乳酸乳球菌表達系統的研究進展及其應用

摘要：乳酸乳球菌是乳酸菌在異源表達蛋白方面的應用與研究中的一種重要模式菌，由于其公認的安全性、益生特性、無包涵體和內毒素、易于表面顯示和細胞外分泌使其成為蛋白異源表達的理想宿主。由于乳酸乳球菌刺激黏膜免疫的特性，其在遞呈病毒、細菌抗原等方面得到了廣泛應用。闡述了乳酸乳球菌表達系統的相關研究進展，著重介紹了乳酸乳球菌表達異源蛋白的分泌和錨定策略，并總結了對乳酸乳球菌作為細胞工廠在食品、醫藥，特別是抗原呈遞方面的應用，最后對乳酸乳球菌表達系統未來的研究方向進行了展望。

關鍵詞：乳酸乳球菌；表達系統；異源蛋白；分泌表達；表面展示

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0244

中圖分類號：Q78

文獻標志碼：A

文章編號：1008?0864（2025）01?0025?10

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能利用糖發酵產乳酸的革蘭氏陽性菌的統稱，形態上主要以球菌和桿菌的形式出現[1]。其中，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是乳酸菌的模式菌株，被美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）認證為“一般認為安全（generally recognizedas safe，GRAS）”[2]，乳酸乳球菌是繼大腸桿菌、酵母、枯草芽孢桿菌之后備受關注的異源蛋白表達宿主菌[3]，常應用于食品發酵、藥物生產等方面。

乳酸乳球菌表達系統已經表達了來源于細菌、真核生物和病毒的多種外源蛋白。相較于大腸桿菌，乳酸乳球菌更容易將蛋白分泌到細胞外環境。乳酸乳球菌的另一優勢為其僅有1種胞外蛋白酶HrtA（high-temperature requirement）[4]，外源蛋白不容易被降解，利于蛋白質的下游加工。因此，利用乳酸乳球菌作為細胞工廠來生產異源蛋白越來越受到重視，尤其是在生產藥品、食品級蛋白質、抗原和細胞因子等方面[5]。

高效的表達系統是宿主能夠表達外源蛋白的關鍵因素，本文主要介紹了乳酸乳球菌表達系統，同時介紹了乳酸乳球菌表達異源蛋白的分泌和錨定策略，并對乳酸乳球菌在食品、藥品和疫苗等領域的應用進行總結，最后對乳酸乳球菌表達系統進行展望。

1 乳酸乳球菌表達系統

乳酸乳球菌在異源蛋白生產方面應用廣泛，高效穩定的表達系統是乳酸乳球菌表達外源蛋白的關鍵因素之一，表達系統包括幾個關鍵的結構元件，如啟動子、終止子、信號肽等。啟動子調節基因的表達時間和表達水平，可分為組成型啟動子和誘導型啟動子，適宜啟動子的選擇由幾個因素決定，包括與宿主菌株的兼容性、期望的表達模式以及轉錄產物的性質[6?7]。基于2種啟動子，目前乳酸乳球菌已經開發了多種組成型和誘導型表達系統。

1.1 組成型表達系統

組成型啟動子是一類可以穩定表達的啟動子，它允許其相關基因的持續、穩定轉錄，無特定信號或誘導因子即可持續表達，無時空特異性。管家基因是一類長時間處于轉錄活躍狀態的基因，在細胞的各個階段均能持續表達且受環境影響較小，是組成型啟動子的良好候選，比如乳酸菌的核糖體RNA，其啟動子被證實為良好的組成型啟動子[8]，除此之外，延伸因子的啟動子也是組成型啟動子的候選之一，比如來自乳酸乳球菌IL1403的Ptuf啟動子[9]。目前，在乳酸乳球菌中已經鑒定出幾種組成型的啟動子，如P23、P32、P59等，被用于乳酸乳球菌表達外源基因（表1）。

一般來說，強組成型表達系統可以獲得更高水平的外源蛋白，它可以在大規模發酵中穩定生產高水平的蛋白質，不需要添加額外的誘導化合物，避免了額外成本，但是目前的組成型表達系統相對于誘導型表達系統來說強度不高[20]，所以篩選出更高效的組成型啟動子也是目前研究的熱點。

