不同生長年份牛大力根淀粉和蔗糖代謝途徑轉錄組分析

摘""要：牛大力是一種重要的多年生藥食同源植物，其主要成分為淀粉和糖類。為了探究不同生長年份牛大力根淀粉和糖類物質合成的規律及其內在基因調控網絡，本研究以3年生（NG3）、7年生（NG7）、10年生（NG10）和15年生（NG15）4個生長年份的牛大力根為研究對象，測定總多糖、淀粉和蔗糖的含量，并完成轉錄組測序，篩選分析不同年份間牛大力根的差異表達基因（DEGs），重點解析淀粉和蔗糖代謝途徑DEGs的功能。糖類和淀粉物質測定結果表明，隨著年份的增長，總多糖與淀粉含量均呈現增加趨勢，生長至15年時的含量最高，而蔗糖含量在3年時最高，隨后呈現下降趨勢。轉錄組測序發現，隨著生長年份跨度增加，NG3"vs"NG7、NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15對比的DEGs總數呈上升趨勢，分別為526、1848和1937個。進一步挖掘淀粉和蔗糖代謝途徑中的DEGs，共有62個DEGs在3個比較組中差異表達，其中，蔗糖合成基因的表達量隨年份增加而下降，淀粉合成基因隨年份的增加較淀粉降解基因占主導，纖維素降解酶隨年份增加表達量降低。最終篩選出5個淀粉和蔗糖代謝途徑的關鍵酶基因進行熒光定量PCR驗證，其表達變化趨勢與轉錄組測序結果基本一致。研究結果表明，牛大力在3～7年時處于生長活躍期，以蔗糖、纖維素和淀粉的合成為主，促進根部快速膨大發育。生長至7年時，以淀粉的積累、蔗糖的分解和纖維素的降解為特征，進入生長平穩期。本研究對于牛大力根膨大特性的研究、高成薯性牛大力種質創新和科學采收都有積極的指導意義。

關鍵詞：牛大力；根；生長年份；淀粉；蔗糖代謝；轉錄組分析中圖分類號：S567.19""""""文獻標志碼：A

Transcriptome"Analysis"Related"to"Starch"and"Sucrose"Metabolism"Pathways"of"C."specisoa"at"Different"Developmental"Stages

YANG"Qing1，"GU"Xuejin2，"WANG"Qinglong1，"ZHANG"Min3，"YAN"Xiaoxia1，"TANG"Huan1，"WANG"Zhunian1，"FENG"Shixiu3，"WANG"Maoyuan1*

1."Tropical"Crops"Genetic"Resources"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Cultivation"of"Herb"Medicine"（Haikou），"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Tropical"Wild"Plant"Gene"Resource，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Provincial"Engineering"Research"Center"for"Tropical"medicinal"plants，"Haikou，"Hainan"571101，"China;""2."College"of"Tropical"Crops，"Yunnan"Agricultural"University，"Pu’er，"Yunnan"665001，"China;"3."Fairy"Lake"Botanical"Garden，"Shenzhen"amp;"Chinese"Academy"of"Sciences"/"Key"Laboratory"of"South"Subtropical"Plant"Diversity，"Shenzhen，"Guangdong"518004，"China

