黃芪-葛根配伍對T2DM胰島素抵抗大鼠鐵死亡的影響及機制研究

關鍵詞黃芪；葛根；配伍；鐵死亡；2型糖尿?。灰葝u素抵抗

2型糖尿?。╰ype2diabetesmellitus，T2DM）是一種由多種原因引起的以慢性高血糖為特點的代謝性疾病，該病具有較高的發病率，作為慢性非傳染性疾病對人類健康的影響僅次于腫瘤和心血管疾病[1]。T2DM可誘發多種嚴重的并發癥，甚至導致患者死亡[2―3]。胰島素抵抗（insulinresistance，IR）和胰島β細胞損傷為T2DM的主要病理機制。流行病學研究顯示，IR作為T2DM發病的病理基礎及關鍵環節貫穿于該病的始終[4]，因此積極改善IR是治療T2DM的關鍵策略之一。

鐵死亡是一種以鐵依賴性的脂質過氧化物蓄積為特征的新型程序性細胞死亡方式[5]。鐵過載和脂質過氧化物蓄積是鐵死亡發生的啟動子與介質，參與包括T2DMIR在內的多種鐵過載相關疾病[6―7]。肝臟是儲存鐵的主要部位[8]，過量的鐵參與氧化還原反應，可產生大量活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS），引發氧化應激、脂質過氧化和DNA損傷，從而破壞細胞膜成分，損傷肝細胞并促進細胞程序性死亡，發生鐵死亡，繼而降低胰島素靶器官——肝臟對胰島素的敏感性，誘發T2DMIR。由此可見，抑制鐵死亡可能是緩解T2DMIR的有效手段。

盡管近年來適用于T2DM的化學藥種類日益增多，但其存在明顯的副作用（如低血糖風險、胃腸道反應、肝損害、藥物依賴性及繼發性失效等），而具有多成分、多靶點、多途徑特點的中藥在T2DM（屬消渴癥范疇）治療領域具有一定優勢。黃芪-葛根配伍出自《證治匯補》之黃芪葛根湯，黃芪補氣健脾、升陽舉陷，葛根生津止渴，二者配伍，共奏健脾益氣、生津止渴之功，臨床多用于治療消渴，療效佳[9]。本課題組前期通過藥效學研究證實，黃芪-葛根配伍可顯著減輕T2DM大鼠IR程度，降低大鼠空腹血糖（fastingbloodglucose，FBG）水平，且黃芪、葛根以質量比2∶1配伍時與降糖相關的主要成分析出最多[10]。本研究通過建立T2DMIR大鼠模型，以黃芪葛根配伍水煎液、鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）及鐵死亡誘導劑erastin為干預手段，進一步探討黃芪-葛根配伍對T2DMIR大鼠肝組織鐵死亡的影響及其潛在作用機制，以期為黃芪-葛根配伍防治T2DMIR的臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ACCU-CHEK型血糖儀（羅氏診斷產品有限公司），BIOBASE-EL10A型自動酶標儀（山東博科生物產業有限公司），VE-180型垂直電泳槽、Tanon-5200型凝膠成像系統（上海天能科技有限公司），MiniProtean3Cell型電泳儀（美國Bio-Rad公司），TE77XP型電轉儀（美國Hoefer公司），PCL20型全自動生化分析儀（深圳市活水床旁診斷儀器有限公司）。

