腸道菌群體外酵解不同種類單糖研究

摘 要：碳水化合物的結構特征影響著其被微生物的利用效果，為了探究其結構對腸道菌群的影響，本文從單糖組成角度入手，研究了以葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、巖藻糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸這九種單糖作為碳源，在進行體外培養的過程中，腸道菌群及其代謝產物發生的變化.主要檢測了OD600、糖消耗量、短鏈脂肪酸和乳酸含量等指標.經過篩選后，對七種中性單糖混合發酵的培養基進行了單糖組成分析，明確了七種中性單糖在酵解過程中的被利用順序.以16S rRNA高通量測序分析了腸道菌群群落多樣性和豐度變化，發現不同單糖在被乳酸桿菌等有益菌利用的過程中存在競爭關系，甘露糖和半乳糖有利于腸道中的乳酸桿菌屬等有益菌的生長繁殖，研究結果將為多糖與腸道菌群的構效關系研究提供了理論依據.

關鍵詞：單糖組成； 體外酵解； 短鏈脂肪酸； 腸道菌群； 多樣性分析

中圖分類號：TS201.4

文獻標志碼： A

Study on the in vitro fermentation of different types of monosaccharides by gut microbiota

HAO Jun-yu1， SUN Yu-jiao1，2*， GAO Run-ning1， YAO Jia-xuan1

（1.School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China; 2.Shaanxi Agricultural Products Processing Technology Research Institute， Xi′an 710021， China）

Abstract：The structural characteristics of carbohydrates affect their utilization efficiency by microorganisms.In order to explore the effect of their structure on gut microbiota，this article starts from the perspective of monosaccharide composition and studies the changes in gut microbiota and its metabolites during in vitro culture using nine monosaccharides including glucose，mannose，arabinose，galactose，fucose，xylose，xylose，rhamnose，glucuronic acid，and galacturonic acid as carbon sources.Mainly tested indicators such as OD600，sugar consumption，short chain fatty acids，and lactate content.After screening，the monosaccharide composition of the culture medium for mixed fermentation of seven neutral monosaccharides was analyzed，and the utilization order of the seven neutral monosaccharides in the fermentation process was clarified.The diversity and abundance changes of gut microbiota were analyzed using high-throughput sequencing of 16S rRNA.It was found that different monosaccharides compete with beneficial bacteria such as lactobacilli in the process of utilization.Mannose and galactose are beneficial for the growth and reproduction of beneficial bacteria such as Lactobacilli in the gut.The research results will provide a theoretical basis for the study of the structure-activity relationship between polysaccharides and gut microbiota.

Key words：monosaccharide composition；" in vitro fermentation； short chain fatty acids； gut microbiota； diversity analysis

0 引言

多糖是一類由醛糖或酮糖等單糖通過糖苷鍵組成的復雜高分子化合物.多糖來源廣泛，可從動物、植物和微生物中獲取，具有多種生物活性，在生物、制藥、食品等領域得到了廣泛的研究和應用［1］.但由于多糖結構復雜多樣，導致其確切的構效關系研究仍不清楚.

單糖作為組成多糖的最基本單位，是影響多糖結構特征的重要因素.單糖組成可以通過影響多糖的糖苷鍵、官能團和空間構象等結構特征，進而影響多糖的溶解度、流變性和生物活性［2］.研究發現單糖會影響多糖的抗氧化、抗炎等活性.例如阿拉伯糖、半乳糖和糖醛酸含量的升高，使牛膝多糖提取物對ABTS、DPPH、羥基自由基和超氧陰離子的體外清除活性增強［3］；香菇多糖中甘露糖和鼠李糖的含量的增加與其抗氧化活性呈正相關，而葡萄糖和阿拉伯糖的含量的增加則呈負相關［4］；高含量的巖藻糖和半乳糖會增強從日本糖精中純化的巖藻聚糖（LJNF3）的抗炎活性［5］；而高含量的阿拉伯糖和半乳糖可以顯著提高枸杞多糖（LBGP-I-3）的抗炎活性［6］.