Abstract："Callerya"speciosa"is"an"important"perennial"medicinal"and"edible"plant，"with"starch"and"saccharides"as"the"main"contents."This"study"investigated"the"development"law"of"starch"and"sucrose"metabolism"pathways"of"C."specisoa"at"different"developmentalnbsp;stages"and"its"internal"gene"regulatory"network."Four"growth"years"of"C."speciosa"roots，"including"3-year-old"（NG3），"7-year-old"（NG7），"10-year-old"（NG10），"and"15-year-old"（NG15），"were"used"as"the"research"objects."The"content"of"total"polysaccharide，"starch，"and"sucrose"was"determined，"and"transcriptome"sequencing"was"carried"out."Differentially"expressed"genes"（DEGs）"between"different"years"were"screened，"and"the"functions"of"DEGs"in"the"starch"and"sucrose"metabolism"pathways"were"focused"on."The"results"showed"that"with"the"increase"of"years，"the"content"of"total"polysaccharides"and"starch"both"showed"an"increasing"trend，"with"the"highest"content"at"15"years，"while"the"sucrose"content"was"the"highest"at"3"years，"followed"by"a"downward"trend."Through"transcriptome"sequencing，"NG3"was"compared"with"NG7，"NG10，"and"NG15，"respectively，"for"intergroup"gene"expression"analysis."With"the"increase"of"the"growth"year"span，"the"total"number"of"DEGs"increased."To"further"explore"DEGs"in"the"starch"and"sucrose"metabolism"pathways，"a"total"of"62"DEGs"were"differentially"expressed"in"the"three"comparison"groups，"mainly"participating"in"the"regulation"of"starch，"sucrose，"and"cellulose"metabolism."Among"them，"the"expression"of"sucrose"synthesis"genes"decreased"with"the"increase"of"years;"the"expression"of"starch"synthesis"genes"dominated"over"starch"degradation"genes"with"the"increase"of"years;"and"the"expression"of"cellulose"degradation"enzymes"decreased"with"the"increase"of"years."Five"key"genes"in"the"starch"and"sucrose"metabolism"pathways"were"screened"out"for"fluorescence"quantitative"PCR"verification，"and"the"expression"trend"was"basically"consistent"with"the"transcriptome"sequencing"results."The"results"indicate"that"C."speciosa"is"in"the"growth"active"period"from"3"to"7"years，"with"the"synthesis"of"sucrose，"cellulose，"and"starch"as"the"main"promoters"for"rapid"root"expansion"and"development."When"it"grows"to"7"years，"the"plant"enters"a"stable"growth"phase"characterized"by"starch"accumulation，"sucrose"decomposition，"and"cellulose"degradation."This"research"would"provide"valuable"insights"on"the"study"of"C."speciosa"root"expansion"mechanism，"the"innovation"of"high-yielding"varieties，"and"scientifically"guided"harvesting"practices.

Keywords："Callerya"speciosa;"root;"developmental"stages;"starch;"sucrose"metabolism;"transcriptome"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.01.003

牛大力為豆科雞血藤屬植物美麗雞血藤[Callerya"speciosa"（Champion"ex"Bentham）"Schot]，是多年生藥食兩用植物，以根入藥，主產我國廣東、廣西和海南等地。牛大力是華南地區重要的煲湯食材，也是壯腰健腎丸、舒筋健腎丸的主要配伍藥材，具有補虛潤肺和強筋活絡的功能。牛大力現作為新資源食品，產品開發類型多樣，市場需求旺盛，原料價格逐年上漲。人工種植是牛大力的主要來源，以廣東和和海南兩省種植面積較大。牛大力根兼有膨大根和非膨大根的雙重特征，一般栽培1年后側根開始膨大，3年以上膨大根系發達，膨大達到一定程度方可采收。據報道，綜合產量、營養物質和指標成分含量，其最佳采收年限為5～7年左右，但在實際生產中亦有種植期在7～10年甚至以上的牛大力，民間習慣認為，生長年份越久，其根（膨大根）的品質越高[1-4]。

利用基因組和轉錄組技術，解析藥用植物的形態發育過程、營養物質形成和藥效物質積累的分子機制和調控網絡，是當前中藥產業科學發展的關鍵步驟。近年來，基于全基因組解析的轉錄組測序分析成為藥用植物研究熱點，包括人參、石斛、三七、丹參、銀杏、金銀花和當歸等多種藥用植物的基因組和轉錄組數據已被分析獲取。牛大力含淀粉、粗纖維、蛋白質和三萜、黃酮、酚苷等多種活性物質，在生長發育的不同階段，其外觀形態和內在物質積累都在發生階段性的變化。牛大力根系膨大調控的關鍵基因研究一直備受關注，無參轉錄組的分析取得了一系列的進展，主要集中在淀粉合成基因、蔗糖代謝基因和黃酮類物質生物合成關鍵基因方面[5-8]。研究結果表明，牛大力膨大根的形成和發育與淀粉、蔗糖、植物激素和細胞壁發育密切相關[9-10]。不同生長年份牛大力根淀粉和多糖的動態變化及其調控的分子機制，卻鮮有報道。

