉湯中培養24 h， 按1∶20擴培至300 mL馬丁肉湯（含0.5%吐溫80和10% FBS）， 培養24 h。 稀釋涂板計數后， 將菌液用0.4%的甲醛滅活， 4 500 r/min離心15 min， 取培養上清用真空冷凍干燥機凍干濃縮， 并與菌體混合， 使菌體濃度達到1×1010 CFU/mL。 將滅菌的ISA 201 VG佐劑與菌液按體積比54∶46（油相∶水相）配制乳化， 制備Cp滅活苗備用。

1.3"山羊分組、 免疫及攻毒處理

將Cp感染抗體檢測陰性的6頭黑山羊隨機分為2組， 每組3頭。 采取頸背部皮下注射免疫方法進行2次免疫， 首免（1 mL/頭）后28 d二免（2 mL/頭）， 對照組在同樣位置注射滅菌生理鹽水。 二免后30 d進行攻毒， 連續觀察65 d。 免疫期間及攻毒后每周稱體質量、 首免及攻毒后7 d每天連續測量肛溫， 每周靜脈采血檢測血清抗體水平， 二免后21、 28 d和攻毒后7、 14 d采血測血常規。

1.4"免疫山羊血常規及血清抗體水平檢測

利用全自動血液細胞分析儀測量山羊的血常規。 參照文獻［9-10］， 準備ELISA包被用的Cp菌體和重組磷脂酶D蛋白（rPLD）， 將待檢血清稀釋512倍后， 分別以Cp菌體和rPLD包被ELISA板， 采用間接ELISA方法測定山羊血清IgG抗體水平以及抗PLD抗體水平。

1.5"免疫山羊攻毒保護評價

二免后30 d， 每只山羊以Cp萬州株（WZ）進行皮下攻毒（4×106 CFU/ mL， 不含菌液上清）， 在左側前、 后肢皮下2個不同部位分別注射0.5 mL。 攻毒后每天觀察山羊的精神狀態， 7 d內每天測量肛溫， 然后每周測量肛溫并稱體質量。 攻毒后65 d處死山羊， 解剖觀察各個臟器及淺表淋巴結（下頜淋巴結、 頸淺淋巴結、 髂下淋巴結、 腘淋巴結、 髖淋巴結、 腹股溝淋巴結、 腸系膜淋巴結）大體病變及膿腫情況。 分別采集淋巴結（除髖淋巴結及腘淋巴結分別取0.05 g及0.1 g外， 其余每個部位的淋巴結取0.25 g）、 內臟器官（肝臟、 脾臟、 腎臟、 肺臟取1.5 g）和攻毒部位膿腫（取0.1 g）加入1.5 mL滅菌生理鹽水中， 勻漿后涂布于5%鮮兔血瓊脂平板， 37 ℃培養48 h進行活菌計數。

1.6"數據分析

所有結果以x±s表示， 使用GraphPad Prism 8.0.1分析數據， 采用t檢驗分析差異的顯著性， p＜0.05表示差異有統計學意義。

2"結果與分析

2.1"皮下注射Cp滅活苗對注射部位的影響

對山羊皮下注射含ISA 201 VG佐劑的Cp滅活苗， 在注射后第7 d發現注射部位有皮膚破潰的跡象， 在注射疫苗后14 d， 發現注射部位有明顯的皮膚破潰， 在注射后21 d， 注射部位破潰有明顯恢復， 到注射疫苗后第49～56 d， 基本上完全恢復（圖1）， 而對照組注射部位無明顯變化。

2.2"Cp滅活苗免疫和攻毒對山羊體溫的影響

首免后第5、 6 d免疫組山羊平均體溫分別為40.60±0.24 ℃、 40.20±0.16 ℃， 顯著高于對照組39.57±0.05 ℃和39.43±0.05 ℃， 第7 d差異無統計學意義（圖2a）。 Cp攻毒后， 對照組山羊體溫連續7 d平均溫度為40.71±0.37 ℃， 最高達41.23±0.19 ℃， 均高于免疫組39.82±0.33 ℃， 其中在第2、 3、 5、 7 d達到顯著水平（圖2b）， 且第2周對照組山羊體溫39.70±0.16 ℃仍顯著高于免疫組山羊體溫39.27±0.05 ℃（圖2c）。