1.2 主要藥物與試劑

黃芪飲片（產地內蒙古，批號20221101）、葛根飲片（產地河南，批號20220321）均購自北京同仁堂藥房；鐵死亡抑制劑Fer-1、鐵死亡誘導劑erastin（批號分別為132693、20230512，純度分別為99.96%、99.75%）均購自美國MCE公司；鏈脲佐菌素（批號S-0130-5G）購自美國Sigma公司；高密度脂蛋白膽固醇（high-densitylipoproteincholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C）、總膽固醇（totalcholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）測試盒，肝功能酶測定試劑盒[貨號BC6，檢測指標為丙氨酸轉氨酶（alaninetransaminase，ALT）及天冬氨酸轉氨酶（aspartatetransaminase，AST）]，空腹胰島素（fastinginsulin，FINS）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（批號分別為20230131、20230218、20230129、20230221、20230315、20230521、20221020、20221024、20220804）均購自南京建成科技有限公司；ROC試劑盒（批號MA0219）購自大連美侖生物技術有限公司；鼠源谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase4，GPX4）抗體、鼠源鐵蛋白重鏈1（ferritinheavychain1，FTH1）抗體、鼠源長鏈脂酰輔酶A合成酶4（long-chainacyl-CoAsynthetase4，ACSL4）抗體、鼠源β-肌動蛋白（β-actin）抗體（內參）、兔源線粒體鐵蛋白（ferritinmitochondrial，FTMT）抗體、兔源胱氨酸/谷氨酸反向轉運蛋白（cystine/glutamateanti-porter，xCT）抗體、兔源ACSL3抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗（貨號分別為67763-1-Ig、68068-1-Ig、66617-1-Ig、66009-1-Ig、10727-1-AP、DF10202、20710-1-AP、SA00002-1、SA00002-2）均購自美國Proteintech公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號20220820）購自北京蘭杰柯科技有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、Fe2+、Fe檢測試劑盒（批號分別為20230531、20230521、20230531）均購自蘇州格銳思生物科技有限公司。

1.3 實驗動物與飼料

雄性SPF級SD大鼠60只，體重（160±20）g，由江西中醫藥大學實驗動物科技中心提供，動物生產許可證號為SCXK（贛）2023-0001。大鼠架籠飼養，自然采光，實驗室通風良好，溫度、濕度適宜。實驗飼料（普通飼料和高脂飼料）由江西中醫藥大學實驗動物科技中心提供。本實驗方案經江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核，編號為20230306030。

2 方法

2.1 實驗藥物及制備

依據黃芪葛根湯原方劑量、古今度量衡、2020年版《中國藥典》（一部）所載黃芪參考用量及文獻報道[11]，本實驗參考成人日服黃芪30g、葛根15g的劑量，并依據《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》中人與大鼠體表面積換算系數（6.3），計算得到黃芪葛根配伍大鼠等效給藥劑量為4.05g/（kg·d）（以生藥總量計）。黃芪、葛根以質量比2∶1配取后，加10倍量水，浸泡0.5h，武火快速煮沸后轉文火煎煮30min，過濾；藥渣按上述方法重復提取1次，過濾；合并2次濾液，蒸發濃縮，得質量濃度為0.405g/mL（以生藥總量計）的黃芪-葛根水煎液，于4℃下保存，備用。

2.2 分組、造模與給藥

取雄性SD大鼠60只，適應性飼養1周后，測量大鼠體重及FBG并據此分為對照組（12只）和造模組（48只）。造模組大鼠給予高脂飼料連續喂養4周后以25mg/kg的劑量一次性尾靜脈注射1%鏈脲佐菌素溶液以復制T2DMIR大鼠模型；3d后，禁食、不禁水12h，檢測大鼠FBG水平，若FBG≥11.7mmol/L表示T2DMIR大鼠模型復制成功[12]。對照組大鼠以基礎飼料喂養4周后，一次性尾靜脈注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。依據體重及FBG將造模成功的大鼠隨機分為模型組、黃芪-葛根配伍組（QG組）、鐵死亡抑制劑組（Fer-1組）、黃芪-葛根配伍+鐵死亡誘導劑組（QG+erastin組），每組12只。對照組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，自由飲水，基礎飼料喂養，腹腔注射等體積生理鹽水；模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，自由飲水，高脂飼料喂養，腹腔注射等體積生理鹽水；QG組大鼠按4.05g/（kg·d）的劑量灌胃黃芪葛根水煎液，同時以高脂飼料喂養，自由飲水，腹腔注射等體積生理鹽水；Fer-1組大鼠灌胃等體積生理鹽水，并腹腔注射Fer-15mg/kg[13―14]，隔日1次，同時以高脂飼料喂養，自由飲水；QG+erastin組大鼠按4.05g/（kg·d）的劑量灌胃黃芪-葛根水煎液，并腹腔注射erastin10mg/（kg·d）[15]，同時以高脂飼料喂養，自由飲水。灌胃及腹腔注射體積均為10mL/kg，連續干預4周。實驗過程中共有14只大鼠死亡，其中模型組4只、QG組3只、Fer-1組2只、QG+erastin組5只。