因此，本研究以3、7、10、15年株齡的牛大力塊根為研究對象，進行轉錄組測序研究，參考已發表的牛大力基因組數據[11]，對測序結果進行分類和功能注釋。以年份跨度為分組依據，篩選和富集差異表達基因和代謝通路。重點對牛大力發育過程中淀粉和蔗糖代謝途徑中的差異表達基因進行篩選和分析，并結合總多糖、淀粉和蔗糖含量的測定，解析牛大力發育過程中淀粉和蔗糖代謝關鍵酶的表達情況和規律，以期能夠科學揭示牛大力品質形成的規律，并為牛大力的精準育種和品質提升提供科學的依據，推動其產品開發和產業的可持續發展。

1""材料與方法"

1.1""材料

研究材料采自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所藥用植物資源圃，經中國熱帶農業科學院王祝年研究員鑒定為豆科雞血藤屬植物美麗雞血藤[Callerya"speciosa"（Champion"ex"Bentham）"Schot]。于2021年10月，分別選擇3年生（NG3）、7年生（NG7）、10年生（NG10）和15年生（NG15）牛大力植株各9株，每3株牛大力的塊根合并為1份即1個生物學重復，每個生長年份設置3個生物學重復，用于RNA數據采集。具體取樣方法為：沿牛大力根際周邊開挖，深度80～100"cm。采挖后選擇直徑4～8"cm的塊根，截取20"cm使用PBS水沖洗并擦拭干凈，再分別從前、中、后部迅速切取厚度0.5"cm的切片，包裹于錫箔紙中，做好標記，置液氮罐冷凍，于24"h后轉入–80"℃冰箱保存備用。

1.2""方法

1.2.1""總多糖、淀粉和蔗糖含量測定""取不同年份牛大力的根樣本，使用Eyela"FDU-2110冷凍干燥機（日本EYELA東京理化器械株式會社）冷凍干燥后，研磨粉碎，使用Bio"Tek"EON多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司），按照總多糖、植物淀粉含量和蔗糖含量試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司）說明書測定各組樣本中總多糖、淀粉和蔗糖含量。

1.2.2""轉錄組測序及數據分析""轉錄組測序分析委托杭州聯川生物技術股份有限公司完成。實驗流程按照Illumina公司提供的標準嚴格執行。首先使用TRI@Regent試劑盒提取牛大力根樣本的總RNA，經純度、濃度和完整性檢測，質檢合格后構建cDNA文庫。使用Agilent"2100"bioanalyzer對文庫的insert"size進行檢測，庫檢合格后采用Illumina"NovaseqTM6000進行測序，測序讀長為雙端2×150"bp（PE150）。為了保證數據分析的質量及可靠性，對原始數據進行預處理，過濾去除帶接頭的reads、含N的reads和低質量的reads后得到clean"reads。將clean"reads使用Hisat2進行牛大力參考基因組比對，根據Hisat2的比對結果，使用StringTie重構轉錄本并計算每個樣本中的所有基因的表達水平。

1.2.3"""差異表達基因分析""使用FPKM值對樣本基因的表達量進行歸一化，根據比較組內基因的表達情況進行差異分析。以差異倍數（fold"change）≥2，即|log2"（Fold"Change）|≥1，且q值（p值的校正值）lt;0.05為標準，篩選差異表達基因（differentially"expressed"genes，"DEGs）。通過完成對DEGs的整體分布情況、GO和KEGG分析，結合特定的KEGG通路和GO注釋等信息，對重要代謝通路及關鍵基因進行篩選。運用SPSS"21.0軟件進行單因素方差分析（oneway"analysis，ANOVA），數據用“平均值±標準誤”表示。

