龐氏安胎止血湯通過調控NLRP3炎癥小體改善熱證自然流產的作用機制

關鍵詞 龐氏安胎止血湯；熱證；自然流產；NOD樣受體蛋白3；免疫平衡

自然流產是妊娠女性最常見的并發癥之一，其發病過程復雜，前期會出現陰道出血，繼而出現陣發性下腹痛或腰背痛等多種癥狀[1―2]。現代醫學認為，導致自然流產的因素有免疫因素、內分泌因素、感染因素及凝血因素等[3]。中醫將自然流產歸為“胎漏”“胎動不安”“滑胎”“數墮胎”范疇；腎為先天之本，主生殖，腎虛則滑胎，以腎虛為前提的脾虛、氣血虛、血瘀、血熱及肝郁共同組成了滑胎的病因病機[4]。中原龐氏婦科起源于清代乾隆年間，其認為“胎前生熱”“妊娠氣滯”“胎前之虛”為“胎漏”“胎動不安”的發病機制，其第6 代傳人龐清治先生更以清熱止血、養血安胎為原則，創制了“龐氏安胎止血湯”。該方配伍得當，具有清熱止血、養血安胎的功效，臨床用于治療熱證之“胎漏”“胎動不安”，效果較好[5]。

NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白質（apoptosis-associated speck-like protein containing aCARD，ASC）、胱天蛋白酶1 前體（caspase-1 precursor，pro-caspase-1）組成的胞內多蛋白復合物，可促進多種炎癥因子的分泌與成熟，且大量表達于子宮內膜和胎盤中，與早產、復發性流產等具有較強的相關性[6―8]。本課題組前期研究指認了龐氏安胎止血湯煎煮后的13 種主要活性成分，分別為莫諾苷、綠原酸、芍藥苷、芒果苷、異阿魏酸、甘草苷、菊苣酸、迷迭香酸、荷葉堿、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術內酯Ⅲ[9]，本研究擬采用分子對接技術與動物實驗，從調控NLRP3 炎癥小體角度分析龐氏安胎止血湯改善熱證自然流產的分子機制，以期為該方的臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BS110S 型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、MR-96TB型酶標儀[騁克儀器（上海）有限公司]、RM2235 型石蠟切片機（德國Leica 公司）、D3024R型臺式高速冷凍微量離心機[大龍興創實驗儀器（北京）股份公司]、CX23 型光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 主要藥品與試劑

龐氏安胎止血湯由黃芩10 g、知母30 g、金銀花30 g、蒲公英30 g、荷葉10 g、旱蓮草30 g、藕節30 g、升麻6 g、蘇梗15 g、白術10 g、山茱萸30 g、白芍10 g、甘草4 g 組成，各藥材均購自河南中醫藥大學第三附屬醫院，經河南中醫藥大學藥學院中藥資源與鑒定教研室2 名副高級及以上職稱人員鑒定為真品，且符合2020 年版《中國藥典》及國家藥品標準。該方水煎液由河南中醫藥大學醫學院醫學機能實驗室制備，具體流程為：取處方量藥材加5倍量蒸餾水浸泡30 min，大火煮沸后小火煎煮30 min，共煎3 次，合并藥液，濃縮為質量濃度為1.11 g/mL（以生藥量計）的藥液。溫陽中藥由附子10 g、干姜10 g、肉桂10 g 組成，各藥材購自河南中醫藥大學第三附屬醫院[臨用時，以5 倍量蒸餾水常規煎煮后，濃縮為質量濃度為1g/mL（以生藥量計）的藥液，備用]。

地屈孕酮片（批號363775，規格10 mg/片）購自荷蘭Abbott Healthcare Products B.V. 公司；米非司酮片（批號43210213，25 mg/片）購自華潤紫竹藥業有限公司；氨基甲酸乙酯（批號20221014）購自天津市光復科技發展有限公司；蘇木素染色液、伊紅染色液（批號分別為190805、20211009）購自福州飛凈生物科技有限公司；三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、甲狀腺素（thyroxine，T4）測定試劑盒（批號分別為H222-1-2、H223-1-2）購自南京建成生物工程研究所；大鼠白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、IL-6、IL-10、γ干擾素（interferon-γ，IFN- γ）酶聯免疫吸附測定試劑盒（批號分別為MM-0192R2、MM-0191R1、MM-0190R1、MM-0195R1、MM-0198R1）購自江蘇酶免實業有限公司；兔抗大鼠NLRP3、ASC、caspase-1 抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗、DAB 顯色試劑盒（批號分別為GB114320-100、GB115270-100、GB11383-100、G1213-100UL、G1212-200T）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