2.3 大鼠一般情況觀察

每天更換墊料前觀察大鼠的一般狀態，包括大鼠的毛色、精神狀態、反應力，并記錄大鼠的飲水量及尿量等。

2.4 大鼠血清、組織采集與留存

末次干預結束后，禁食、不禁水12h，麻醉大鼠，于腹主動脈取血。血樣靜置后于4℃下以3000r/min離心10min，分離血清，于－20℃下保存，備用。取血后，迅速打開大鼠腹腔，充分暴露肝臟組織，快速取出，剪取相同部位肝臟組織，洗凈，吸干。一部分肝臟組織固定于多聚甲醛溶液中，待后續行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色；剩余肝臟組織于－80℃下凍存，用于后續相關指標及蛋白檢測。

2.5 大鼠FBG及生化指標檢測

藥物干預前及干預后使用血糖儀對各組大鼠尾尖采血，檢測FBG水平；取“2.4”項下各組大鼠的血清樣品，嚴格按照相應試劑盒說明書方法操作，使用微板法檢測各組大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平，使用全自動生化分析儀檢測AST、ALT水平。

2.6 大鼠FINS及IR相關指標檢測

取“2.4”項下各組大鼠的血清樣品，按照相應試劑盒說明書要求，采用ELISA法檢測血清中FINS水平，并按下式計算穩態模型胰島素抵抗指數（homeostasismodelassessmentofinsulinresistance，HOMA-IR）和胰島素敏感性指數（insulinsensitivityindex，ISI）：HOMA-IR＝FBG×FINS/22.5[16]；ISI＝1/（FBG×FINS）[因ISI值為非正態分布，故以其計算結果的自然對數（insulinactionindex，IAI）表示并分析][17]。

2.7 大鼠肝臟組織中脂質過氧化、內源性抗氧化活性指標及Fe2+、Fe水平檢測

取“2.4”項下各組大鼠凍存的肝臟組織樣品，按照相應試劑盒說明書要求，以羥胺法檢測各組大鼠肝臟組織中SOD、MDA水平，以比色法檢測GSH水平，以亞鐵嗪比色法檢測Fe2+、Fe水平，以微板法檢測NADP+/NADPH水平，使用流式細胞儀檢測大鼠ROS水平。

2.8 大鼠肝臟組織病理形態學觀察

取“2.4”項下各組大鼠經固定（48h）的肝臟組織，用水沖洗，經乙醇脫水后，包埋、切片；取切片，進行HE染色后，脫水封片，使用顯微鏡觀察大鼠肝臟組織病理形態并拍照[18]。

2.9 大鼠肝臟組織鐵死亡相關蛋白表達水平檢測

采用Westernblot法檢測。取“2.4”項下各組大鼠凍存的肝臟組織樣品，提取總蛋白后，以BCA法測定蛋白濃度，并將蛋白煮沸變性；配制分離膠、上樣、電泳、轉膜、洗膜、封閉；分別加入GPX4、FTH1、ACSL3、ACSL4、FTMT、xCT一抗（稀釋度均為1∶2000）及內參β-actin一抗（稀釋度為1∶10000），4℃孵育過夜；洗膜、加入相應二抗（稀釋度均為1∶10000），于室溫下孵育60min；以TBST洗膜，加入ECL化學發光試劑進行顯色，置于凝膠成像系統成像，采用ImageJ軟件進行灰度值檢測和數據分析，以目的蛋白與內參β-actin的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.10 統計學方法

使用SPSS25.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較使用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況比較

對照組大鼠反應靈敏、活躍，毛發柔順光澤，日排尿量、飲水量均正常；與對照組比較，模型組大鼠精神狀態欠佳，消瘦，毛發干枯晦暗，部分見脫毛、尾部潰爛癥狀，反應遲緩，活動減少，喜聚群，日排尿量、飲水量均顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述表現均有不同程度減輕，日排尿量、飲水量均顯著降低（P＜0.05）。

