益母草堿調節GAS6/Axl信號通路對冠心病大鼠心肌損傷的影響

關鍵詞益母草堿；GAS6/Axl信號通路；冠心病；心肌損傷

冠心病屬于心血管相關疾病，具有高致殘率及高致死率，其主要是由于沉積物積聚促使冠狀動脈狹窄、阻塞，引發心肌組織缺氧、缺血、壞死等損傷，導致患者出現心絞痛、心悸、呼吸急促、乏力等癥狀，若不及時治療，還可加劇損傷，引發心肌梗死、心力衰竭，甚至威脅患者的生命安全[1]。目前，冠心病的臨床治療主要通過服用防血栓類藥物以防止冠狀動脈阻塞，但現有治法服藥周期長且難以消除病根，因此迫切需要尋求新型特效藥以緩解患者病情[2]。

益母草堿提取自中藥益母草，具有降血脂、溶栓、保護心血管等多種藥理作用，被廣泛應用于心血管相關疾病的治療。已有研究顯示，益母草堿可減輕血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）誘導的小鼠心臟肥大、纖維化和炎癥，抑制心臟損傷和功能障礙，改善心功能[3]。生長停滯特異性蛋白6（growtharrest-specificprotein-6，GAS6）/酪氨酸蛋白激酶受體（Axl）信號通路在維持心臟正常功能中具有重要作用，激活GAS6/Axl-AMP活化蛋白質激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）信號通路可抑制過氧化氫誘導的心肌細胞氧化應激損傷，抑制心肌細胞凋亡[4]。本研究通過探究益母草堿對GAS6/Axl信號通路的影響，闡明其減輕冠心病大鼠心肌損傷的機制，以期為冠心病的治療尋求新策略。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ReadMax1500型酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）、RX50型顯微鏡[思科諾思生物科技（北京）有限公司]、4200SF型凝膠成像分析系統（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

益母草堿對照品（批號yb-019，純度≥98%）購自上海鈺博生物科技有限公司；GAS6/Axl信號通路抑制劑R428對照品（批號ab141364，純度＞98%）購自英國Abcam公司；腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為ER006、ER008-16、ER003-48）均購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；肌酸激酶同工酶（creatinekinaseisoenzyme，CK-MB）、肌鈣蛋白Ⅰ（troponinⅠ，cTnⅠ）、肌紅蛋白（myoglobin，Mb）ELISA試劑盒（批號分別為JLC15558、JLC14924、JLC15548）均購自江西江藍純生物試劑有限公司；兔源胱天蛋白酶3（caspase-3）、B細胞淋巴瘤2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）相關X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax）抗體（批號分別為LM-0081R、LM0057）均購自上海聯邁生物工程有限公司；兔源GAS6抗體（批號BKKT17001）購自上海帛科生物技術有限公司；兔源磷酸化Axl（phosphorylatedAxl，p-Axl）、Axl抗體（批號分別為kl-5181R、kl230Ra21）均購自上?？道噬锟萍加邢薰?；兔源剪切型caspase-3（cleaved-caspase-3）抗體（批號9661T）購自上海遠慕生物科技有限公司；兔源Bcl-2抗體（批號FNab00839）購自武漢菲恩生物科技有限公司；兔源β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號k10085）購自北京百奧萊博科技有限公司；TUNEL試劑盒（批號Y1040S）購自優利科（上海）生命科學有限公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液（批號B1061）購自北京普利萊基因技術有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的免疫球蛋白G二抗（批號abs20002）購自愛必信（上海）生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

60只7周齡、體重（200±20）g的SPF級正常健康雄性SD大鼠[動物生產許可證號SCXK（豫）2022-0001]購自河南省實驗動物中心。所有大鼠飼養于溫度21～23℃、相對濕度55%、12h光/12h暗交替的環境中，飼養期間自由攝食、飲水。本研究方案已獲得河南利欣制藥股份有限公司動物倫理委員會審批（審批號2022-030195）。

