解淀粉芽孢桿菌wxy-b3產脂肽類物質對蘋果斑點落葉病菌的抑菌活性研究

摘 要：蘋果斑點落葉病菌是蘋果生產過程中常見的病害，嚴重危害蘋果農作物的產量.脂肽作為一種主要來源于微生物次生代謝產物的抗菌劑，具有廣譜抑菌、低耐藥性、安全低毒等優勢.本研究發現，解淀粉芽孢桿菌wxy-b3產生的脂肽類物質能夠抑制蘋果斑點落葉病菌的生長，對蘋果斑點落葉病菌的最小抑菌濃度為16 mg/mL，此濃度可造成該病原菌細胞膜電位超極化、線粒體膜電位去極化、大分子蛋白質和核酸泄露，以及胞內活性氧和丙二醛含量分別累積增加0.33倍和5.44倍，并通過掃描電鏡進一步觀察到MIC處理組的細胞形態起皺、細胞膜破損.上述結果表明，脂肽可能通過破壞細胞膜系統，導致細胞形態發生變化，細胞膜破裂，改變細胞膜通透性來達到抑菌效果.該研究將為脂肽作為抑制蘋果斑點落葉病菌的抗菌劑奠定理論基礎.

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌； 脂肽類物質； 蘋果斑點落葉病菌； 抑菌活性

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼： A

Study on the antibacterial activity of lipopeptide produced by Bacillus amyloliquefaciens wxy-b3 against Alternaria mali

CUI Hao-yue， TIAN Lu*， HU Le-mei， GONG Guo-li

（School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：Alternaria mali is the common disease in apple cultivation，which seriously jeopardises the yield of its crops.As an antimicrobial agent mainly derived from microbial secondary metabolites，lipopeptide has the advantages of broad-spectrum inhibition，low drug resistance，safety and low toxicity.This study showed that lipopeptides produced by Bacillus amyloliquefaciens wxy-b3 were able to inhibit the growth of A.mali，and the minimum inhibitory concentration of A.mali was 16 mg/mL，and caused hyperpolarisation of cell membrane potential，depolarisation of mitochondrial membrane potential，leakage of macromolecule proteins and nucleic acids，as well as cumulative increase of intracellular reactive oxygen species and malondialdehyde content of A.mali，respectively 0.33 and 5.44 times，and the wrinkling of the cell morphology and the breakage of the cell membrane in the MIC-treated group were further observed by scanning electron microscopy.The above results indicated that lipopeptides could achieve the antibacterial effect by disrupting the cell membrane system，leading to changes in cell morphology，cell membrane rupture，and altering cell membrane permeability.This study will provide a theoretical basis for the use of lipopeptides as antimicrobial agents for the inhibition of A.mali.

Key words：Bacillus amyloliquefaciens; lipopeptides; Alternaria mali; antibacterial activity

0 引言

蘋果是我國重要的經濟作物之一，其產量和出口量多年來均居世界前列［1］.蘋果斑點落葉?。ˋlternaria mali）是蘋果生產上最常見的病害之一，嚴重危害蘋果的產量［2］.該病害主要是由鏈格孢屬的鏈格孢蘋果?；停ˋlternaria Alternata f.sp.Mali）侵染引起的［3］.其主要危害蘋果葉片，病害發生后，可導致果樹提前落葉和樹勢下降，甚至影響果品品質［4］.目前對于蘋果斑點落葉病的防治，主要通過噴施化學殺菌劑，其他措施較少.但是過量施用農藥不僅會導致病菌產生耐藥性，還會產生農藥殘留影響果品品質［5］.

近年來，由于傳統抗真菌藥物耐藥性的問題，研究人員不斷尋找替代抗真菌的藥物，如植物精油以及微生物提取物等.解淀粉芽孢桿菌（Bacillus Amyloliquefaciens）是一種土壤環境中常見的革蘭氏陽性需氧菌［6］，芽孢桿菌發揮抑菌效果的重要機制之一是產生抗真菌肽（Antifungal Peptide，AFP）［7］，芽孢桿菌AFP 主要包括脂肽類和多肽，其中脂肽類物質是一類具有高效廣譜抑菌活性的低分子多肽［8］，對真菌、細菌、病毒和支原體均具有拮抗作用，因其毒性低、易降解和熱穩定性強等特點，具有極大的研究價值［9］.目前，有關細菌及其代謝產物的研究日益增多，其中，Guo等［10］發現，高地芽孢桿菌Q7所產的脂肽對鏈格孢菌具有抑制作用，最小抑菌濃度為1.2 mg/mL，該研究表明來自高地芽孢桿菌Q7的脂肽類化合物是一種潛在的生物防治劑.Deng等［11］發現，貝萊斯芽孢桿菌FJAT-52631及其粗脂肽對針葉松FJAT-30256的抑制率為75.3%，抑制區直徑為17.66 mm.廖思晨等［12］發現解淀粉芽孢桿菌wxy-b3具有較廣譜的抗菌活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、小麥赤霉病菌、馬鈴薯干腐病菌和蘋果腐爛病菌等均具有抑制作用.然而，有關解淀粉芽孢桿菌wxy-b3產脂肽類物質對蘋果斑點落葉病菌的抑菌活性和其作用機制還尚不清晰.