1.2.4""實時熒光定量PCR分析""從牛大力轉錄組分析結果中篩選出5個在淀粉和蔗糖代謝途徑中表達量相對較高的關鍵基因，通過實時熒光定量PCR驗證轉錄組數據的準確性。根據qPCR引物設計原則，使用Geneious軟件設計各候選基因的引物（表1），擴增子長度控制在120～200"bp之間，由蘇州金唯智生物科技有限公司完成引物合成。取不同年份牛大力的根為材料，以actin作為內參，按照SYBR"Premix"Ex"Taq反應體系[12]進行RT-qPCR反應，每個樣品設置3個生物學重復，采用2–??Ct法計算基因的相對表達量。反應總體積20"μL，包括2×ChamQ"SYBR"Color"qPCR"Master"Mix"10"μL、Prime"1"0.4"μL、Primer"2"0.4"μL、50×"ROX"Reference"Dye"1"0.4"μL、Template"DNA/cDNA"5.8"μL、ddH2O"3"μL。反應程序為：95"℃"30"s；95"℃"10"s，60"℃"30"s，40個循環。擴增完畢后，以1"℃/"4"s"的速率從60"℃逐步遞增到95"℃，獲得溶解曲線。

2""結果與分析

2.1""不同生長年份牛大力總多糖、淀粉和蔗糖含量的動態變化

本研究前期發現，低年份（3～7年）的牛大力根處于快速膨大期，然后進入高年份（10～15年）的穩定生長期，隨著年份的增長，其外觀形態和物質積累的差異不斷縮小，根的橫切面由低年份的黃色粗糙的纖維結構向高年份白色細膩的淀粉結構過度（圖1A），淀粉含量顯著增加[13]。通過測定不同生長年份牛大力根中的總多糖、淀粉和蔗糖含量發現，隨著年份的增長，總多糖與淀粉含量均呈現增加趨勢，而蔗糖含量呈現下降趨勢（圖1B）?？偠嗵呛吭?～10年間平穩增

長，10～15年間顯著增長（Plt;0.05）。與NG3比，總多糖含量在NG10和NG15中的增長明顯，差異顯著（Plt;0.05）。淀粉在生長過程中大量積累，其含量在3～10年間顯著增長（Plt;0.05），10～15年間平穩增長，與NG3比，淀粉含量在NG7、NG10和NG15中的增長明顯，差異顯著（Plt;0.05）。蔗糖含量在3～15年間隨著生長年份增加逐漸下降，在相鄰階段變化不顯著，而與NG3比，蔗糖含量在NG10和NG15中的降低趨勢明顯，差異顯著（Plt;0.05）。結果表明，在淀粉和蔗糖代謝途徑中，蔗糖與總多糖和淀粉含量的積累整體呈負相關，可能是以淀粉-蔗糖相互轉化為主要模式[14-16]。

2.2""轉錄組測序質量評估

基于Illumina測序平臺，對4個生長年份的牛大力根樣品進行轉錄組測序，總共獲得了80.66"Gb的clean"bases。各樣品clean"data的Q20的比率均超過了97.97%，Q30的比率均超過了93.83%，說明RNA-Seq數據質量較好，測序數據可靠度高，掃描下方二維碼（圖2），可查看轉錄組測序數據。對12個轉錄組樣本數據進行參考基因組比對分析，共獲得41"461個基因和62"501個轉錄本的表達數據，基因比對的匹配率在79.10%～"85.84%之間。表明轉錄組測序數據質量較高，基因的注釋率高，能夠開展后續的生物信息學分析。

2.3""差異表達基因篩選分析

2.3.1""差異基因表達情況統計""本研究對4個年份牛大力根的轉錄組樣本進行差異表達基因（DEGs）篩選，將NG3分別與NG7、NG10和NG15對比，進行組間基因的表達情況分析。由3個比較組中篩選的DEGs數量及其上、下調表達情況（圖3A）可知，在3～15年的生長時期，隨著生長年份跨度增加，DEGs總數呈增長趨勢，且各組上調與下調基因的比例有一定的變化。其中，在NG3"vs"NG7組中DEGs數量最少，有526個（205個上調和321個下調）；而另外2組的DEGs總數明顯增加，NG3"vs"NG10組中有1848個，以上調DEGs為主；NG3"vs"NG15組有1937個，下調DEGs數量增加，可能與單糖、多糖和淀粉的合成有關。

