共培養大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌合成圣草酚研究

摘 要：微生物共培養技術在生物制造中應用廣泛，尤其在天然產物的微生物合成中發揮重要作用.植物天然產物圣草酚具有抗菌、抗氧化等多種藥理作用，在醫藥、食品等領域具有良好應用前景.為利用葡萄糖這一廉價碳源從頭合成圣草酚，運用微生物共培養技術，構建了大腸桿菌BAK101菌株與谷氨酸棒桿菌NE1菌株的共培養發酵體系， 其中BAK101可將葡萄糖轉化為L-酪氨酸，NE1可將L-酪氨酸轉化為圣草酚.通過系統優化，采用補料分批發酵結合分段式共培養方式，利用2%的葡萄糖經過100 h發酵，在搖瓶中實現了4.72 mg/L圣草酚的從頭合成.本研究為黃酮類化合物的微生物共培養合成奠定了基礎，也為復雜天然產物在微生物中的從頭合成提供了參考.

關鍵詞：共培養； 圣草酚； L-酪氨酸； 大腸桿菌； 谷氨酸棒桿菌

中圖分類號：Q939.97

文獻標志碼： A

Study on co-culture of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for the biosynthesis of eriodictyol

ZHA Jian1， ZHAO Ting-lan1， LIU Jing-yi1， SHI Fu-long2，LYU Bao-long2， TIAN Bin1， WU Xia1*

（1.School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an" 710021， China; 2.Baoji Fufeng Biotechnologies Co.， Ltd.， Baoji 722405， China）

Abstract：Microbial co-cultures are widely used in biomanufacturing and play important roles in the microbial biosynthesis of natural products.The plant natural product eriodictyol can be potentially applied in pharmaceutical and food industries due to its antimicrobial，anti-oxidative activities and other medical properties.To achieve de novo biosynthesis of eriodictyol from the cheap carbon source glucose，the co-culture strategy was adopted utilizing Escherichia coli strain BAK101 and Corynebacterium glutamicum strain NE1，in which BAK101 could convert glucose into L-tyrosine，whereas NE1 was able to metabolize L-tyrosine into eriodictyol.Via system optimization combined with fed-batch fermentation and segmented co-cultivation，de novo biosynthesis of eriodictyol was accomplished with a titer of 4.72 mg/L in shake flasks from 2% glucose in 100 h of fermentation.This study sets an example for the biosynthesis of flavonoid compounds using microbial co-cultures，and provides guidance to the de novo microbial biosynthesis of complicated natural products.

Key words：co-culture； eriodictyol； L-tyrosine； escherichia coli； corynebacterium glutamicum

0 引言

植物天然產物圣草酚（Eriodictyol）是黃酮類化合物的一種二氫衍生物，屬于黃烷酮類，常見于柑橘類水果中，具有抗菌、抗炎、保護神經及心血管、促進胰島素分泌等多種生理活性［1，2］，在醫療保健、食品及化妝品生產等領域廣受青睞.目前圣草酚的工業生產方式主要為植物提取，但該生產方式大量使用有機溶劑，且嚴重依賴植物的種植，對土地、氣候等有較高需求.本文嘗試使用生物合成的方法對圣草酚進行生產.

為實現圣草酚的生物合成，現有研究主要對大腸桿菌、酵母菌等單一菌株進行工程化改造，人為引入圣草酚合成途徑，并根據途徑起點外源添加前體物對香豆酸、酪氨酸或柚皮素［3-5］.為轉化這些底物合成圣草酚，需引入植物來源P450氧化酶和與之匹配的P450還原酶［4，6］.然而，P450酶的異源表達是一個重要難題，表現在酶表達量低、活性低、反應過程需消耗NADPH［6］.一種新策略是表達一種非P450型的單加氧酶HpaBC，可實現圣草酚的高效合成［5］.但是較高的底物成本是圣草酚合成中的重要限制因素.因此，實現以廉價碳源（如葡萄糖、甘油）為底物是生物合成圣草酚的重要挑戰.

自然界中的各種微生物間通常存在互利共生、偏利共生、寄生等多種相互作用［7］.利用這些作用模式，研究人員開發了微生物共培養技術，即在無菌條件下，將兩種或多種特定微生物置于同一體系中混合培養，從而合成某種目標產品［8，9］.該技術將較長的合成代謝途徑分成若干個模塊，分別轉入不同的微生物細胞，通過共培養模式，一方面可減輕每種菌株的代謝負擔［10，11］，另一方面可為特定酶促反應的發生提供最適合的細胞環境［11］，并可通過物理阻隔解除某些反饋抑制［12，13］，因而有利于目標產品、尤其是結構復雜的天然產物在微生物細胞內有效合成［14］.