本研究通過確定解淀粉芽孢桿菌wxy-b3產脂肽類物質對蘋果斑點落葉病菌的最小抑菌濃度、測定蛋白質泄露、核酸泄露、細胞膜電位、線粒體膜電位、胞內活性氧含量和丙二醛，并利用場發射掃描電鏡（SEM）進一步觀察細胞膜完整性和菌體形態，探究脂肽對蘋果斑點落葉病菌的抑菌作用和可能的機制，為蘋果產業的長期穩定發展和脂肽作為新型高效抗菌劑提供參考，對蘋果斑點落葉病菌的防治措施研究具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌wxy-b3 由實驗室保存.

蘋果斑點落葉病菌（A.mali）由實驗室保存.

1.1.2 脂肽

將實驗室保藏的解淀粉芽孢桿菌wxy-b3在20 mL LB肉湯培養基活化，取1%活化后的種子液于100 mL發酵培養基中進行搖瓶培養，37 ℃、180 rpm共培養72 h，得到發酵液.

參考廖思晨等［12］方法并進行修改，為了收集脂肽，用12 M HCl 調節100 mL發酵上清液的pH至2.0，4 ℃冰箱靜置過夜.以4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，加入5 mL甲醇，使沉淀溶解并抽提2 h，收集濾液重復抽提兩次，將抽提液用有機濾膜（尼龍66）過濾，收集濾清液（即透明狀濾液）.將濾清液于37 ℃～42 ℃、0.08～0.09 MPa條件下用旋轉蒸發儀真空濃縮減壓蒸干，將蒸干后的固體用15 mL蒸餾水溶解，溶解后的水溶液預先在-80 ℃冰箱中冷凍2 h，然后在-20 ℃真空冷凍干燥48 h，得到棕黃色粉末狀脂肽成品.

1.1.3 主要試劑

PDA培養基（北京奧博星生物技術有限責任公司），雙（1，3-二丁基巴比妥酸）三甲炔氧羰醇（DiBAC4（3））、2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorodihydrofluo rescein diacetate，DCFH-DA）（美國sigma公司），碘化丙啶 （propidium iodine，PI）、SYTO-9試劑盒（賽默飛世爾科技公司），丙二醛檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白測定試劑盒、JC-1熒光探針（上海碧云天生物技術有限公司）.

1.1.4 主要儀器

DZF-6050真空干燥箱、THZ-98A恒溫振蕩器（上海一恒科學儀器有限公司），TGL20M臺式高速離心機（長沙英泰儀器有限公司），Synergy H1多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司），場發射掃描電子顯微鏡（美國FEI）.

1.2 實驗方法

1.2.1 蘋果斑點落葉病菌的培養

將保藏在-80 ℃冰箱中的蘋果斑點落葉病菌，在PDA固體平板上進行點種傳代培養，28 ℃恒溫培養箱中培養5 天.

1.2.2 脂肽對蘋果斑點落葉病菌最小抑菌濃度（Minimum Inhibition Concentration，MIC）測定

將脂肽配制成濃度分別為64 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL和1 mg/mL的溶液，在不同濃度的脂肽溶液里放入滅菌好的空白藥敏片進行浸泡，再取出放置在37 ℃烘箱內干燥備用.按1.2.1的方法，用菌餅打孔器將培養好的蘋果斑點落葉病菌取菌餅放在PDA固體培養平板上，在距離菌餅2.5 cm的左右兩側各放置不同濃度的藥敏片.設置溶劑空白對照組，將全部實驗固體平板在28 ℃下靜置培養4～5天，觀察對照組菌落約長至培養皿面積的75%，開始測量抑菌圈直徑，記錄實驗數據.實驗設置三組平行，重復三次.