1.2 誘導型表達系統

誘導型啟動子會受到細胞內外環境信號調控，通過添加誘導劑或者改變環境可以控制誘導型啟動子在細胞內的表達，誘導啟動子主要由兩部分組成，即啟動子和相關的調控基因，使用誘導型表達系統必須保證調控基因能夠在對應細胞中表達，這樣誘導啟動子才能在細胞中正常發揮功能。

迄今為止最成功的乳酸乳球菌誘導表達系統是由乳酸鏈球菌素（nisin）誘導的受控基因表達系統（nisin controlled gene expression system，NICE）[21]。nisin 是一種由34 個氨基酸組成的短肽，是研究最廣泛的細菌素，它源于一些乳酸乳桿菌菌株中發現的乳鏈菌肽生物合成操縱子（nisABTCIPRKFEG），nisin 通過信號轉導誘導其自身的生物合成。其中，NisK 作為nisin分子的受體，NisK 在細胞表面感知到nisin的信號后，將信號繼續傳遞給細胞內的反應調節蛋白NisR使其磷酸化，從而啟動基因簇上的啟動子PnisA和PnisF下游基因的轉錄。NICE系統配合使用的宿主菌株是乳酸乳球菌NZ9000，由不產nisin的MG1363菌株改造而來，其基因組中插入了nisR 和nisK 基因，當環境中存在亞抑制量的nisin （0.1～5.0 ng·mL-1）時，即可啟動PnisA啟動子下游的目的基因轉錄。

NICE系統具有以下3種優點：①系統成熟、操作簡單；②蛋白表達嚴格受控，可表達毒性蛋白；③蛋白表達量高。但應注意的是，nisin本身價格昂貴，且在后續蛋白生產過程中需要進行提純[22]。

除此之外，還有多種誘導型表達系統被篩選出來，如P（Zn）zitR 啟動子和zitR 調節基因體系，當環境中鋅含量豐富時而ZitR 抑制因子會與P（Zn）zitR 結合抑制其轉錄，而當環境中缺少鋅時ZitR會失活，使得P（Zn）zitR 可以與RNA聚合酶結合啟動轉錄，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）可以減少環境中的鋅，當培養基中添加EDTA 時，環境中的Zn 減少導致ZitR 失活，從而誘導P（Zn）zitR 下游基因的表達[23]。P170表達系統是一類壓力誘導型表達系統，由誘導型啟動子P170 控制，該啟動子負責未知功能基因orfX 的轉錄，細菌生長至穩定期時，環境pH 6.0～6.5條件下可誘導下游目的基因的轉錄。由于乳酸乳球菌在生長過程中本身會生產乳酸導致環境pH降低，所以與需要添加誘導劑的誘導表達系統相比，P170表達系統通過乳酸菌代謝產生的乳酸來實現下游基因的表達，利于蛋白生產后的純化，已經利用該表達系統生產多種蛋白質24?25]。除了通過添加誘導劑來激活的誘導啟動子之外，有些誘導啟動子是通過環境脅迫來使下游基因表達，如由壓力調節的表達系統SICE（stress-inducible controllexpression），通過此系統在2種不同的人類病理學小鼠模型中驗證了SICE系統在體內的功能[26]。

1.3 分泌型表達

根據目的蛋白的定位可以將乳酸乳球菌表達外源蛋白的形式分為3種：胞質內表達、分泌表達和錨定表達。與胞質內表達蛋白相比，將蛋白分泌到細胞外更受青睞，分泌表達可以實現連續培養并簡化后續純化步驟。當使用乳酸乳球菌作為人類或動物消化道中的蛋白質遞送載體時，分泌型表達有利于蛋白質（如酶或抗原）與其靶標（底物或免疫系統）之間的相互作用[5]。乳酸乳球菌具有單層細胞壁，可以直接將蛋白分泌到細胞外環境[27]，利于純化蛋白。乳酸乳球菌僅具有1種細胞外管家蛋白酶HrtA，降低了分泌的異源蛋白被降解的幾率[4， 28]。