本文采用微生物共培養技術，對可生產L-酪氨酸的重組大腸桿菌BAK10菌株和可將L-酪氨酸轉化為圣草酚的重組谷氨酸棒桿菌NE1菌株構建共培養體系，從而實現目標產物圣草酚的分段式生物合成.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

腦心浸液肉湯培養基（BHI）、LB 肉湯培養基，北京奧博星生物技術有限公司； L-酪氨酸、丙二酸鈉、二甲基亞砜、柚皮素標準品，麥克林生化科技有限責任公司；濃鹽酸（分析純）、冰乙酸（分析純）、甲醇（分析純）、瓊脂粉，國藥集團試劑有限公司；壯觀霉素、卡那霉素，上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖（分析純），天津科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純），天津天力化學試劑有限公司；L-酪氨酸標準品、圣草酚標準品，北京索萊寶科技有限公司.

1.1.2 主要儀器

SX-500滅菌鍋，TOMY；Infinite M NANO酶標儀，TECAN；CT15E常溫離心機，Himac；Agilent 1200高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；GL124-1SCN精密電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；PHS-25精密 pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；SW-CJ生物潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司； HNY-2102C恒溫培養箱，天津歐諾儀器股份有限公司；MDF-382超低溫冰箱，松下冷鏈（大連）有限公司；XMTE-8112電熱干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的構建

大腸桿菌 BAK10是本實驗室已有的產L-酪氨酸的工程菌株［15］，在其中轉入pEKEx3 （壯觀霉素抗性）和 pZM1 （卡那霉素抗性）兩個空質粒，即得到具有相應抗生素抗性的菌株BAK101.谷氨酸棒桿菌 NE1為本實驗室前期構建，能以L-酪氨酸為前體物生產圣草酚［5］.

1.2.2 大腸桿菌 BAK101產L-酪氨酸能力測試

將大腸桿菌BAK101甘油菌在LB平板（含壯觀霉素和卡那霉素各50 mg/L）上劃線后于37 ℃過夜培養.挑取單菌落接種至含LB培養基中（含壯觀霉素和卡那霉素各50 mg/L），于37 ℃、200 rpm過夜培養后，轉接至含相同濃度抗生素的15 mL新鮮AMM培養基中，使轉接初始OD600為0.5～0.6，在30 ℃、200 rpm條件下培養至OD600達到1.2左右時，添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至0.1 mmol/L終濃度以誘導酶表達.誘導后0 h、24 h、48 h、60 h收集發酵液上清，進行L-酪氨酸含量分析.菌株BAK10的培養及測試方法與此類似，但其培養基中不添加壯觀霉素和卡那霉素.

為測定抗生素濃度對L-酪氨酸產量的影響，菌株BAK101培養時將壯觀霉素及卡那霉素的濃度由50 mg/L調整至25 mg/L，菌體培養及L-酪氨酸測定與上述步驟相同.

1.2.3 大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌共培養體系構建

按1.2.2的方法培養大腸桿菌 BAK101菌株，使用25 mg/L的壯觀霉素及卡那霉素.對于谷氨酸棒桿菌NE1菌株，提前取其甘油菌，在含有壯觀霉素和卡那霉素（各25 mg/L）的LB平板上劃線，于30 ℃過夜培養活化.挑取單菌落接種于BHI液體培養基（壯觀霉素和卡那霉素各25 mg/L），于30 ℃、200 rpm條件下過夜培養.待BAK101誘導達48 h時，將NE1菌液以OD600=0.5的初始菌濃轉接至發酵液中，在30 ℃、200 rpm下發酵培養4 h后，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG及2 g/L丙二酸鈉誘導產物合成，并于NE1接入后12 h、24 h、36 h、48 h、72 h收集發酵液上清，用于圣草酚及柚皮素的濃度分析.

1.2.4 共培養體系的分批補料發酵

在發酵過程中的特定時間點，添加不同組成的營養物質，共設置3種補料方式，分別為：補料方式1在接入NE1時補充40% 葡萄糖0.25 mL以及2.5倍濃縮的AMM新鮮培養基1.75 mL，在NE1接入后24 h、36 h、48 h時間點各補充1.75 mL無菌水；補料方式2在接入NE1時補充40% 葡萄糖 0.25 mL及無菌水1.75 mL，在NE1接入后24 h、36 h、48 h時間點各補充40% 葡萄糖1.75 mL；補料方式3在接入NE1時補充40% 葡萄糖0.25 mL與2.5倍濃縮AMM新鮮培養基1.75 mL，并在NE1接入后24 h、36 h、48 h時間點各補充1.75 mL的40% 葡萄糖.于相應時間點通過平板涂布法統計發酵液中大腸桿菌及谷氨酸棒桿菌的菌落數，以監測發酵液中兩種菌體的生長狀況.同時于各時間點收集發酵液上清，以便于后續對菌體代謝產物進行濃度分析.