2.3"Cp滅活苗免疫和攻毒對山羊增質量的影響

首免后1～4周， 免疫組山羊增質量均高于對照組（圖3a）， 而二免后1～3周對照組增質量高于免疫組， 到第4周則免疫組增質量高于對照組， 差異無統計學意義（p＞0.05）。 Cp攻毒后第1～8周， 對照組山羊增質量均低于免疫組， 其中第1、 3、 5周差異有統計學意義（p＜0.05）， 且在攻毒后第1、 2周出現負增質量現象（圖3b）。

2.4"Cp滅活苗免疫和攻毒對山羊血常規的影響

對Cp滅活苗免疫及免疫攻毒后山羊血常規進行檢測， 發現免疫組山羊的白細胞數量高于對照組， 其中二免后28 d差異有統計學意義（p＜0.05）， 而攻毒后14 d， 免疫組和對照組白細胞數量幾乎相當（圖4）， 其他血常規指標差異無統計學意義（p＞0.05）。

2.5"Cp滅活苗免疫和攻毒對山羊IgG抗體的影響

以Cp菌體作為包被抗原， 檢測發現免疫組山羊IgG抗體均高于對照組， 且首免后第3、 4周和二免后第2～4周差異有統計學意義（p＜0.05）， 二免后山羊血清IgG抗體明顯高于首免（圖5a）。 攻毒后， 免疫組山羊IgG抗體均顯著高于對照組（圖5b）。 此外， Cp滅活苗免疫后免疫組山羊抗PLD抗體水平與對照組差異無統計學意義（p＞0.05）， 而Cp攻毒后， 免疫組和對照組山羊抗PLD抗體水平均明顯上升（圖5c）。

2.6"Cp滅活苗免疫山羊攻毒后各臟器及淋巴結膿腫結果

在整個攻毒試驗期內沒有山羊出現死亡。 攻毒后65 d對山羊進行剖檢， 發現免疫組僅有1只山羊的后肢攻毒部位皮下出現膿腫（數量為5個， 直徑0.2～1 cm）， 而對照組3只山羊均在后肢攻毒部位皮下發現了膿腫， 膿腫數量分別為15 個（直徑1.4～2.4 cm）、 13個（0.5～2 cm）和7個（0.5～2 cm）（圖6）。 此外， 在對照組山羊的下頜淋巴結及髂下淋巴結也發現了膿腫的存在。

2.7"Cp滅活苗免疫山羊攻毒后各臟器及淋巴結載菌量結果

對攻毒山羊各臟器Cp進行檢測， 發現免疫組和對照組山羊的肝、 脾、 肺和腎臟中均未檢測到Cp。 對免疫組唯一1只在攻毒部位出現膿腫的山羊樣本進行檢測， 發現其Cp量為1.06×109 CFU/g， 而對照組3只山羊在攻毒部位膿腫的Cp量分別為3.53×1010、 1.06×1010、 1.39×1011 CFU/g。 將對照組山羊中相應部位淋巴結混合檢測， 發現下頜淋巴結、 頸淺淋巴結和髂下淋巴結中均有Cp， 其載菌量分別為9.3×108、 9.0×104、 1.9×108 CFU/g， 在髖淋巴結、 腘淋巴結、 腹股溝淋巴結和腸系膜淋巴結均未檢測到Cp， 在免疫組所有上述淋巴結樣本中均未檢測到Cp。

3"討論與結論

3.1"討論

目前Cp在我國多個省市均有感染致病的報道， 特別是放養山羊發病率更高， 而該病原一旦在羊場中存在則極難根除， 因此無Cp的羊場如何預防、 存在Cp病例的羊場如何降低其感染發病數和減少經濟損失是急需養殖戶重視的問題。 接種疫苗是防控Cp的最佳手段， 國外已有的商品化滅活苗包括碩騰公司生產的Glanvac系列疫苗、 科羅拉多州血清公司生產的Caseous D-T和Case-Bac疫苗， 弱毒活疫苗有Labovet Produtos Veterinários生產的Vacina 1002和Vencofarma Lab生產的Linfovac［1］， 這些疫苗在防控Cp感染中發揮了重要作用。 目前， 我國尚無預防Cp感染的商品化疫苗， 一些學者以鋁膠、 ISA 206 VG、 白油等為佐劑制備Cp滅活苗， 通過小鼠［11-12］和/或山羊［12-13］進行免疫評價并取得了一定的免疫保護效果。