進一步分析3個比較組中DEGs的重疊和特異性情況（圖3B）發現，3組共有DEGs僅有83個，NG3"vs"NG7組和其他2組的DEGs重疊部分相對較少，分別有86個和93個，而NG3"vs"NG10組和NG3"vs"NG15組之間重疊最多，有580個；各組特有DEGs以NG3"vs"NG7組的數量最少（264個），而另外2組的特有DEGs數量更多，NG3"vs"NG15組有1181個，NG3"vs"NG10組有1099個。結果說明，隨著生長年份跨度增加，DEGs的數量明顯增加，牛大力不同生長階段內在物質發生著明顯的變化。

2.3.2""差異表達基因的功能富集分析""對3個比較組NG3"vs"NG7、NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15富集的GO"term差異表達基因進行注釋，結果分為生物過程（biological"process）、細胞組分（cellular"component）和分子功能（molecular"function）。在3個比較組中，均以生物學過程類別注釋GO"term的最多，將3個類別前25、前15、前10的GO"term進行展示（圖4），細胞組分中含有DEGs數目較多。進一步根據富集程度對前20的GO"term進行分析，發現3個比較組中共有條目多與細胞壁發育以及木質素、木聚糖等相關物質的代謝活動有關（圖5）。其中，在NG3"vs"NG7組中顯著富集的GO"term主要有調節防御反應（regulation"of"defense"response）、葡萄糖-1-磷酸腺苷轉移酶活性（glucose-1-phosphate"adenylyltransferase"activity）和對強光照的反應（response"to"high"light"intensity）等；在NG3"vs"NG10組中有糖基轉移酶活性（glycosyltransferase"activity）、氧化還原酶活性（oxidoreductase"activity）、作用于金屬離子（acting"on"metal"ions）等；NG3"vs"NG15組是年份跨度最大的比較組，顯著富集于苯丙素生物合成過程（phenylpropanoid"bios ynthetic"process）、晝夜節律（circadian"rhythm）和次生代謝物生物合成過程（secondary"metabolite"biosynthetic"process）。

KEGG富集分析結果中位居前20的pathway如圖6所示，3個比較組中均顯著富集的pathway為單萜生物合成（monoterpenoid"biosynthesis），2組共富集的pathway有苯丙素生物合成（phenylpropanoid"biosynthesis）、淀粉和蔗糖代謝（starch"and"sucrose"metabolism）、氨基酸糖和核苷酸糖（amino"sugar"and"nucleotide"sugar"metabolism）、苯丙氨酸（phenylalanine"metabolism）以及果糖和甘露糖、亞油酸代謝和植物的晝夜節律等。

GO和KEGG富集分析結果表明，在牛大力根的不同生長階段，DEGs與細胞壁發育及其關聯物質的代謝活動相關，主要涉及碳水化合物代謝、氨基酸代謝、糖合成和次生代謝物合成相關途徑。說明不同年份的牛大力根的差異主要體現

在碳水化合物和活性物質的積累方面。本研究前期發現，隨著生長年份的增加，牛大力根的橫切面由黃色粗糙的纖維結構（低年份）向白色細膩的淀粉結構（高年份）過度，淀粉含量顯著增加[17]。因此，進一步圍繞牛大力根淀粉和蔗糖代謝途徑（map"00500）中相關基因的表達進行研究。