60 只健康雌性未產SD大鼠（10 周齡，體質量200～280 g）和30 只健康雄性SD大鼠（10 周齡，體質量250～280 g）均由鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場提供，動物生產許可證號為SCXK（豫）2022-0002。所有大鼠飼養于河南中醫藥大學醫學機能實驗室，室溫為20～22 ℃，相對濕度為55%～60%，正常光照，大鼠自由飲水采食。本實驗獲河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，編號DWLL202201012。

2 方法

2.1 分子對接實驗

根據本課題組前期研究[9]，從PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載龐氏安胎止血湯主要活性成分莫諾苷、綠原酸、芍藥苷、芒果苷、異阿魏酸、甘草苷、菊苣酸、迷迭香酸、荷葉堿、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術內酯Ⅲ的結構文件，經Open BabelGUL 轉換成PDB 結構文件；再從PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org）下載NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白結構文件。利用AutoDock Tools 1.5.7 軟件將龐氏安胎止血湯的主要活性成分與NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白進行分子對接（若結合能＜－5 kJ/mol，說明兩分子具有親和力，且結合能數值越低，表示兩分子結合越穩定），最后采用PyMOL 軟件分析分子對接結果，預測龐氏安胎止血湯主要活性成分與NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白之間的結合活性。

2.2 大鼠分組、造模與給藥

將60 只雌性大鼠與30 只雄性大鼠按雌雄比2∶1 合籠過夜配種，于次日清晨觀察雌性大鼠有無陰道栓，有陰道栓者記為妊娠第1 天；待60 只雌性大鼠全部妊娠后，隨機分為正常組、模型組、地屈孕酮組（0.002 g/kg，劑量根據臨床等效劑量換算而得）和龐氏安胎止血湯低、中、高劑量組（11.025、22.05、44.10 g/kg，中劑量為臨床等效劑量），每組10 只。從妊娠第1 天起，正常組和模型組大鼠灌胃蒸餾水，各給藥組大鼠灌胃相應藥液，給藥體積均為10 mL/kg，每天1 次，連續12 d。另外，除正常組外，其余各組大鼠均在灌胃蒸餾水/藥液的同時灌胃溫陽中藥藥液10 g/kg；第13 天，除正常組外，其余各組大鼠按5 mg/kg 灌胃米非司酮（臨用時以蒸餾水溶解）以建立大鼠熱證自然流產模型。以造模大鼠血清中T3、T4 水平和流產率升高為標準判定造模成功[8]。最終，各組大鼠無死亡，造模大鼠均造模成功。

2.3 大鼠取材和流產率及子宮系數的計算

末次給藥24 h 后，稱定各組大鼠體重，然后腹腔注射氨基甲酸乙酯（1 g/kg）麻醉，腹主動脈取血，以3 000r/min 離心10 min，取上清液于－80 ℃下儲存，備用。解剖大鼠取妊娠子宮，觀察胚胎顏色（正常胚胎呈淡紅色，宮內未見瘀血；流產胚胎呈黑褐色，胚胎部分消失），統計各組大鼠流產胚胎數和正常胚胎數，并稱定妊娠子宮質量，計算流產率[流產率＝流產胚胎數/（流產胚胎數+正常胚胎數）×100%]和子宮系數（子宮系數＝子宮質量/體重）。觀察結束后，去除妊娠子宮周圍組織，經生理鹽水洗滌后，稱重，拍照，然后將妊娠子宮一分為二，其中一份用4% 多聚甲醛固定，另一份用液氮速凍后于－80 ℃下儲存用于后續實驗。

2.4 大鼠血清中T3、T4、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ水平檢測

取“2.3”項下血清樣品，室溫溶解，按照試劑盒說明書方法操作，然后采用酶標儀檢測大鼠血清中T3、T4、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ水平。

2.5 大鼠妊娠子宮的病理形態觀察

取“2.3”項下固定的妊娠子宮，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（4 μm）等過程制作病理切片；取部分切片經二甲苯脫蠟、HE染色、梯度乙醇脫水后，以中性樹膠封片，采用光學顯微鏡觀察大鼠妊娠子宮的病理形態變化，并拍照。