機體應對Cp感染的免疫十分復雜， 體液免疫和細胞免疫各自起到了一定的作用［14］。 我們發現所制備的Cp滅活苗免疫可誘導山羊血清IgG抗體顯著升高， 且二免后山羊IgG抗體明顯高于首免， 證明該滅活苗免疫山羊可產生明顯的體液免疫反應。 雖然所制備滅活苗中含Cp培養上清液， 但經過2次免疫后， 免疫組山羊血清中抗PLD抗體水平與對照組差異并不明顯， Cp攻毒后對照組和免疫組山羊血清中抗PLD抗體水平均明顯上升， 其中對照組在攻毒后第3～8周（首免后11～16周）， 免疫組在攻毒后2～8周（首免后10～15周）抗PLD抗體水平均高于攻毒前水平。 據報道Cp在感染的巨噬細胞內PLD會高水平表達［15］， 該滅活苗免疫未能誘導高水平PLD抗體的原因可能是體外培養條件下PLD表達水平相對較低， 所分泌的PLD蛋白尚不足以引發機體產生高水平抗體。

本研究發現Cp滅活苗免疫山羊白細胞數量高于對照組， 其中二免后28 d達到顯著水平， 該結果與屈輝［16］報道注射口蹄疫O型疫苗的波爾山羊白細胞在第28 d顯著升高、 李玉豪［17］報道牛病毒性腹瀉重組抗原亞單位疫苗免疫組綿羊的白細胞數高于對照組相似。 由于伴隨免疫應答的白細胞相應升高， 本研究結果提示Cp滅活苗免疫可增強山羊的免疫應答能力。 此外， 本研究表明所制備的Cp滅活苗免疫可緩解因Cp感染引起山羊體質量下降及體溫升高， 明顯減少Cp攻毒引起的膿腫數量和淋巴結載菌量。 如果單以是否產生膿腫來判定Cp疫苗對山羊的免疫保護率［1］， 本研究表明所制備的Cp滅活苗對山羊的免疫保護率為66.7%。 此外， 本研究發現注射以ISA 201 VG為佐劑的Cp滅活苗在注射部位可形成一定的皮膚破潰， ISA 201 VG是基于礦物油的佐劑， 這與張媛等［18］報道小鼠皮下注射豬丹毒絲菌油佐劑滅活苗產生皮膚破潰相似， 但本研究的皮膚破潰在注射疫苗后49～56 d基本上完全恢復， 而且所制備Cp滅活苗免疫對山羊增質量無明顯影響， 提示該疫苗具有直接應用于生產的可能性。 后續研究中， 將進一步優化制苗條件及免疫方法， 增大試驗山羊的數量， 在臨床上進一步評價其免疫保護效果， 為研發防控Cp感染的疫苗提供資料。

3.2"結論

本研究制備了Cp滅活苗， 免疫山羊后可誘導抗Cp血清IgG抗體的顯著升高， 緩解因Cp攻毒引起的山羊體質量下降及體溫升高， 減少Cp攻毒引起的膿腫數量和淋巴結載菌量， 為山羊養殖中Cp感染防治提供了參考資料。

參考文獻：

［1］DE PINHO R B， DE OLIVEIRA SILVA M T， BEZERRA F S B， et al． Vaccines for Caseous Lymphadenitis： Up-to-Date and Forward-Looking Strategies ［J］． Applied Microbiology and Biotechnology， 2021， 105（6）： 2287-2296．

［2］"LI H X， YANG H Y， ZHOU Z Y， et al． Isolation， Antibiotic Resistance， Virulence Traits and Phylogenetic Analysis of Corynebacterium pseudotuberculosis from Goats in Southwestern China ［J］． Small Ruminant Research， 2018， 168： 69-75．