1.2.3 場發射掃描電鏡（FEG-SEM）觀察

按1.2.1節的方法培養蘋果斑點落葉病菌，用打孔器切取菌餅，將制備好的菌餅分別在0、1/2 MIC、MIC脂肽濃度下培養，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2次樣品.加入2.5%的戊二醛溶液，4 ℃靜置過夜.PBS溶液浸洗樣品15 min，重復3次.隨后，將樣品浸沒于體積分數為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇中梯度脫水15 min，再用體積分數為100%的乙醇洗脫 2次，每次處理20 min.用乙酸異戊酯處理樣品30 min.樣品烘干后噴金處理，使用掃描電鏡在3 000×下進行觀察.

1.2.4 大分子物質蛋白質泄露

按1.2.1節的方法制備樣品，設置時間梯度2 h、4 h、6 h，分別用0、1/2 MIC、MIC脂肽濃度處理樣品后進行離心收集上清液.蛋白濃度測定按照BCA試劑盒說明書進行，繪制標準曲線，在波長為562 nm處測定吸光值.實驗設置三組平行，重復三次.

1.2.5 大分子物質核酸泄露

按1.2.1節的方法制備樣品，設置時間梯度2 h、4 h、6 h、8 h、24 h，分別用0、1/2 MIC、MIC脂肽濃度處理樣品后進行離心收集上清液，使用紫外分光光度計，測定260 nm處的吸光值.實驗設置三組平行，重復三次.

1.2.6 細胞膜電位測定

根據Shi等［13］描述的方法進行細胞膜電位的測定.按1.2.1節的方法培養得到所需真菌，設置時間梯度2 h、4 h、6 h，收集分別在0、1/2 MIC、MIC脂肽濃度下培養的菌體細胞.將菌體重新懸浮于PBS中，加入3 mM DiBAC4（3）膜電位熒光探針，黑暗孵育2 h.在黑色96孔微量培養板中加入200 μL菌懸液，隨后在492/515 nm的激發/發射波長下測量熒光強度.實驗設置三組平行，重復三次.

1.2.7 線粒體膜電位測定

根據寧亞維等［14］描述的方法，按1.2.1節的方法培養得到所需真菌，設置時間梯度2 h、4 h、6 h，收集分別在0、1/2 MIC、MIC脂肽濃度下培養的菌體細胞，用PBS緩沖液洗滌兩次.將JC-1熒光探針用PBS稀釋至2.5 μg/mL，取 JC-1稀釋液對三組菌體沉淀染色20 min.PBS緩沖液洗滌兩次后，在黑色96孔微量培養板中加入200 μL菌懸液，測量熒光強度，激發波長485 nm，發射波長分別為525 nm（FL1）和590 nm（FL2），計算FL2/FL1.實驗設置三組平行，重復三次.

1.2.8 細胞活性氧（Reactive-Oxygen Species，ROS）累積

按1.2.1節的方法培養得到所需真菌，收集分別在0、1/2 MIC、MIC脂肽濃度下培養的菌體細胞，用PBS緩沖液洗滌兩次，加入10 μM的熒光探針DCFH-DA重懸，避光孵育1 h后，經PBS緩沖液洗滌兩次并重懸，在黑色96孔微量培養板中加入200 μL菌懸液，隨后在485/535 nm的激發/發射波長下測量熒光強度.實驗設置三組平行，重復三次.

1.2.9 細胞丙二醛（Malondialdehyde，MDA）累積

MDA含量是反映細胞抗氧化潛在能力的重要參數［15］.按1.2.1節的方法培養得到所需真菌，收集分別在0、1/2 MIC、MIC脂肽濃度下培養的菌體細胞，用PBS緩沖液洗滌兩次，使用丙二醛（MDA）測定試劑盒，將待測樣品加入到96孔板中，使用酶標儀測量各孔吸光度.實驗設置三組平行，重復三次.

1.2.10 數據統計和分析

本研究中所有試驗重復三次，數據通過SPSS分析軟件進行處理，結果使用平均值±標準誤差表示，并且使用T檢驗對數據結果進行顯著性差異分析（“*”表示實驗組與對照組有顯著差異（p＜0.05），“* *”表示實驗組與對照組極顯著有差異（p＜0.01））.本章繪圖采用繪圖軟件Origin.

2 結果與討論

2.1 脂肽的產率

在發酵溫度34 ℃、初始pH 7.3、接種量12%、裝液量150 mL、轉速215 rpm、2%糊精、1%牛肉粉、0.05%NaCl、發酵時間66 h下脂肽產率為551 mg/L.