3.2 各組大鼠FBG及生化指標比較

給藥前，與對照組比較，其余各組大鼠FBG水平均顯著升高（P＜0.01）。給藥后，與對照組比較，模型組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、AST、ALT水平均顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，QG組和Fer-1組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、ALT水平均顯著降低，HDL-C水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），QG組AST水平顯著降低（P＜0.05）。與QG組比較，QG+erastin組大鼠FBG、ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.01）。結果見表1。

3.3 各組大鼠FINS及IR相關指標比較

與對照組比較，模型組大鼠FINS水平、HOMA-IR均顯著升高，IAI顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，QG組和Fer-1組大鼠FINS水平、HOMA-IR均顯著降低，IAI均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與QG組比較，QG+erastin組大鼠FINS水平、HOMA-IR均顯著升高，IAI顯著降低（P＜0.01）。結果見表2。

3.4 各組大鼠脂質過氧化、內源性抗氧化活性指標及Fe2+、Fe水平比較

與對照組比較，模型組大鼠GSH、SOD水平均顯著降低，MDA、ROS、Fe2+、Fe水平和NADP+/NADPH均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，QG組與Fer-1組大鼠GSH、SOD水平均顯著升高，MDA、ROS、Fe2+、Fe水平和NADPH/NADP+均顯著降低（P＜0.01）。與QG組比較，QG+erastin組大鼠GSH、SOD水平均顯著降低，MDA、ROS、Fe2+、Fe水平和NADP+/NADPH均顯著升高（P＜0.01）。結果見表3。

3.5 各組大鼠肝臟組織病理學比較

對照組大鼠肝臟組織內細胞形態正常，細胞排列整齊，肝小葉結構清晰，未見明顯炎癥細胞浸潤、肝細胞空泡和脂肪變性，胞質含粉紅色嗜酸性顆粒。與對照組比較，模型組大鼠肝臟組織內肝細胞排列紊亂、腫脹，細胞核染色加深，可見較多炎癥細胞浸潤和大量肝細胞空泡、脂肪變性。與模型組比較，QG組與Fer-1組大鼠肝臟組織的病理損傷均有不同程度改善。與QG組比較，QG+erastin組大鼠肝臟組織的病理損傷未見明顯改善，且肝細胞腫脹嚴重，可見較多炎癥細胞浸潤和大量肝細胞空泡、脂肪變性。結果見圖1。

3.6 各組大鼠肝臟組織中鐵死亡相關蛋白表達比較

與對照組比較，模型組大鼠肝臟組織中GPX4、FTH1、FTMT、xCT、ACSL3T蛋白表達均顯著下調，ACSL4蛋白表達顯著上調（P＜0.01）。與模型組比較，QG組和Fer-1組大鼠肝臟組織中GPX4、FTH1、FTMT、xCT、ACSL3蛋白表達均顯著上調，ACSL4蛋白表達均顯著下調（P＜0.05或P＜0.01）。與QG組比較，QG+erastin組大鼠肝臟組織中GPX4、FTH1、FTMT、xCT、ACSL3蛋白表達均顯著下調，ACSL4蛋白表達顯著上調（P＜0.01）。結果見表4、圖2。

4 討論

目前，我國現有糖尿病患者數量居世界首位，且全世界每年因該病及其并發癥死亡的人數居高不下[1]，其中90%以上為T2DM患者[19]。在T2DM胰島β細胞功能障礙和IR這兩大主要病理表現中，IR是關鍵環節之一，參與了T2DM的發生，并貫穿整個病程。有學者提出，治療T2DM時，若僅改善胰島β細胞功能而未對IR進行干預則效果欠佳[2]?？梢?，積極改善IR是治療T2DM的關鍵策略，具有重要的臨床意義。

T2DM及IR屬中醫學“消渴”范疇，脾氣虛乃消渴發生的內在因素，健脾益氣升陽為主要治法[20]。黃芪與葛根配伍，辛甘而溫，有健脾益氣、升清止渴之功，可用治于屬“消渴”范疇之T2DM及IR。本研究結果顯示，黃芪-葛根配伍可顯著降低T2DMIR大鼠血清FBG、TC、TG、LDL-C、AST、ALT、FINS水平及HOMA-IR，升高HDL-C水平和IAI，表明該配伍確有降血糖、減輕IR、治療T2DM之功效。