2 方法

2.1 冠心病大鼠模型構建

大鼠適應性喂養1周后，選取12只正常健康大鼠喂養普通飼料作為對照組。剩余48只大鼠進行冠心病造模，具體造模方法及成模判斷標準如下：先以高脂飼料（87.3%基礎飼料+10%豬油+2%膽固醇+0.5%?；悄懰徕c+0.2%丙基硫氧嘧啶）喂養6周，再連續注射5mg/（kg·d）鹽酸異丙腎上腺素3d，每天1次。大鼠注射藥物期間仍用高脂飼料喂養。注射3d后，用30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠并連接心電圖，觀察其心電圖ST段變化，當ST段抬高≥0.1mV表明冠心病大鼠模型構建成功[5]。

2.2 分組與給藥

將造模成功的48只大鼠按隨機抽樣方法分為模型組，益母草堿低、高劑量組（益母草堿-L、益母草堿-H組，分別灌胃25、100mg/kg的益母草堿+腹腔注射75mg/kg的生理鹽水[6]），益母草堿高劑量+GAS6/Axl信號通路抑制劑組（益母草堿-H+R428組，灌胃100mg/kg的益母草堿+腹腔注射75mg/kg的R428[7]），每組12只。各給藥組大鼠給予相應藥物，對照組和模型組大鼠灌胃并腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，連續48d。

2.3 大鼠心功能檢測

給藥結束后24h，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，超聲心動圖監測5個周期（1個周期0.10～0.16s）的左室射血分數（leftventricularejectionfraction，LVEF），取均值作為最終結果，計算左室短軸縮短率（leftventricularfractionalshortening，LVFS）及二尖瓣環舒張早期與舒張晚期運動速度之比（ratioofearly-diastolicandlate-diastolicmotionvelocityofthemitralring，Em/Am）。LVFS＝（左心室的舒張末期內徑－左心室的收縮末期內徑）/左心室的舒張末期內徑×100%。

2.4 大鼠血清中炎癥因子及心肌損傷標志物水平檢測

心功能檢測結束后，各組大鼠腹主動脈取血，靜置后離心，取血清，按照相應ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清中炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）及心肌損傷標志物（CK-MB、cTnⅠ、Mb）水平。

2.5 大鼠心肌組織病理形態觀察

取血結束，處死大鼠，取心肌組織。每組選擇6只大鼠的心肌組織，制成石蠟切片（厚5μm），行常規HE染色，顯微鏡下觀察心肌組織病理形態。其余心肌組織置于－20℃冰箱中冷凍保存。

2.6 大鼠心肌組織細胞凋亡率檢測

取“2.5”項下各組大鼠的心肌組織石蠟切片，常規脫蠟至水后進行TUNEL染色、DAPI染色，具體操作參照試劑盒說明書；脫水后透明密封，顯微鏡下觀察心肌組織細胞凋亡情況（凋亡細胞呈紅色）。計算心肌組織細胞凋亡率：細胞凋亡率（%）＝TUNEL陽性細胞數/DAPI陽性細胞數×100%。

2.7 大鼠心肌組織中凋亡及GAS6/Axl信號通路相關蛋白表達檢測

取各組剩余6只大鼠的心肌組織，研碎后加入蛋白裂解液在冰上充分裂解，提取總蛋白并進行定量，沸水浴變性。取變性蛋白，在電壓60V下電泳分離4～5h，然后在電壓60V下濕轉2h至硝酸纖維素膜，封閉液室溫搖床封閉1h。將膜與cleaved-caspase-3、caspase-3、Bcl-2、Bax、GAS6、p-Axl、Axl、β-actin一抗（其中cleavedcaspase-3、caspase-3抗體的稀釋比例均為1∶1000，其余一抗的稀釋比例均為1∶2000）在4℃下共孵育8h；洗膜后，將膜與HRP標記的二抗（稀釋比例1∶10000）在37℃下共孵育1h。經可視化處理后，凝膠成像系統采集圖像，并使用Image軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，并計算cleaved-caspase-3/caspase-3、Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值。

2.8 統計學方法

采用SPSS25.0軟件對數據進行統計分析。實驗數據均符合正態分布，以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 大鼠心功能測定結果