1.2.5 共培養體系的分段式發酵

大腸桿菌BAK101及谷氨酸棒桿菌NE1菌液的準備及發酵方法同1.2.3.在接入NE1之前，將BAK101發酵液離心（5 000 rpm，10 min）去除體系中BAK101，將NE1接入離心后的發酵液上清，同時補充1.75 mL新鮮AMM培養基（2.5倍濃縮）及40% 葡萄糖0.25 mL.在NE1接入后24 h、36 h、48 h各補充40%葡萄糖1.75 mL，并于12 h、24 h、36 h 和 48 h時收集發酵液上清以分析代謝物濃度.

1.2.6 代謝產物的HPLC檢測

在發酵過程的不同時間點，分別取200 μL發酵液，與4 mol/L鹽酸等體積混合并于37 ℃孵育1 h，離心（12 000 rpm，10 min）收集上清液，使用C18柱（5 μm，4.6x250 mm）反相色譜分析L-酪氨酸、圣草酚及柚皮素的含量，樣品進樣量為10 μL，紫外檢測器檢測波長為280 nm.使用標準品對各物質含量進行定量分析.

L-酪氨酸的檢測使用0.1 mol/L乙酸鈉水溶液（使用冰醋酸調pH至4.0）作為流動相A相，以甲醇為B相，洗脫程序為0～8 min，10% B；8～13 min，10%～40% B；13～16 min，40% B；16～21 min，40%～5% B；21～31 min，5% B.流動相流速為0.5 mL/min.

圣草酚及柚皮素的檢測以水（含0.1%甲酸）為A相，乙腈（含0.1%甲酸）為B相，洗脫程序為0～10 min，10%～40% A；10～15 min，40%～60% A；15～20 min，60%～10% A.流動相流速為1 mL/min.

1.2.7 生長曲線及菌體數量測定

測定生長曲線時，在不同發酵時間點，分別取發酵液200 μL于96孔板，使用酶標儀測定其600 nm波長處的吸光度值（OD600），必要時對發酵液進行稀釋.

對于共培養體系，在發酵不同時間點，分別取100 μL發酵液，使用PBS緩沖液進行梯度稀釋后，取90 μL菌液涂布于LB固體平板，于30 ℃培養20 h.根據平板上大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的形態差異，分別對兩種細菌進行計數.

2 結果與討論

2.1 共培養體系的設計

從葡萄糖到圣草酚的合成途徑較長，在單一微生物中表達易導致較重的代謝負擔.實驗室前期獲得了可從葡萄糖生產L-酪氨酸的重組大腸桿菌菌株BAK10［15］，以及可利用L-酪氨酸生產圣草酚的重組谷氨酸棒桿菌菌株NE1［5］.為此，本研究將整體合成途徑分解為兩部分，分別置于重組大腸桿菌BAK10及重組谷氨酸棒桿菌NE1中，以BAK10為上游菌株，以NE1下游菌株，以上游菌株的代謝產物作為下游菌株的代謝前體物（如圖1所示）.由于菌株NE1在培養時需添加卡那霉素和壯觀霉素，而菌株BAK10不具有相應抗性，因此，在菌株BAK10中引入分別攜帶這兩種抗性基因的質粒pZM1和pEKEx3，獲得菌株BAK101，以其作為上游菌株進行發酵測試.

2.2 大腸桿菌BAK101產L-酪氨酸能力測試及優化

以大腸桿菌BAK10為陽性對照，對BAK101進行培養.發酵過程中，菌株BAK10與BAK101所合成的L-酪氨酸最高濃度分別為364.3 mg/L（48 h）與108.4 mg/L（36 h），此后均有所降低，表明菌體對L-酪氨酸進行了利用轉化.此外，BAK101的L-酪氨酸產量始終明顯低于BAK10（如圖2所示），可能原因是BAK101培養時使用了卡那霉素和壯觀霉素，迫使菌體表達抗生素抗性基因，增加了代謝負擔.為減輕此種代謝負擔，從而為下游菌株提供更多的L-酪氨酸，本研究嘗試將兩種抗生素濃度從50 mg/L分別降低至25 mg/L.如圖3所示， L-酪氨酸產量隨抗生素濃度下降而明顯提升，在48 h時達到188 mg/L，相比使用高濃度抗生素時的最高產量提高了74%.后續研究均使用25 mg/L的抗生素濃度.

2.3 共培養體系的構建及補料發酵優化

將大腸桿菌BAK101在誘導后培養至48 h，加入一定量谷氨酸棒桿菌NE1繼續培養，獲得共培養體系.共培養4 h后對下游菌株進行誘導，并通過高效液相色譜測定不同時間點發酵液中柚皮素與圣草酚的含量.然而，隨發酵時間延長，幾乎沒有產物合成，因此推測上游菌株合成L-酪氨酸時消耗了體系中大量營養物質，使下游菌株無法正常生長代謝，從而導致圣草酚合成效率低下.