2.4""淀粉和蔗糖代謝途徑差異表達基因分析

2.4.1""淀粉和蔗糖代謝途徑差異表達基因篩選""在牛大力根的4個生長階段，注釋到511個KEGG通路上的unigenes參與淀粉和蔗糖代謝。將NG3"vs"NG7、NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15三個比較組進行分析，共篩選到62個DEGs，NG3"vs"NG15組中最多，有38個DEGs，21個上調，17個下調；其次是NG3"vs"NG10組，有35個DEGs，以上調為主（28個）；NG3"vs"NG7組最少，有18個DEGs，以下調為主（13個）。由圖7A可知，3個比較組共有的DEG只有1個，特有的DEGs，NG3"vs"NG7組有8個，NG3"vs"NG10組有14個，NG3"vs"NG15組有12個。共有45個DEGs與淀粉和蔗糖代謝途徑相關，詳細的基因注釋信息見圖8（掃描二維碼，即可查看）。進一步通過層析聚類熱圖（圖7B）進行數據可視化，分析DEGs在3個比較組中的表達情況。富集到淀粉和蔗糖代謝途徑的DEGs中，NG3中顯著上調的DGEs相對較多，與NG7、NG10和NG15的表達情況差異較大，與NG7中的DGEs有一定的關聯；另外3個年份中以NG10的DEGs最少，鄰近年份之間有少量DEGs有一定的關聯。結果表明，在牛大力根的不同生長階段，富集到淀粉和蔗糖代謝途徑的DEGs多為編碼植物糖代謝過程中關鍵酶基因。在生長年份跨度增大的2個比較組NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15中，DEGs總數和特有數目均增加，與糖代謝關鍵酶基因存在階段性的特異表達，催化淀粉和蔗糖代謝途徑中重要代謝物的合成、分解及相互轉化。

2.4.2""淀粉和蔗糖代謝途徑差異基因表達趨勢""基于上述層次聚類熱圖分析，參與淀粉和蔗糖代謝途徑的DEGs在牛大力根的4個生長階段有不同的表達譜，結合FPKM平均值（掃描圖9二維碼，即可查看）進行表達情況分析發現上述DEGs在調控淀粉、蔗糖和纖維素的代謝過程中發揮關鍵作用。表明不同年份牛大力的形態發育和物質積累與多糖和淀粉的合成和積累密切相關。

與蔗糖和海藻糖代謝相關的DEGs有4個，其中有3個為編碼蔗糖合酶（sucrose"synthase，"SUS）的相關基因，1個注釋為類蔗糖合酶（EC：2.4.1.13，Ms8g_050410），2個注釋為蔗糖合酶2（EC：2.4.1.13，Ms8g_045820、Ms8g_045830）；另有1個為調控海藻糖磷酸合酶（trehalose"phosphate"synthase，"TPS）的基因，注釋為α，α-海藻糖磷酸合酶（EC：2.4.1.15，EC：3.1.3.12，Ms2g_044990）。SUS和TPS的表達量隨年份增長而下降，結果說明蔗糖的合成隨年份增加而下降，與蔗糖含量的變化趨勢整體一致。

與淀粉代謝相關的DEGs有11個，主要涉及淀粉合成、淀粉降解相關基因。淀粉合成涉及直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成，相關DEGs包括：3個編碼腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose"pyrophsphorylase，"AGPase）的基因，注釋為葡萄糖-1-磷酸腺苷轉移酶大亞基"1（EC：2.7.7.27，Ms3g_020500、Ms6g_001720）和葡萄糖-1-磷酸腺苷轉移酶小亞基1（EC：2.7.7.27，Ms2g_"025280）；2個編碼顆粒結合淀粉合酶（granule-"bound"starch"synthase，"GBSS）相關的基因（EC：2.4.1.242，Ms3g_079780、Ms3g_073120）；1個編碼可溶性的淀粉合成酶（Soluble"starch"ynthase，"SSS）的基因（EC：2.4.1.21，Ms6g_016280）；2個編碼淀粉分支酶（starch"branching"enzyme，"SBE）基因，注釋為α-1，4葡聚糖分支酶（EC：2.4.1.18，Ms6g_002530、Ms1g_035490）。該類基因中以AGPase、GBSS和SBE相對高表達，多數在NG7中的表達量最高，與NG3比，多為上調表達。