2.6 大鼠妊娠子宮中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達水平檢測

取“2.3”項下妊娠子宮切片，經二甲苯脫蠟、水化后，以檸檬酸鹽緩沖液熱修復8 min；待切片溫度降至室溫后用H2O2孵育10 min，以磷酸鹽緩沖液浸洗后，以山羊血清孵育30 min，滴加NLRP3（稀釋度為1∶3 000）、ASC（稀釋度為1∶1 000）、caspase-1（稀釋度為1∶3 000）一抗，4 ℃孵育過夜；次日，將切片復溫至37 ℃后滴加二抗（稀釋度為1∶1 000）孵育20 min，以磷酸鹽緩沖液浸洗后，以DAB 顯色10 min，自來水沖洗終止；再以蘇木素復染3min，經鹽酸乙醇分化后，以自來水再次沖洗；經乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后鏡檢。每只大鼠子宮切片在400 倍鏡下隨機選取1 個視野，以棕黃色為陽性染色，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測定每個視野中的積分光密度（integrated optical density，IOD）值表示目的蛋白表達水平。

2.7 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 分子對接結果

由圖1 可知，龐氏安胎止血湯13 種活性成分與NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白的結合能均小于－5 kJ/mol，表明這13 種活性成分與NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白結合穩定。另外，這3 種蛋白與甘草苷的結合能在同類蛋白與活性成分對接中最低，表明這3 種蛋白與甘草苷結合較為牢固。甘草苷與NLRP3、ASC、procaspase-1 蛋白的分子對接模擬圖見圖2。

3.2 大鼠流產率及子宮系數計算結果

與正常組比較，模型組大鼠流產率顯著升高（P＜0.05），子宮系數顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯各劑量組大鼠流產率均顯著降低（P＜0.05），子宮系數均顯著升高（P＜0.05）。結果見表1。

3.3 大鼠血清中T3、T4 水平檢測結果

與正常組比較，模型組大鼠血清中T3、T4 水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯各劑量組大鼠血清中T3、T4 水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

3.4 大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ 水平檢測結果

與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-2、IFN-γ水平均顯著升高（P＜0.05），IL-4、IL-6、IL-10 水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯各劑量組大鼠血清中IL-2、IFN-γ水平均顯著降低（P＜0.05），IL-4、IL-10 水平均顯著升高（P＜0.05）；地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯中、高劑量組大鼠血清中IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表3。

3.5 大鼠妊娠子宮的病理形態觀察結果

正常組大鼠妊娠子宮內膜組織無損傷，蛻膜細胞排列整齊緊密。與正常組比較，模型組大鼠蛻膜細胞數量減少且存在損傷和充血等流產病變。與模型組比較，地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯各劑量組大鼠蛻膜細胞損傷及充血等流產病變均有不同程度的改善。結果見圖3。

3.6 大鼠妊娠子宮中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達水平檢測結果

與正常組比較，模型組大鼠妊娠子宮中NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯各劑量組大鼠妊娠子宮中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖4和表4。

4 討論

自然流產發病率約占妊娠女性的15%，是不孕癥的主要原因之一[1]，但限于倫理原因，流產研究無法直接在人體開展，只能借助符合人體流產病理特征的動物模型開展相關研究，揭示發病機制，研究更安全、更有效的臨床干預手段。已有研究表明，使用米非司酮、米索前列醇等藥物誘導的流產特征與人類自然流產類似，可以作為自然流產動物模型的構建手段[10]。米非司酮是一種孕激素受體拮抗劑，可以選擇性地拮抗孕酮受體，使孕酮活性降低，引發妊娠終止[11]。熱證是以機體陽盛陰虛、臟腑陽氣亢盛為因，以機能活動亢進為表現的一種證候形式，分實熱和虛熱兩種類型。《景岳全書·婦人規》有云“凡胎熱者，血易動，血動者，胎不安”，由此可知血虛熱證是自然流產的病因之一。本研究以“溫熱藥易傷陰助火，內熱由生”為理論基礎，采用溫熱中藥附子、干姜配伍誘導虛熱證動物模型[12―13]，該動物模型主要表現為甲狀腺功能亢進，血清中T3、T4 水平升高以及流產率增加，表明造模成功。