腸道作為人體內最大的微生態系統，棲息著數量及種類龐雜的腸道菌群來維持宿主健康［7］.有些多糖具有選擇性地刺激有益微生物群生長的能力，這些多糖可以添加到功能食品中，以改善腸道菌群和調節機體健康［8］.而這種調節腸道菌群并發揮多種生物活性的能力，在很大程度上依賴于其結構特征［9］.研究發現單糖的組成和比例會影響多糖對腸道菌群的調節作用，單糖通過影響多糖的利用率和被腸道菌群降解的代謝產物類型來影響多糖的益生活性.多糖的單糖組成越復雜，調節細菌活性的能力越強［10］.甜菜中果膠多糖側鏈上的中性糖更容易被腸道菌群利用發酵，并有助于雙歧桿菌、乳桿菌的增加［11］.富含阿拉伯糖和甘露糖的多糖更容易被腸道菌群利用，提高植物乳桿菌、發酵乳桿菌的比例［12］.但當前研究多是以多糖為整體研究對象，推測單糖對腸道菌群的調節功能，具體各種單糖的酵解特征及其發揮的調節功能尚不清楚.因此，本文以多糖中常見的9種單糖入手，從單糖組成的角度研究其具體的酵解行為.研究結果可為深入研究多糖結構對腸道菌群的調節作用和篩選具有益生功能的多糖提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 主要材料

鼠李糖（Rhamnose，Rha）、巖藻糖（Fucose，Fuc）、阿拉伯糖（Arabinose，Ara）、木糖（Xylose，Xyl）、甘露糖（Mannose，Man）、葡萄糖（Glucose，Glc）、半乳糖（Galactose，Gal）、葡萄糖醛酸（Glucuronic acid，GlcA）及半乳糖醛酸（Galacturonic acid，GalA）" 上海阿拉丁化工有限公司；糞便樣品由年齡22～25歲的三位志愿者提供，所選志愿者身體狀況良好、健康，飲食正常，6個月內無腸道疾病，3周內未服用過益生菌或抗生素.

1.1.2 主要儀器

GC-2010 Pro氣相色譜儀 日本島津公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；ZDX-250B厭氧培養箱 天津市通利信達儀器廠；T2600紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；CT15RT臺式高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設備公司；BXM-30R立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海圣科儀器公司；ABI7300熒光定量 PCR儀 Applied Biosystems.

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配置

稱取胰蛋白胨2 g/L、酵母浸粉2 g/L、氯化鈉0.1 g/L、磷酸氫二鉀0.04 g/L、磷酸二氫鉀0.04 g/L、硫酸鎂0.01 g/L、氯化鈣0.01 g/L、碳酸氫鈉2 g/L、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L、牛膽鹽0.5 g/L、血紅素0.05 g/L、VK3 0.01 g/L、吐溫80 2 mL/L，糖添加量為0.5%［13］，充分攪拌，于121 ℃高溫滅菌20 min備用.

1.2.2 九種單糖的體外酵解

將人體腸道菌群樣本用PBS溶液沖洗，四層紗布過濾，收集濾液離心，棄上清取沉淀，重復2～3次后，將分離所得人體糞便菌群樣本與60%無菌甘油1∶1（v/v）混合保存在凍存管，于-80 ℃冰箱儲存.

體外酵解前利用培養基將菌群樣本于37 ℃活化培養24 h，并按10%接種量分別接種于以Rha、Fuc、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal、GlcA及GalA為碳源的培養基中［14］，以未加碳源組為空白對照.在37 ℃厭氧培養24 h后，于600 nm處測定OD值，離心分離上清液和菌體沉淀，分別凍存.

1.2.3 九種單糖體外酵解的理化性質測定

（1）酵解前后糖消耗量的測定

采用苯酚硫酸法檢測總糖含量［15］.稱取葡萄糖標品10 mg，定容至100 mL，得濃度為0.1 mg/mL的標準品溶液.依次吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL，補水至2.0 mL，加80%（w/w）苯酚溶液50 μL，98%濃硫酸2.5 mL，充分振搖，室溫放置20 min.于490 nm波長處測定吸光度.取50 μL酵解前后培養基上清液，重復上述操作，測定其吸光度，計算樣品的總糖含量和總糖消耗量.

（2）短鏈脂肪酸的測定

采用氣相色譜法測定短鏈脂肪酸及乳酸含量.短鏈脂肪酸衍生化：酵解后樣品離心取上清液，加入硫酸，混勻，加入乙醚，混勻，離心吸取上層有機相，進行氣相色譜分析.乳酸衍生化：酵解后樣品離心取上清液，100 ℃水浴10 min，加入硫酸溶液并搖勻，加入甲醇，58 ℃水浴30 min，加入蒸餾水和二氯甲烷，混勻，離心吸取上層有機相，進行氣相色譜分析［16］.