以鐵過載及脂質過氧化物蓄積為特征的鐵死亡可誘發包括T2DM及IR在內的大量疾病[21]，而胰島素靶器官肝臟是最有可能被鐵過載累及的器官之一[8]。研究指出，抑制肝細胞鐵死亡的發生可能是緩解和治療T2DMIR的有效手段。鐵水平是鐵死亡發生的重要條件，且在機體鐵穩態中，FTH1具有重要的鐵儲存作用，當該蛋白表達減少，可使細胞內Fe2+水平上升，誘發芬頓反應，使ROS大量蓄積，從而促進氧化應激發生[22]；ACSL4是鐵死亡過程中的必需因子，其表達產物在滅活GPX4、促進鐵死亡的進展中扮演著重要角色[6]；多不飽和脂肪酸可促進鐵死亡，ACSL3可將單不飽和脂肪酸催化為單不飽和脂肪酸乙酰輔酶A，進而與多不飽和脂肪酸拮抗脂質過氧化的不良效應；NADP+/NADPH可反映肝臟組織脂質過氧化水平；GPX4具有抑制脂質過氧化、清除脂質過氧化物、維持細胞內氧化還原穩態的作用，其表達下調通常被認為是鐵死亡發生的關鍵；xCT在GSH的合成、細胞內GSH含量的維持、抑制細胞氧化應激損傷方面具有重要作用，是細胞抵抗鐵死亡的重要因素[23―24]；FTMT在維持細胞鐵穩態和防止ROS生成的過程中起著重要作用，可通過減少細胞氧化應激和ROS使線粒體鐵依賴性氧化損傷減少[25]，在保護線粒體免受鐵過量引起的鐵死亡損傷方面發揮重要作用[26]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠肝臟組織中FTH1蛋白的表達顯著降低，血清Fe2+及Fe水平均顯著升高，提示模型組大鼠肝組織中出現明顯的鐵過載；經黃芪-葛根配伍水煎液或Fer-1干預后，大鼠肝臟組織中FTH1蛋白的表達上調，血清Fe2+及Fe水平均顯著降低，說明黃芪-葛根配伍可有效緩解T2DMIR大鼠肝組織中的鐵負荷。本研究結果還顯示，與對照組比較，模型組大鼠肝臟組織中ROS、MDA、ACSL4的表達及NADP+/NADPH均顯著升高，GSH、SOD及ACSL3表達顯著降低，提示模型組大鼠肝臟組織氧化應激反應增強，存在較高水平的脂質過氧化和明顯的氧化損傷；經黃芪-葛根配伍水煎液或Fer-1干預后，大鼠肝臟組織中ROS、MDA、ACSL4的表達及NADP+/NADPH均顯著降低，SOD、GSH及ACSL3的表達均顯著升高，提示黃芪-葛根配伍水煎液可有效減輕T2DMIR大鼠氧化應激損傷，拮抗脂質過氧化及出現的不良效應。此外，本研究結果還顯示，與對照組大鼠比較，模型組大鼠肝臟組織中GPX4、xCT、FTMT的表達均顯著降低，提示模型組大鼠發生鐵死亡；經黃芪-葛根配伍水煎液或Fer-1干預后，GPX4、xCT、FTMT表達顯著升高，提示黃芪-葛根配伍水煎液可抑制T2DMIR大鼠體內鐵死亡的發生。為了進一步驗證鐵死亡在黃芪-葛根配伍水煎液改善T2DM大鼠IR中的作用，本研究在黃芪-葛根配伍水煎液的基礎上加用了鐵死亡激活劑erastin，結果顯示，erastin可顯著逆轉該水煎液對T2DMIR大鼠各定量指標的改善作用，提示其改善T2DMIR的作用可能是通過抑制鐵死亡實現的。

綜上所述，黃芪-葛根配伍水煎液可降低T2DMIR大鼠的FBG水平，減輕其IR程度和肝臟組織鐵負荷，緩解大鼠肝臟組織病理損傷，上述作用與其抑制鐵死亡有關。但本研究并未通過體外實驗以進一步證實鐵死亡與肝臟組織損傷之間的具體聯系，尚待進一步探索，以明確其作用機制。