中原龐氏婦科依據女性妊娠期特殊的生理病理特點，將體質與病癥結合，創立了龐氏安胎止血湯，該方清熱安胎，兼以補腎、健脾、理氣。方中黃芩清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎，知母滋陰降火，二者為君藥。金銀花和蒲公英清熱解毒、防治感染，旱蓮草和藕節涼血止血、養陰化瘀，四者為臣藥。蘇梗理氣和胃、止痛安胎，白術健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎；升麻少量配白術、荷葉可升陽止血安胎；山茱萸、白芍補血固腎、安胎，白芍緩急止痛，與知母合用則治妊娠腹痛；知母、山茱萸、白芍雖滋補陰血，但易礙胃生濕；蘇梗、白術雖理氣祛濕，亦有傷津之弊，兩組藥物配合使用，滋補陰血而無礙胃生濕之弊，理氣祛濕而無傷津之虞——此六者為佐藥。甘草為使藥，調和諸藥，可達清熱養陰、理氣安胎的功效[14―15]。本研究結果顯示，經龐氏安胎止血湯干預后，模型大鼠子宮系數升高，流產率降低，血清中T3、T4 水平降低，妊娠子宮病理形態明顯改善，這表明龐氏安胎止血湯對熱證自然流產大鼠有較好的改善作用。

胚胎是母體的半同種異體移植物，會受到母體排斥。母胎之間的免疫耐受取決于母胎界面免疫細胞及細胞因子之間的動態平衡，若此平衡被打破，胎兒將受到母體排斥而發生流產[16]。目前研究認為，妊娠期母體免疫系統主要通過輔助性T細胞1（T helper 1 cell，Th1）/Th2 模式維持正常妊娠，Th1 細胞分泌的IFN-γ、IL-2 等促炎因子，可介導細胞免疫，促進炎癥反應，抑制胎盤滋養層細胞生長，干擾胚胎和胎兒發育，引起胚胎丟失，增加流產風險；Th2 細胞分泌的IL-4、IL-6 和IL-10 等抑炎因子，可抑制炎癥反應，促進同種異體移植物免疫耐受，維持母胎界面妊娠，IL-10 還可挽救免疫平衡破壞引起的妊娠不良結局[17―18]。本研究結果顯示，經龐氏安胎止血湯干預后，模型大鼠血清中IFN-γ、IL-2 水平降低，IL-4、IL-6 及IL-10 水平升高，這表明龐氏安胎止血湯可通過調節炎癥因子水平影響母胎之間的免疫平衡，從而實現對熱證自然流產的改善作用。

NLRP3 炎癥小體是一種多聚蛋白復合物，其組成包括一個模式識別受體蛋白NLRP3，一個含有CARD結構域的ASC（起中樞銜接蛋白的作用），一個炎性半胱氨酸天冬酶caspase-1。NLRP3 蛋白作為模式識別受體蛋白，由一個C端富含亮氨酸的重復序列（LRP）、一個核苷酸結合寡結構域（NOD）和一個N末端pyrin 結構域（PYD）組成。NLRP3 被激活后，其PYD結構域與ASC 同源結構域結合，激活ASC，活化的ASC 可募集前體蛋白procaspase-1，促其水解為有活性的caspase-1；具有活性的caspase-1 可剪切多種IL 前體蛋白，促進促炎因子成熟與分泌，介導下游炎癥反應，此炎癥反應加劇可能是早期不明原因流產的原因之一[6]。本研究分子對接結果顯示，龐氏安胎止血湯的13 種主要活性成分與NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白結合牢固；動物實驗結果發現，經龐氏安胎止血湯干預后，模型大鼠妊娠子宮中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達水平降低，表明龐氏安胎止血湯可能通過調節NLRP3 炎癥小體形成，介導炎癥反應，影響母胎之間的免疫平衡，從而實現對熱證自然流產的改善作用。

綜上所述，龐氏安胎止血湯可能通過調節NLRP3炎癥小體形成，下調IFN-γ、IL-2 等促炎因子，上調IL-4、IL-6、IL-10 等抑炎因子，從而影響母胎之間的免疫平衡，進而發揮改善熱證自然流產的作用。本課題組未來考慮采用NLRP3 抑制劑或構建NLRP3 敲除大鼠模型，以更深入地探究龐氏安胎止血湯干預熱證自然流產的作用機制，為其進一步的臨床應用提供實驗依據。