與淀粉降解相關DEGs包括：1個編碼α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan"phosphorylase，"α-GP）相關的基因（EC：2.4.1.1，Ms7g_026770）；1個編碼支鏈淀粉酶（starch"debranching"enzyme，"DBE）相關的基因，注釋為普魯蘭酶1（EC：3.2.1.68，Ms3g_073160）；1個編碼β-淀粉酶（β-amylase，"BAM）相關的基因，注釋為β-淀粉酶"3（EC：3.2.1.2，Ms5g_038700）。該類基因中α-GP和DBE在NG7的表達量達到最高，與NG3比，均為上調表達；而BAM在NG3中表達量最高，隨年份增長整體呈現降低的趨勢。淀粉代謝相關DEGs分析發現，淀粉合成相關基因的表達量遠高于淀粉降解相關基因，結合高年份材料淀粉含量顯著高于低年份的情況，說明牛大力根在生長發育過程中，淀粉的合成占主導地位。

與纖維素降解相關的DEGs有14個，在各個時期均有表達，表達量隨年份增加整體呈降低的趨勢，多數在NG3中高表達，在NG10和NG15中低表達。其中，有5個編碼β-葡糖苷酶（β-glucosidase，"BG）相關的基因，注釋為β-葡萄糖苷酶47（EC：3.2.1.21，Ms8g_039920）和一系列的類β-葡萄糖苷酶（EC：3.2.1.21，Ms7g_004420、Ms5g_053900、Ms8g_024030、Ms8g_024960）；有9個為編碼內切葡聚糖酶（endo-glucanase，"EG）相關的基因，注釋為類內切葡聚糖酶10"EC：3.2.1.4，Ms6g_003490），以及一系列的類葡聚糖內切-1，3-β-葡萄糖苷酶（EC：3.2.1.21，Ms8g_024030、Ms6g_001900、Ms3g_027870）和葡聚糖內切-1，3-β-葡萄糖苷酶（EC：3.2.1.21，Ms2g_017160、Ms2g_027520、Ms7g_000800、Ms8g_042240、Ms3g_035050）。

2.5""熒光定量PCR驗證

基于牛大力淀粉和蔗糖代謝途徑差異表達基因分析結果和文獻報道[12，"18-20]，篩選5個與淀粉和蔗糖代謝途徑的關鍵酶基因（Ms6g_002530、Ms1g_035490、Ms3g_079780、Ms6g_001720、Ms8g_050410）進行熒光定量PCR驗證，分析驗證測序數據的準確性。結果表明，上述驗證基因在牛大力不同年份的表達變化趨勢與轉錄組測序結果基本一致（圖10），淀粉合成酶基因表達整體呈現上升趨勢，在生長至7年后表達顯著增加（Plt;0.05）；蔗糖合酶基因表達呈現下降的趨勢，在生長至高年份（15年）表達顯著降低（Plt;0.05）。

3""討論

本研究基于資源圃保育的3～15年的牛大力種質資源，采用高通量測序技術對3年生、7年生、10年生和15年生的牛大力根進行了轉錄組測序，并參考牛大力基因組數據進行基因的注釋和差異基因的挖掘，重點對淀粉和蔗糖代謝通路相關差異表達基因進行分析，闡明牛大力發育過程中外在形態塊根與內在物質淀粉和多糖積累之間的密切關系及其潛在的基因調控網絡。隨著牛大力生長年份的增加，根中差異表達基因的數量呈增加趨勢，功能定位于細胞壁發育、糖代謝和其他次生代謝物的合成，有多個進程與碳水化合物代謝相關。結合種植中對牛大力的觀察，其根在多年生長中會經歷快速膨大直至穩定增粗的過程，并且年份越高的根越粉越細膩。推測存在2方面的原因，一是地上部分光合產物碳水化合物運送到根部轉化為淀粉積累起來，二是存在部分纖維素降解后向淀粉轉化的現象。差異表達基因的通路分析結果證實，淀粉和糖代謝途徑中的多種酶的表達有顯著差異，涉及淀粉合成、蔗糖代謝、纖維素代謝和可溶性糖-多糖的相互轉化等關鍵酶基因。