模型組大鼠LVEF、LVFS、Em/Am均較對照組顯著降低（P＜0.05）；益母草堿各劑量組大鼠LVEF、LVFS、Em/Am均較模型組顯著升高（P＜0.05），且益母草堿-H組上述指標變化均較益母草堿-L組更明顯（P＜0.05）；益母草堿-H+R428組大鼠LVEF、LVFS、Em/Am均較益母草堿-H組顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

3.2 大鼠血清中炎癥因子水平測定結果

模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較對照組顯著升高（P＜0.05）；益母草堿各劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較模型組顯著降低（P＜0.05），且益母草堿-H組上述指標變化均較益母草堿-L組更明顯（P＜0.05）；益母草堿-H+R428組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較益母草堿-H組顯著升高（P＜0.05）。結果見表2。

3.3 大鼠血清中心肌損傷標志物水平測定結果

模型組大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ、Mb水平均較對照組顯著升高（P＜0.05）；益母草堿各劑量組大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ、Mb水平均較模型組顯著降低（P＜0.05），且益母草堿-H組上述指標變化均較益母草堿-L組更明顯（P＜0.05）；益母草堿-H+R428組大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ、Mb水平均較益母草堿-H組顯著升高（P＜0.05）。結果見表3。

3.4 大鼠心肌組織病理形態觀察結果

對照組大鼠心肌細胞與心肌纖維排列整齊，心肌細胞形態正常、大小均勻，無炎癥細胞浸潤；與對照組比較，模型組大鼠心肌細胞與纖維排列紊亂，細胞肥大，細胞核固縮，細胞數量減少，大量炎癥細胞浸潤；與模型組相比，益母草堿各劑量組大鼠心肌細胞與纖維排列相對整齊，細胞形態相對正常，細胞數量增多，炎癥細胞浸潤減少；與益母草堿-H組比較，益母草堿-H+R428組大鼠心肌組織損傷嚴重，細胞及纖維排列紊亂，細胞異常肥大，細胞數量減少，炎癥細胞浸潤明顯。結果見圖1。

3.5 大鼠心肌組織細胞凋亡率測定結果

模型組大鼠心肌組織細胞凋亡率[（34.69±3.56）%]較對照組[（1.53±0.19）%]顯著升高（P＜0.05）；益母草堿-L組、益母草堿-H組大鼠心肌組織細胞凋亡率[分別為（21.25±2.34）%、（9.44±9.87）%]均較模型組顯著降低（P＜0.05），且益母草堿-H組大鼠上述指標變化較益母草堿-L組更明顯（P＜0.05）；益母草堿-H+R428組大鼠心肌組織細胞凋亡率[（18.67±1.93）%]較益母草堿-H組顯著升高（P＜0.05）。結果見圖2。

3.6 大鼠心肌組織中凋亡及GAS6/Axl信號通路相關蛋白表達測定結果

模型組大鼠心肌組織中cleaved-caspase-3/caspase-3比值較對照組顯著升高（P＜0.05），Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值及GAS6蛋白相對表達量均較對照組顯著降低（P＜0.05）；益母草堿各劑量組大鼠心肌組織中cleavedcaspase-3/caspase-3比值均較模型組顯著降低（P＜0.05），Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值及GAS6蛋白相對表達量均較模型組顯著升高（P＜0.05），且益母草堿-H組大鼠上述指標變化均較益母草堿-L組更明顯（P＜0.05）；益母草堿-H+R428組大鼠心肌組織中cleaved-caspase-3/caspase-3比值較益母草堿-H組顯著升高（P＜0.05），Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值及GAS6蛋白相對表達量均較益母草堿-H組顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3、表4。