氣相色譜檢測條件：使用島津公司GC-2010 Pro氣相色譜儀，AT-LZP-930色譜柱（50.0 m×0.32 mm×0.32 mm），火焰離子檢測器.以5 ℃/min的速率從80 ℃升溫至120 ℃，以60 ℃/min的速率從120 ℃升溫至200 ℃，再以6 ℃/min的速率從215 ℃升溫至240 ℃.載氣：氮氣流速：3.63 mL/min；線速：48.3 mL/min；進樣體積：1 μL；分流比47.8∶1.進樣口溫度和檢測器溫度均為250 ℃.

1.2.4 九種單糖體外酵解后乳酸菌含量的測定

（1）引物設計

在NCBI上查找得到乳酸菌通用引物LactobacillusF_LactobacillusR，由上海生工公司合成.引物序列信息如表1所示.

（2）樣品DNA的提取

向經不同單糖酵解收集所得的沉淀物內分別加入1 mL無菌水，混勻后即可得到供試菌株DNA樣本.

（3）實時熒光定量PCR檢測

按照表2所示，在冰上配置反應液.

完成上述步驟后，將樣本置于ABI 7300型熒光定量PCR儀中，以表3所示條件反應，通過標準曲線進行定量分析［17］.

1.2.5 七種單糖體外酵解后單糖組成測定

根據上述研究，選擇糖消耗量較高、短鏈脂肪酸和乳酸產量較高的七種單糖進行混合酵解培養，包括葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、巖藻糖、木糖、鼠李糖.體外酵解方法同章節1.2.2.

采用GC測定樣品的單糖組成，根據我們之前的方法進行樣品的衍生化［18］.在進行氣相檢測時，使用內標物肌醇和七種單糖標準品：Rha、Fuc、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal進行相同衍生化處理.氣相色譜檢測條件：使用GC-2010 Pro氣相色譜儀，Rtx-50色譜柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 mm），火焰離子檢測器（FID）.具體如下：升溫程序：以5 ℃/min的速率從80 ℃升溫至120 ℃，以60 ℃/min的速率從120 ℃升溫至200 ℃，再以6 ℃/min的速率從215 ℃升溫至240 ℃，240 ℃保溫半小時.載氣：氫氣；流速：0.88 mL/min；進樣體積：0.5 μL；分流比19∶1.進樣口溫度和檢測器溫度分別為270 ℃和280 ℃.

1.2.6 七種單糖體外酵解后多樣性分析

（1）細菌基因組DNA的提取

在0.1 g小鼠糞便（小鼠模型來自前人實驗）中加入1 mL無菌雙蒸水于1.5 mL的EP管中，浸泡10 min后充分振蕩搖勻15 s，于100 ℃水浴10 min，冷卻后10 000 r/min、離心10 min，取上清待用［19］.

（2）16S rRNA基因高通量測序

在Illumina Miseq官方平臺采用通用引物338F和806R對DNA樣本進行PCR擴增，對16S rRNA 基因的V3-V4可變區進行高通量測序.獲得的序列數據經過嚴格的質量控制和篩選，確保數據的準確性.對樣本進行區分，執行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的聚類分析及物種的分類學鑒定.基于OTU的結果，采用Mothur（v.1.30.2）進行稀釋曲線和Alpha多樣性分析；采用R Core Team（v.3.3.1）進行樣品的Beta多樣性分析和物種組成分析［20］，所有數據均在美吉云在線平臺上進行分析.

1.3 數據分析

每組實驗數據平行測定3次以上取平均值，實驗結果用平均值±標準差（M±SD）的形式表示.使用SPSS Staistics 26.0處理數據，進行相關性和顯著性檢驗，plt;0.05表示差異顯著，使用Origin 9.8作圖.

2 結果與討論

2.1 九種單糖的體外酵解結果分析

通過測定各個單糖培養基酵解后的OD600值，可知腸道菌群體外酵解的生長情況［21］，其結果如圖1所示.半乳糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖和阿拉伯糖的OD600值較高，說明其培養基中腸道菌群生長情況較好.而葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸培養基中的OD600值較低，可能是由于酸性糖更不利于腸道菌群繁殖.

2.2 酵解前后糖消耗量的測定結果分析

測定九種單糖培養基酵解前后糖含量，結果如表4所示.腸道菌群在不同單糖培養基中進行厭氧培養，九種單糖的消耗量具有顯著性差異（p＜0.05）.其中巖藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖和半乳糖的糖消耗量最高，分別為64.61±7.96%、60.50±6.43%、68.46±6.32%、66.19±8.43%和64.30±11.16%；葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的消耗量較低，分別為43.79±5.87%和37.47±11.14%.這表明腸道菌群更偏好利用中性單糖，對酸性單糖的利用程度較低.這與Onumpai等［22］的研究結果一致，中性糖比酸性糖更容易發酵.