淀粉和蔗糖是牛大力塊根中最主要的多糖和可溶性糖[21]。隨著牛大力比較組中生長年份跨度增加，鑒定的淀粉和蔗糖代謝途徑相關差異表達基因數量更多。SUS在低年份，即3年生牛大力的中表達量最高，并表現為合成蔗糖，參與細胞壁構建和呼吸消耗等生物過程。隨著生長年份增加，SUS發揮催化蔗糖分解作用，參與淀粉和纖維素等合成，促進根的膨大和淀粉的積累。結合蔗糖含量的變化，發現隨著年份增加牛大力根中可溶性糖合成顯著減少，前期積累的蔗糖也被分解，進入為多糖?細胞壁與淀粉合成提供前體與底物途徑[22]。而淀粉代謝基因在高年份牛大力根中的表達相對更活躍，其中淀粉合成相關的酶基因AGPase、GBSS和SBE，在7年時的表達量顯著增加，而在10年和15年時表達下降且表達量的差異縮小，表明牛大力生長期間均有淀粉的合成。其中AGPase作為淀粉生物合成途徑中主要調控位點對淀粉積累和組成具有決定性作用[12，"19]，其在NG7中的表達明顯增高，說明7年時淀粉合成已經進入高速合成時期，此后隨年份增加逐漸平緩。淀粉降解相關的基因α-GP亦有同樣的趨勢，結合另一個主要的淀粉降解酶基因BAM3始終處于低表達狀態，說明淀粉的合成和降解是同步進行的，并以合成占絕對優勢。類β-葡萄糖苷酶EC和內切葡聚糖酶EG將纖維素降解為二糖，再經β-葡糖苷酶BG水解為葡萄糖。上述纖維素酶相關達，此后逐漸降低最后趨于平穩，說明在牛大力淀粉和蔗糖代謝途徑中，在3～7年時可能是通過β-葡萄糖苷酶促進纖維素降解，從而影響葡萄糖的合成，為根部的膨大提供能量和碳骨架[10，"23]基因BG和EG，均在牛大力生長至3～7年時高表達。而在生長至10～15年時，其表達量顯著降低，可能更有利于淀粉的儲藏。

淀粉和纖維素是碳水化合物重要的形式，可用于能量存儲和提供碳骨架支撐，也能被α-葡聚糖磷酸化酶、β-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶和內切葡聚糖酶等一系列酶降解并釋放能量，在特定的時期用于植物生長發育[23-25]。因此，牛大力中淀粉和纖維素降解DEGs，在低年份表達相對活躍，而隨著年份增加表達量顯著下降，可能是在相關基因的調控下減少對淀粉的水解。因此，牛大力塊根生長至3年左右，其蔗糖含量處于較高水平，根膨大后其所含的可溶性糖（蔗糖）含量逐漸降低，而多糖（淀粉）和纖維素含量升高，糖類物質在不同的發育時期相互轉化，以不同的形式存在，影響著其塊根的生長發育，與前期研究結果基本一致[1-4，"15]。

綜上所述，為了在牛大力不同的生長階段維持糖類物質的動態平衡，參與蔗糖、淀粉和纖維素代謝的DEGs在各階段差異表達，通過調控蔗糖分解、葡萄糖合成、淀粉的合成與分解等復雜的糖代謝，牛大力在3～7年時處于生長活躍期，以糖原生物合成為主為促進根部快速膨大發育發揮作用，包括蔗糖的合成，纖維素的合成。生長至7年時，以淀粉的合成、蔗糖的分解，纖維素的降解為特征極為活躍，隨后則進入生長的平穩期。本研究結合相關研究[2，"5，"15，"18，"26-28]，綜合產量、種植投入、經濟效益、物質合成、品質形成等因素，進一步證明牛大力生長至5～7年采收更為科學。

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