2.2 脂肽對蘋果斑點落葉病菌的最小抑菌濃度

MIC 值為完全抑制病原真菌生長的最低藥物濃度［16］.通過測定MIC來確定脂肽對蘋果斑點落葉病菌的抑菌活性.由圖1可知，當脂肽的濃度≥16 mg/mL時，蘋果斑點落葉病菌的生長受到明顯抑制.表明脂肽對蘋果斑點落葉病菌的MIC為16 mg/mL.

2.3 FEG-SEM觀察結果

通過場發射掃描電鏡更直觀的觀察脂肽對蘋果斑點落葉病菌菌絲形態造成的變化，其結果如圖2所示.未經脂肽處理的菌絲形態結構完整，表面光滑飽滿，整齊呈束狀（圖2（a））.經1/2 MIC處理的菌絲出現明顯節狀皺縮（圖2（b））.由MIC脂肽處理的蘋果斑點落葉病菌菌絲失去原有的形態，頂端出現膨大，菌絲體表面出現多個突起，部分出現斷裂；菌絲整體繞縮畸形，分支明顯（圖2（c））.結果表明脂肽對蘋果斑點落葉病菌的細胞壁和細胞膜完整性造成了損傷，且隨濃度增大，細胞壁和細胞膜受損程度加劇，菌絲形態發生變化.

2.4 大分子物質蛋白質泄露

通過細胞內部物質的泄露可判斷細胞膜的破損情況.如圖3所示，經脂肽處理的1/2 MIC、MIC組的蛋白含量遠高于空白對照組，處理2 h后蛋白濃度分別增加至1.26、1.78，處理4 h后增加至2.06、3.20，而處理6 h后蛋白濃度增加至2.06、3.27.結果表明，蛋白質泄漏量隨著處理濃度的增高和處理時間延長而逐步增加，從而說明細胞膜破損程度越來越明顯.

2.5 大分子物質核酸泄露

如圖4所示，隨著脂肽濃度的增加會造成蘋果斑點落葉病菌核酸大分子物質的泄露，核酸泄露在脂肽處理初始2 h內會表現明顯，隨著處理時間的延長會緩慢增加，可能是菌絲體細胞膜通透性改變，或是大分子合成受阻.

2.6 細胞膜電位測定

如圖5所示，經脂肽處理后，蘋果斑點落葉病菌的細胞膜電位升高，細胞膜發生超極化.對比同一處理條件下不同時間的樣品，MIC濃度下處理時間從2 h增長到6 h時，蘋果斑點落葉病菌的膜電位顯著增長.

2.7 線粒體膜電位測定

如圖6所示，與對照組相比，1/2MIC濃度處理后胞內線粒體膜電位顯著下降，當濃度增加為MIC濃度時真菌線粒體膜電位繼續降低，表現為去極化狀態.在2 h時，經1/2 MIC以及MIC濃度處理后，線粒體膜電位降低了70%和75%；4 h時，分別降低42%和56%；在6 h時，分別降低了66%和74%.結果表明，脂肽刺激細胞，使蘋果腐爛病原菌線粒體膜電位呈去極化狀態.

2.8 細胞活性氧累積

2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯是一種可滲透細胞的熒光探針，可定量ROS變化，用于評估毒理學中的整體氧化應激［17］.如圖7所示，對照組的ROS含量為69，經1/2 MIC以及MIC濃度處理后，蘋果斑點落葉病菌是ROS含量分別達到83和92，分別增加了0.20和0.33倍.結果表明脂肽引起了蘋果斑點落葉病菌中ROS的積累，從而抑制蘋果斑點落葉病菌的代謝活性并誘導細胞出現氧化損傷.

2.9 細胞丙二醛累積

如圖8所示，隨著脂肽濃度增大，細胞內MDA累積量增大，經1/2 MIC以及MIC濃度處理后，MDA含量分別增大了3.55倍和5.44倍.表明隨著脂肽濃度的增加，細胞內MDA累積量增大，細胞膜出現了氧化損傷.

3 結論

本研究揭示了解淀粉芽孢桿菌產脂肽類物質對蘋果斑點落葉病菌的抑菌活性和潛在的抑菌機理.結果表明脂肽對蘋果斑點落葉病菌具有良好的抑菌作用，其MIC值為16 mg/mL，脂肽處理后的蘋果斑點落葉病菌細胞膜和細胞壁發生了損傷，造成蘋果斑點落葉病菌的細胞膜發生超極化，線粒體膜電位發生去極化，ROS和MDA的累積，導致細胞過氧化損傷，細胞膜結構被破壞.綜上，解淀粉芽孢桿菌wxy-b3產脂肽類物質可以有效抑制蘋果斑點落葉病菌生長繁殖.本研究為脂肽的開發和應用提供理論依據.

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【責任編輯：蔣亞儒】