2.3 短鏈脂肪酸的測定結果分析

采用氣相色譜法測定培養基中乙酸、丙酸、丁酸和乳酸含量，其結果如表4所示.各組培養基中，短鏈脂肪酸含量具有顯著性差異（p＜0.05），乙酸、丙酸含量差異較小，鼠李糖和阿拉伯糖培養基的短鏈脂肪酸產量較高，而丁酸未有檢出；乳酸產量差異較大，其中阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖培養基中的乳酸產量較高，分別為14.45±0.21 mmol/L、15.44±1.22 mmol/L、13.98±1.04 mmol/L以及13.46±0.25 mmol/L.

由結果可知，在各組培養基之間，乳酸產量變化比短鏈脂肪酸更大，可能是不同單糖對腸道乳酸菌的生長影響不同.在腸道菌群利用碳水化合物產生短鏈脂肪酸的過程中，乳酸可在乳酸脫羧酶的催化下進一步轉化為乙酸，因而可促進乙酸的堆積［23］.大量乳酸的堆積勢必會導致乙酸含量的上升.而乙酸作為最主要的短鏈脂肪酸，可促進膽固醇和脂肪酸的合成，也可抑制促炎因子的產生，有利于宿主代謝調節［24］.因此后續將研究腸道菌群中乳酸菌的變化，乳酸菌含量的增加有利于短鏈脂肪酸含量的增加.

2.4 酵解后乳酸菌含量的測定

乳酸的大量堆積可能是由于腸道菌群中乳酸菌的大量繁殖，因此采用qPCR技術對酵解后菌體中的乳酸菌含量進行檢測，以空白培養基和九種單糖及其混合培養基酵解后的菌體沉淀互為對照，結果如圖2所示.阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖培養基酵解后的菌體沉淀中乳酸菌的含量較高.這表明六碳糖更容易被乳酸菌酵解利用.而葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸培養基菌體沉淀中乳酸菌的含量較高，是由于乳酸菌可以在這兩種酸性糖培養基中生長繁殖，但葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸作為碳源不能促進有機酸的產生，即不能產生短鏈脂肪酸［25］.研究發現，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸與多糖的益生元活性呈負相關，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸含量的增加不利于腸道菌群對多糖的酵解［26］.

2.5 腸道菌群糖利用途徑分析

通過KEGG分析并繪制在厭氧條件下的微生物利用糖途徑，如圖3所示.腸道菌群利用不同種單糖過程的差異可能受微生物所產生酶的多少、利用途徑的長短影響，這種影響可能導致單糖在被腸道菌群消耗和利用時存在優先級順序和競爭關系.

由圖3可知，在葡萄糖、半乳糖和甘露糖這三種六碳糖中，葡萄糖的利用途經最短且所需酶種類更少，故推測葡萄糖被優先利用，其次是甘露糖和半乳糖；五碳糖中木糖和阿拉伯糖的利用途徑較為類似，且利用途徑中可相互轉換，可能同時被利用，而巖藻糖利用途徑中所需的酶種類多且存在稀少，利用途徑更長，所以可能在最后被利用.綜上所述，經推斷七種中性單糖的利用順序為葡萄糖gt;甘露糖gt;半乳糖gt;木糖和阿拉伯糖gt;鼠李糖gt;巖藻糖.

2.6 七種單糖體外酵解后單糖組成分析

基于上述研究，將七種中性單糖進行體外混合酵解培養，對不同時間段的培養基上清液進行單糖組成分析.經衍生化后，使用氣相色譜法測定每種單糖的消耗情況，肌醇作為內參標記［27］，結果如圖4、圖5所示.

葡萄糖在酵解的前3 h消耗完全；甘露糖在第6 h消耗完全；半乳糖在第12 h消耗完全；木糖、阿拉伯糖在第24 h消耗完全；鼠李糖在第48 h消耗完全；而在第72 h仍然能檢測到巖藻糖.

由此可知，七種中性單糖在酵解過程中，首先消耗六碳糖，之后消耗五碳糖，而巖藻糖可能在酵解中較少被利用.這表明腸道菌群在體外酵解過程中，單糖是分別被消耗利用的，這種利用在先后關系上是具有選擇性的.對于由不同單糖組成的多糖，顯然也會受這種選擇性的影響，產生被利用效率上的差異.推測七種中性單糖被腸道菌群利用的順序依次為葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖.與Liu等［28］研究結果一致，在多糖的單糖組成中，益生菌優先利用多糖中的葡萄糖，其次是甘露糖、半乳糖和木糖等其他單糖.