4 討論

冠心病是引發心血管相關死亡的主要因素，其主要是由于血脂沉積造成冠狀動脈狹窄阻塞，促使心肌缺血缺氧，造成組織壞死，同時大量巨噬細胞浸潤，釋放炎癥因子，引發應激反應，加劇心肌缺血缺氧性損傷[8]。尋求冠心病的特效治療藥物至關重要。中藥益母草前期主要應用于治療痛經、惡露、更年期綜合征、陰道異常出血等婦科相關疾病，后期證實其在治療心肌梗死、缺血性腦卒中、動脈粥樣硬化等相關心腦血管疾病中發揮降血脂、溶栓、保護心血管等多種作用，而提取自益母草的主要活性生物堿益母草堿在其中發揮至關重要的作用[9]。已有研究顯示，益母草堿可通過減少梗死相關酶的釋放、心肌細胞的凋亡，縮小梗死面積，改善心功能，對心肌缺血再灌注損傷具有改善作用[10]；同時，益母草堿還可抑制心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡，改善心功能[11]。LVEF、LVFS、Em/Am是檢測心功能的常用指標，可以直觀反映心功能情況，而心肌損傷標志物CK-MB、cTnⅠ、Mb水平可以反映心肌損傷程度。本研究中，冠心病大鼠的LVEF、LVFS、Em/Am水平降低，CK-MB、cTnⅠ、Mb水平升高，心肌組織發生損傷；而益母草堿給藥后可升高冠心病大鼠的LVEF、LVFS、Em/Am水平，降低其血清中心肌損傷標志物CK-MB、cTnⅠ、Mb水平。這說明益母草堿可改善心功能，減輕心肌損傷，對冠心病大鼠具有心肌保護作用。

冠心病的發生發展受多種因素影響，其中炎癥及細胞凋亡均與冠心病心肌損傷息息相關：當心肌組織受到缺血缺氧刺激時，心肌組織發生壞死，炎癥細胞浸潤加劇，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子大量釋放，進而促使細胞線粒體發生損傷，釋放大量細胞色素C，促進促凋亡蛋白Bax表達，然后激活并活化caspase-3，促進細胞凋亡，加劇心肌損傷[12―13]?？沟蛲龅鞍譈cl-2與促凋亡蛋白Bax兩者相互拮抗，共同調控細胞凋亡，Bcl-2/Bax比值可以反映細胞內凋亡與抗凋亡的平衡狀態；cleavedcaspase-3作為caspase-3的活化形式，是執行細胞凋亡的關鍵蛋白，cleaved-caspase-3/caspase-3比值可以反映細胞凋亡程度。已有研究顯示，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平可緩解內皮組織炎癥反應，減少血管內皮活性物質表達，從而緩解內皮細胞損傷，減少心肌細胞凋亡，減輕心肌組織損傷，改善冠心病患者病情[14]。抑制TNF-α、IL-6水平，下調caspase-3、Bax表達，可抑制炎癥反應，減少心肌細胞凋亡，減輕冠心病大鼠心肌損傷[15]。本研究結果顯示，益母草堿可降低冠心病大鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，降低cleaved-caspase-3/caspase-3、Bcl-2/Bax比值，抑制炎癥反應，減少心肌細胞凋亡，進而減輕心肌損傷。

GAS6/Axl信號通路參與調控多種生理病理進程，包括心肌保護，并在其中發揮關鍵作用。其中，維生素K依賴性蛋白家族成員GAS6參與動脈粥樣硬化及冠狀動脈炎性損傷的發生發展，當機體受到刺激時，GAS6可被激活，使其結合并磷酸化激活細胞膜表面的Axl，進而激活下游多條效應通路，抑制炎癥發生及細胞凋亡等，從而抑制心肌損傷[16]。已有研究顯示，激活GAS6/Axl-含NOD樣受體家族pyrin結構域蛋白3信號通路，可抑制炎癥反應，減少心肌細胞凋亡，改善膿毒癥小鼠心功能[17]。另外，激活GAS6/Axl-AMPK信號通路可抑制炎癥反應與細胞凋亡，改善心功能和膿毒癥心肌損傷[18]。本研究結果顯示，益母草堿可上調冠心病大鼠心肌組織中GAS6蛋白表達和升高p-Axl/Axl比值；而加入GAS6/Axl信號通路抑制劑R428后，其可逆轉高劑量益母草堿對冠心病大鼠心肌損傷的改善作用，進一步證實了益母草堿可通過激活GAS6/Axl信號通路減輕冠心病大鼠心肌損傷。

綜上所述，益母草堿可減輕冠心病大鼠心肌損傷，其作用機制可能與激活GAS6/Axl信號通路相關，但其具體作用機制還需多方實驗加以論證。