為解決這一問題，本研究嘗試向共培養體系中分批補加不同組成的新鮮培養基，并比較菌體生長與L-酪氨酸積累的變化趨勢.如圖4、圖5所示，相比于未補加營養物質的發酵，補料發酵有效提高了上游菌株和下游菌株的菌體數量.其中，補料方式3效果最為顯著，在共培養24 h時上游菌株BAK101和下游菌株NE1的數量分別達到最大值2.1×109 CFU/mL和7.8×108 CFU/mL.其后，BAK101數量在經歷小幅下降后保持穩定， NE1數量持續下降，表明NE1無法從共培養體系中獲取足夠營養物質，從而發生菌體死亡.對比三種補料方式可知，在共培養起始時間點補加AMM新鮮培養基以及在發酵過程中補加葡萄糖對于提升菌體數量至關重要.

補料發酵中L-酪氨酸的含量變化如圖6所示.為展示該物質濃度在整個發酵過程中的變化，時間零點選為大腸桿菌BAK101誘導時刻，因此，發酵48 h對應谷氨酸棒桿菌NE1的接入，發酵96 h對應共培養第48 h.在前48 h，發酵體系內只有大腸桿菌BAK101，且各補料方式的發酵條件相同，故L-酪氨酸濃度相同，表現為隨菌體生長而逐漸增加.在接入谷氨酸棒桿菌NE1后，L-酪氨酸濃度變化受兩方面因素影響.一方面，營養物質的及時補充可促進上游菌株生長，使其持續積累L-酪氨酸；另一方面，下游菌株將其轉化為柚皮素，使其濃度下降.這兩個過程的相對速率決定了發酵體系內L-酪氨酸的濃度變化.對于補料方式1和3，由于下游菌株數量極大提升且在共培養24 h時達到峰值，導致L-酪氨酸含量在發酵48～72 h時間段內（共培養0～24 h）急劇下降，并在發酵72 h達到或接近最低值.此后，由于下游菌株數量逐漸下降，其代謝L-酪氨酸的能力逐漸減弱，導致該物質濃度不斷升高.對于補料方式2，由于下游菌株數量明顯少于其它兩種補料方式，菌體生長緩慢，故菌體對L-酪氨酸的利用速率較低，而此時上游菌株仍在不斷合成該物質，導致其在短時間內發生積累，濃度高峰的出現延遲至共培養12 h（發酵60 h）時.

對補料發酵體系中的柚皮素和圣草酚含量進行分析發現，盡管補充營養物質可改善下游菌株生長及L-酪氨酸利用，然而圣草酚合成量仍低于1 mg/L（如圖7所示）.可能原因是上游菌株對圣草酚合成過程產生了抑制作用，或L-酪氨酸經其它途徑轉化生成了代謝副產物.

2.4 分段式共培養體系的建立及表征

為驗證上游菌株大腸桿菌BAK101的存在是關鍵的限速步驟，本研究采用分段式共培養方法，即在接入NE1前通過離心移除發酵液中的上游菌體，收集發酵上清液（含有上游菌株分泌的L-酪氨酸），將NE1接入其中.采用該方式后，NE1菌體數量持續增加，在分段式共培養第48 h時達到了1.3×109 CFU/mL，相比于非分段式共培養體系中的最高菌體數量提高了67%（如圖8所示）.該結果表明，上游菌株確實可抑制下游菌株的生長.該抑制作用可能由兩種菌株對營養物質的代謝速率差別導致.上游菌株在發酵體系內的數量多于下游菌株，且其生長速率較快，從而導致上游菌株作為優勢菌株對下游菌株的生長代謝產生抑制.這種抑制或競爭現象是多種共培養體系的共性特征［16］.

在分段式共培養體系中接入NE1后，柚皮素及圣草酚濃度隨發酵進程逐漸升高，在分段式共培養第48 h分別達到16.9 mg/L和4.7 mg/L，與連續式共培養補料發酵方式相比提高了10倍以上（如圖9所示）.然而，柚皮素到圣草酚的轉化率較低，可能原因是催化該反應的羥化酶HpaBC底物譜較寬泛，存在多種競爭性底物如L-酪氨酸等，導致柚皮素利用率降低［17］.

3 結論

本文運用微生物共培養策略，利用下游谷氨酸棒桿菌重組菌株NE1和上游大腸桿菌菌株BAK101實現模塊化代謝及分工協作，共同完成從葡萄糖合成圣草酚的目標.后續可通過代謝調控、酶表達水平調控、發酵參數優化等方式，進一步提高圣草酚的產量.本文構建的大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌共培養體系為黃酮類化合物及其它復雜天然產物的從頭合成提供了參考.

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【責任編輯：陳 佳】