2.7 七種單糖體外酵解微生物多樣性分析

2.7.1 微生物多樣性的Alpha多樣性分析

Alpha多樣性常用來指示某個特定的區域或者生態系統內的物種或種群的物種豐度和多樣性［29］.對七種中性單糖體外發酵0 h（H0）、3 h（H3）、6 h（H6）、12 h（H12）、24 h（H24）、48 h（H48）、72 h（H72）的腸道菌群進行豐富度和多樣性分析，需先通過樣本的稀釋曲線圖來評估各個樣本是否處于合適的測序深度.對各個樣本在不同的測序深度下的OTU水平豐度分布進行隨機抽樣，繪制出稀釋曲線，如圖6所示.曲線趨向平坦，說明測序數據量漸進合理，本次測序量足夠覆蓋樣本中的“所有”微生物，更多的數據量只會產生少量的OTU.而稀釋曲線最終都趨于平緩，表明測序數據深度和樣本量的科學可行.圖中H3和H24的測序深度較高，說明其物種多樣性較高.

進行Alpha多樣性指數分析，比較不同樣本之間的豐富度和多樣性，結果如表5所示.隨著時間的推移，腸道菌群的ACE值和Chao1指數趨近同一水平，從0 h開始直至24 h達到峰值，隨后又開始下降.由Shannon指數和Simpson指數可知在整個酵解過程中，腸道菌群豐度經歷了先升高再降低的過程，其峰值位于第24 h.這表明第24 h的群落多樣性最高.檢測同時采用the Good′s coverage衡量物種覆蓋度，各個樣本的coverage值均較高，故樣本中各物種的測出率較高［30］.綜上所述，在腸道菌群體外酵解的第24 h時微生物的豐度和多樣性最高，結果與稀釋曲線所示一致.

2.7.2 微生物多樣性的Beta多樣性分析

Beta多樣性分析主要用于從菌群豐度以及物種組成兩個層面考察樣本間的差異［31］.研究七種中性單糖進行混合體外酵解過程中，不同時間段腸道菌群的差異性.樣本層級聚類分析如圖7所示，基于OTU的樣本層級聚類樹顯示了各組樣本的聚類情況，H0、H48、H72和H3、H6、H12、H24分開聚類.其中在酵解0～48 h內，腸道菌群主要利用除巖藻糖外的其余六種單糖，OTU組成比例發生變化，H3、H6、H12、H24被聚為一類.酵解48 h后，僅剩巖藻糖被腸道菌群利用，其余單糖均消耗完全，腸道菌群的豐度和多樣性組成恢復至與H0時相近的狀態，H0、H48、H72被聚為一類.

基于Bray-Curtis距離進行樣本層級聚類分析并得到距離Heatmap圖，如圖8所示，表明不同時間樣品在OTU水平上的微生物群落豐富度和多樣性存在顯著差異.綜上所述，H3、H6、H12和H24的物種豐度和多樣性相似，其中H24的物種豐度最高，而H48和H72與其他時間段物種豐度間的差異可能是因為腸道菌群酵解的單糖發生改變.

對各個樣本在數據庫中注釋所得OTU水平的組成譜進行PCoA分析，研究不同時間體外酵解下腸道菌群的差異性.由圖9（a）可知，主坐標分析中PC1和PC2貢獻率分別為54.85%和13.02%，且H0、H48和H72的樣本聚集在同一區域，說明三組樣本的菌群結構較為相似；H3、H6、H12和H24的樣本聚集在同一區域，說明這四組樣本的菌群結構相似.基于Bray-Curtis距離樣本層級聚類分析與PCoA主坐標分析結果一致，不同單糖被腸道菌群利用時具有顯著差異性.為進一步反應各個樣本距離矩陣的數值排列信息，進行OTU水平上的非度量多維尺度分析（Non-metric multidimensional scaling，NMDS），NMDS是保留對象間原始關系不變，將多維空間的研究對象簡化到低維空間進行定位、分析和歸類的數據分析方法［32］，結果如圖9（b）所示.

進一步驗證了H0、H48和H72之間以及H3、H6、H12和H24之間菌群結構的相似性，并且各時間段的樣本分離的較開，這反映了腸道菌群在利用不同單糖時具有差異性.其中stress＜0.1，證明NMDS結果具有良好的代表性.