［3］"徐志豪， 黃詩琴， 李鄉城， 等． 四川省山羊皮下膿腫的流行病學調查及病原體分析 ［J］． 中國獸醫科學， 2016， 46（8）： 991-996．

［4］"鄭國英， 馬玉馨， 李太仙， 等． 昆明市西山區山羊偽結核棒狀桿菌的分離鑒定 ［J］． 動物醫學進展， 2017， 38（9）： 32-37．

［5］"魏宇辰， 王斌， 白新棟， 等． 奶山羊不同組織來源干酪性膿腫中偽結核棒狀桿菌的分離及毒力基因和耐藥性檢測 ［J］． 中國獸醫學報， 2023， 43（5）： 945-950．

［6］"王斌， 魏宇辰， 白新棟， 等． 陜西省及甘肅省部分地區山羊和綿羊干酪性淋巴結炎樣膿腫中病原菌種類的調查與分析 ［J］． 中國獸醫學報， 2022， 42（12）： 2427-2433．

［7］"唐偉， 黃祥元， 劉天猛． 山羊皮下膿腫的病原學分析 ［J］． 湖南畜牧獸醫， 2023（1）： 28-32．

［8］"王銳鴻， 林昶， 池雪林， 等． 山羊偽結核棒狀桿菌LY20株分離鑒定及病理組織學觀察 ［J］． 中國獸醫學報， 2021， 41（12）： 2411-2420．

［9］"李瀟． 山羊偽結核棒狀桿菌疫苗候選株篩選及滅活苗制備工藝研究 ［D］． 重慶： 西南大學， 2020．

［10］吳陛． 山羊偽結核棒狀桿菌PLD原核表達及間接ELISA檢測方法的建立與應用 ［D］． 重慶： 西南大學， 2020．

［11］熊朝海． 羊源偽結核棒狀桿菌分離鑒定及其自制滅活疫苗免疫效果初探 ［D］． 雅安： 四川農業大學， 2019．

［12］王斌． 偽結核棒狀桿菌的分離鑒定和傳代致弱及類毒素的免疫應用 ［D］． 楊凌： 西北農林科技大學， 2019．

［13］侯宏虎， 王志芳， 楊增岐． 羊偽結核及大腸埃希菌病二聯滅活油苗的試制 ［J］． 動物醫學進展， 2007， 28（10）： 116-118．

［14］趙宏坤， 范偉興， 胡敬東， 等． 羊偽結核病研究進展 ［J］． 中國預防獸醫學報， 2000， 22（3）： 77-78．

［15］MCKEAN S C， DAVIES J K， MOORE R J． Expression of Phospholipase D， the Major Virulence Factor of Corynebacterium pseudotuberculosis， Is Regulated by Multiple Environmental Factors and Plays a Role in Macrophage Death ［J］． Microbiology， 2007， 153（7）： 2203-2211．

［16］屈輝． 注射口蹄疫O型疫苗對波爾山羊白細胞計數的分析 ［J］． 湖南畜牧獸醫， 2012（4）： 17-18．

［17］李玉豪． 牛病毒性腹瀉粘膜病重組抗原蛋白亞單位疫苗制備與免疫效果評價 ［D］． 石河子： 石河子大學， 2022．

［18］張媛， 魏財文， 李建， 等． 豬丹毒絲菌生產用菌種CVCC43005株最高擴繁代次的確定及疫苗佐劑的篩選 ［J］． 中國獸藥雜志， 2019， 53（10）： 7-14．

責任編輯"周仁惠

DOI： "10.13718/j.cnki.xdzk.2025.01.009

鄒安龍， 呂紅， 吳嬋玉， 等． 偽結核棒狀桿菌滅活苗對山羊的免疫效果評價 ［J］． 西南大學學報（自然科學版）， 2025， 47（1）： 104-111．

收稿日期：20231109

基金項目：重慶市自然科學基金項目（cstc2021jcyj-msxmX0884）； 重慶市技術創新與應用示范項目（cstc2018jscx-msybX0216）。

作者簡介：鄒安龍， 碩士研究生， 主要從事獸醫傳染病防治研究。

通信作者： 周作勇， 博士， 副教授。