2.8 七種單糖體外酵解后物種組成分析

對不同時間段腸道菌群樣本測序，繪制菌群物種分類組成和豐度分布柱狀圖，進一步對各個樣本的群落結構組成及相對豐度研究，其具體物種分類組成和豐度分布如圖10所示.腸道菌群的菌落結構隨時間的推移在門水平上發生了變化，主要鑒定出3個優勢菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）.其中Firmicutes在酵解的前24 h占據主導地位（H0：84.71%，H3；98.29%，H6：92.16%，H12：98.96%，H24：94.79%）；而酵解的第48 h，Proteobacteria的占比有上升（H48：52.11%，H72：44.17%）；在酵解的第24 h，Actinobacteria的豐度大幅增加.Firmicutes是主要的優勢菌門，后續將主要對其從屬水平進行研究.

如圖11所示，腸道菌群在科水平上鑒定的主要優勢菌科有乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、腸球菌科（Enterococcaceae）以及動球菌科（Planococcaceae）.不同時間段的微生物群落具有較大差異.在酵解前的H0，優勢菌科分別為Lactobacillaceae：31.62%、Streptococcaceae：11.16%、Enterobacteriaceae：15.24%、Leuconostocaceae：30.30%、Enterococcaceae：11.61%；在酵解的24 h階段，樣本的微生物群落發生變化，在物種豐富度和多樣性上有大幅提高，其優勢菌科分別為Lactobacillaceae：5.20%、Streptococcaceae：59.93%、Enterobacteriaceae：3.73%、Leuconostocaceae：19.97%、Enterococcaceae：1.44%、Planococcaceae：5.27%、Bacillacea：1.01%以及Clostridiaceae：0.88%；在酵解的后期，樣本的微生物豐富度降低，其優勢菌科分別為Lactobacillaceae（H48：38.03%、H72：51.03%）、Streptococcaceae（H48：6.72%、H72：2.84%）、Enterobacteriaceae（H48：52.08%、H72：44.16%）、Leuconostocaceae（H48：3.00%、H72：1.08%）.作為主要的優勢菌科，乳酸桿菌產乳酸，并在調節機體免疫和維持腸道屏障功能方面發揮重要作用，是腸道中重要的有益菌［33］，因此有必要研究Lactobacillaceae科下菌屬在酵解中的變化.

如圖12所示，在屬水平上腸道菌群的優勢菌屬包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、魏斯氏菌屬（Weissella）、腸球菌屬（Enterococcus）以及大腸桿菌志賀菌屬（Escherichia-Shigella），不同酵解時間的微生物群落具有較大差異.作為可以調節人體免疫的有益菌，Lactobacillus的豐度在酵解過程中經歷了升高、降低、再升高的過程（H0：31.62%、H24：5.20%、H48：38.03%、H72：51.03%），在酵解24 h豐度降低到最低.根據之前對單糖組成的研究，推測Lactobacillus的豐度變化可能是不同時間利用的單糖不同所致.在酵解0～3 h中，主要利用的是葡萄糖，Lactobacillus的豐度有所下降.在酵解3～6 h中，主要利用的是甘露糖，Lactobacillus的豐度大幅增加.在酵解6～12 h中，主要利用的是半乳糖，Lactobacillus的豐度有所下降，但仍比酵解0 h時高.在酵解12～24 h中，主要利用的是木糖和阿拉伯糖，Lactobacillus的豐度大幅降低，降至酵解最低豐度.在酵解24～48 h中，主要利用的是鼠李糖，Lactobacillus的豐度大幅增加.在酵解48～72 h中，Lactobacillus的豐度有所增加，這可能是利用了少量的巖藻糖.綜上所述，甘露糖、半乳糖和鼠李糖有利于Lactobacillus的生長繁殖，葡萄糖、木糖和阿拉伯糖會抑制Lactobacillus的豐度增加，而巖藻糖雖然只有少量被利用，但仍然導致了Lactobacillus的豐度增加，推測可能是巖藻糖被Lactobacillus的利用效率更高.Wang等［34］證實，由半乳糖和葡萄糖等中性糖組成的油菜籽多糖顯著（plt;0.05）促進了乳酸桿菌等益生菌的生長.

Lactococcus是潛在的益生菌，有助于防止代謝紊亂［35］.其豐度在酵解過程中變化較大（H0：11.16%、H24：59.92%、H48：6.72%、H72：2.84%），其豐度在24 h最高，可能是木糖和阿拉伯糖有利于Lactococcus繁殖.部分Weissella菌株作為潛在的有益菌受到越來越多的關注，它們在控制牙周病方面具有很高的潛力［36］.其豐度在酵解過程中變化較大（H0：30.30%、H24：19.97%、H48：3.01%、H72：1.88%），其豐度在12 h和24 h較高，可能是半乳糖、木糖和阿拉伯糖有利于Weissella繁殖.Patel等［37］發現，木寡糖提高了Weissella的乳酸和乙酸產量，表明其具有較好的益生潛力.

由此可見，多糖的單糖組成可能會影響多糖被腸道菌群利用的方式和程度，這可能對腸道菌群的組成及代謝物的產生具有一定的影響.

3 結論

本研究利用九種單糖對腸道菌群進行體外酵解培養，探討了單糖對腸道菌群多樣性和豐度的影響.發現阿拉伯糖和甘露糖有利于總腸道菌群豐度的增加和總代謝產物的產生.對七種中性單糖體外酵解的培養基上清液進行單糖組成測定，發現腸道菌群對單糖的利用存在先后順序，依次為葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖.對腸道菌群進行微生物多樣性分析，其中甘露糖、半乳糖、鼠李糖和巖藻糖有利于Lactobacillus的生長繁殖，葡萄糖、木糖和阿拉伯糖會抑制Lactobacillus的豐度增加.而木糖和阿拉伯糖有利于Lactococcus繁殖.半乳糖、木糖和阿拉伯糖有利于Weissella繁殖.這為后續研究多糖結構對腸道菌群的調節作用提供了理論支撐.

參考文獻

［1］ Sun Y J，Cui X Y，Duan M M，et al.In vitro fermentation of κ-carrageenan oligosaccharides by human gut microbiota and its inflammatory effect on HT29 cells［J］.Journal of Functional Foods，2019，59：80-91.

［2］ Wang Z，Zhou X，Sheng L，et al.Effect of ultrasonic degradation on the structural feature，physicochemical property and bioactivity of plant and microbial polysaccharides：A review［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2023，236（11）：123 924.

［3］ Yi J，Li X，Wang S，et al.Steam explosion pretreatment of Achyranthis bidentatae radix：Modified polysaccharide and its antioxidant activities［J］.Food Chemistry，2022，375（2）：131 746.

［4］ Lo T C T，Chang C A，Chiu K H，et al.Correlation evaluation of antioxidant properties on the monosaccharide components and glycosyl linkages of polysaccharide with different measuring methods［J］.Carbohydrate Polymers，2011，86（1）：320-327.

［5］ Chen X，Ni L，Fu X，et al.Molecular mechanism of anti-inflammatory activities of a novel sulfated galactofucan from Saccharina japonica［J］.Marine Drugs，2021，19（8）：430.

［6］ Gong G，Dang T，Deng Y，et al.Physicochemical properties and biological activities of polysaccharides from Lycium barbarum prepared by fractional precipitation［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2018，109：611-618.

［7］ Lee S G，Kaya A，Avanesova S，et al.Age-associated molecular changes are deleterious and may modulate life span through diet［J］.Science Advances，2017，3（2）：e1 601 833.

［8］ Tan H Z，Nie S P.Functional hydrocolloids，gut microbiota and health：Picking food additives for personalized nutrition＼.FEMS Microbiology Reviews，2021，45（4）：1-18.

［9］ Chen Q，Fan J，Lin L，et al.Combination of Lycium barbarum L.and Laminaria japonica polysaccharides as a highly efficient prebiotic：Optimal screening and complementary regulation of gut probiotics and their metabolites［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2023，246：125 534.

［10］ Zhang D，Liu J，Cheng H，et al.Interactions between polysaccharides and gut microbiota：A metabolomic and microbial review［J］.Food Research International，2022，160：111 653.

［11］ Yu C，Ahmadi S，Shen S，et al.Structure and fermentation characteristics of five polysaccharides sequentially extracted from sugar beet pulp by different methods［J］.Food Hydrocolloids，2022，126：107 462.

［12］ Huang F，Liu H J，Zhang R F，et al.Physicochemical properties and prebiotic activities of polysaccharides from longan pulp based on different extraction techniques［J］.Carbohydrate Polymers，2019，206：344-351.

［13］ Ramnani P，Chitarrari R，Tuohy K.In vitro fermentation and prebiotic potential of novel low molecular weight polysaccharides derived from agar and alginate seaweeds［J］.Anaerobe，2012，18（1）：1-6.

［14］ 龔 雯，唐 婕，韋雅淵，等.金花茶多糖的體外消化及酵解特性研究［J］.食品工業科技，2021，42（24）：31-39.

［15］ 唐婷范，李雪松，盧夢影，等.陳皮多糖提取工藝及其抗氧化活性研究［J］.中國調味品，2024，49（5）：183-187，204.

［16］ Sun Y J，Liu Y，Ai C Q，et al.Caulerpa lentillifera polysaccharides enhance the immunostimulatory activity in immunosuppressed mice in correlation with modulating gut microbiota［J］.Food and Function，2019，10（7）：4 315-4 329.

［17］ 俞 漪，顧晨榮，張娜娜，等.定量PCR技術檢測殺菌型產品中乳酸菌［J］.食品安全質量檢測學報，2020，11（13）：4 507-4 513.

［18］ 孫玉姣.硫酸化寡糖與多糖的質譜分析研究［D］.西安：西北大學，2016.

［19］ 張 杰，張曉鵬，李鵬高，等.小鼠糞便細菌基因組DNA提取方法比較［J］.實驗技術與管理，2017，34（12）：50-53，57.

［20］ Chi T Y，Zhao Q C，Wang P L，et al.Fecal 16S rRNA gene sequencing analysis of changes in the gutMicrobiota of rats with low-dose aspirin-relatedIntestinal injury［J］.BioMed Research International，2021，2021（1）：1-15.

［21］ 侯恒威，陳 沖，歐陽輝，等.粉葛多糖促植物乳桿菌P9生長代謝及發酵液抗氧化活性研究［J］.食品安全質量檢測學報，2023，14（13）：221-228.

［22］ Onumpai C，Kolida S，Bonnin E，et al.Microbial utilization and selectivity of pectin fractions with various structures［J］.Applied and Environmental Microbiology，2011，77（16）：5 747-5 754.

［23］ Xu T，Wu X Y，Liu J，et al.The regulatory roles of dietary fibers on host health via gut microbiota-derived short chain fatty acids［J］.Current Opinion in Pharmacology，2022，62：36-42.

［24］ 陸松翠，鄭 楠，王加啟，等.短鏈脂肪酸的生物學功能研究進展［J］.動物營養學報，2024，36（6）：3 514-3 524.

［25］ 歐陽忠華.基于質譜技術探討血漿中糖醛酸途徑代謝產物與肺動脈高壓的相關性［D］.長沙：中南大學，2022.

［26］ Yu C X，Ahmadi S，Shen S H，et al.Structure and fermentation characteristics of five polysaccharides sequentially extracted from sugar beet pulp by different methods［J］.Food Hydrocolloids，2022，126：107 462.

［27］ 譚 亮，楊 洋，張 琦，等.柱前衍生化GC法測定旱芹非淀粉多糖中各單糖組分含量［J］.沈陽藥科大學學報，2011，28（1）：40-46.

［28］ Liu T T，Zhao M，Zhang Y M，et al.Integrated microbiota and metabolite profiling analysis of prebiotic characteristics of Phellinus linteus polysaccharide in vitro fermentation［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2023，242：124 854.

［29］ 戶行宇，賴田甜，劉同吉，等.低聚半乳糖植物乳桿菌發酵乳的代謝組學分析及其腸道菌群調節活性研究［J］.中國乳品工業，2023，51（12）：4-10，35.

［30］ 馬 濤，紀 鵬，魏彥明，等.基于16Sr DNA高通量測序技術研究金銀花和黃芩及其配伍對急性肺炎小鼠腸道菌群的影響＼.動物醫學進展，2024，45（8）：45-52.

［31］ 付連港，劉伊笑，趙 劍，等.槲皮萬壽菊素對斷奶仔豬生長性能、抗氧化能力、免疫功能和盲腸菌群的影響［J］.動物營養學報，2024，36（1）：199-209.

［32］ 李世杰，張金輝，王英民，等.不同性別湖羊早期定植腸道菌群分析［J］.河南農業大學學報，2024，58（2）：249-258.

［33］ Salazar N，Gueimonde M，Clara G D L R，et al.Exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria and bifidobacteria as fermentable substrates by the intestinal microbiota［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2016，56（9）：1 440-1 453.

［34］ Wang X，Huang M Y，Yang F，et al.Rapeseed polysaccharides as prebiotics ongrowth and acidifying activity of probiotics in vitro［J］.Carbohydrate Polymers，2015，125：232-240.

［35］ Burakova I，Smirnova Y，Gryaznova M，et al.The effect of short-term consumption of lactic acid bacteria on the gut microbiota in obese people［J］.Nutrients，2022，14（16）：3 384.

［36］ Fusco V，Quero G M，Cho G，et al.The genus Weissella：Taxonomy，ecology and biotechnological potential［J］.Frontiers in Microbiology，2015，6：155.

［37］ Patel A，Falck P，Shah N，et al.Evidence for xylooligosaccharide utilization in Weissella strains isolated from Indian fermented foods and vegetables［J］.FEMS Microbiology Letters，2013，346（1）：20-28.

【責任編輯：陳 佳】