乳酸乳球菌的蛋白分泌過程與其他革蘭氏陽性菌類似，先合成蛋白質前體，它包含目的蛋白部分及其N端的信號肽。前體蛋白被宿主的分泌機制識別隨后通過Sec（secretion）機制易位[29]。該過程中信號肽被切割，成熟蛋白在細胞外釋放[5]。在乳酸乳球菌中，主要分泌的蛋白是Usp45，其功能尚不清楚。然而，乳酸乳球菌Usp45的信號肽是迄今為止用于乳酸乳球菌分泌系統最成功的信號肽，有研究通過一系列突變對其進行改造，使其分泌效率進一步提高51%[30]。Baradaran等[31]從戊糖片球菌中分離到一種新的信號肽SPK1，它能夠分泌與乳酸乳球菌中的Usp45信號肽效率相當的異源蛋白。當SPK1分泌β-環糊精葡萄糖轉移酶時，盡管它的分泌效率高于USP45，但總蛋白量卻低于USP45[32]，說明信號肽不僅對外源蛋白的分泌有復雜的影響，而且對總蛋白質產量也有影響。與枯草芽孢桿菌相比，乳酸乳球菌的分泌能力仍較低[33]。枯草芽孢桿菌每升培養物可分泌產生25 g蛋白質[34?35]，然而乳酸乳球菌的產量卻遠低于該數值[33， 36?37]，有研究通過優化葡萄球菌核酸酶在MG1363中的生產條件，達到了210 mg·L-1的產率[38]。雖然沒有系統地比較枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌中相同蛋白質的分泌動力學和最終生產水平，但生產力的明顯差異可能歸因于多種因素。首先，枯草芽孢桿菌可以生長到比乳酸乳球菌高得多的細胞密度。此外，由于乳酸的產生會導致乳酸乳球菌的培養基pH持續降低，可能對菌的生長有所限制。所以在蛋白產量優化方面，乳酸乳球菌需進一步提升。

1.4 細胞壁錨定表達

革蘭氏陽性菌單層的細胞膜和較厚的細胞壁使得它們適合在細胞表面展示蛋白質。在細菌細胞壁上展示蛋白質可以使細菌充當蛋白質的載體，特別是抗原的載體，并幫助所展示的蛋白質與目標環境相互作用。目前，在乳酸菌中共發現了5種不同類型的錨定方式：跨膜結構域錨定、脂蛋白錨定、LPXTG型錨定、AcmA重復序列錨定和表面蛋白錨定[39]。

在乳酸乳球菌中，最常用的錨定方式是LPXTG（Leu-Pro-X-Thr-Gly）型錨定，該錨定機制依賴于分選酶的活性，通過分選酶定位到五肽基序（LPXTG）上并切割目標蛋白的分選信號，促進目標蛋白共價錨定到細胞壁上[40?41]。除此之外，另一種常用的錨定策略是使用AcmA重復序列非共價結合到細胞表面，AcmA 是乳酸乳球菌MG1363的主要自溶蛋白，是一種由N端活性位點結構域和C端肽聚糖結合結構域組成的蛋白[42]。使用AcmA重復序列的非共價錨定已被證明跨表面顯示外源蛋白，即外源蛋白的表達和錨定是分開的，表達細胞表達融合蛋白，將預處理的乳酸乳球菌細胞與融合蛋白結合；在錨定細胞中，融合蛋白包含的錨定域將蛋白錨定到乳酸乳球菌表面，使用這種方法可以在非乳球菌宿主（如大腸桿菌）中表達異源蛋白，只需將純化的外源蛋白混合到乳酸乳球菌細胞培養物中，就可以純化并非共價地結合到乳酸乳球菌細胞壁上[43]。這使得乳酸乳球菌細胞可以攜帶外源蛋白而無需經過基因改造，這種方法也被新城疫病毒血凝素-神經氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase，HN）蛋白用于特異性靶向乳腺癌細胞[44]。此外，需要翻譯后修飾的真核生物蛋白也可以在真核宿主中表達，并錨定在乳酸乳球菌細胞壁上[45]。該系統的缺點是，乳酸乳球菌細胞只是所顯示蛋白質的載體，而不是生產蛋白質的工廠，因此可能需要多次添加在乳酸乳球菌細胞上顯示的蛋白質。

2 乳酸乳球菌作為細胞工廠的應用

乳酸乳球菌作為細胞工廠一般都需要用含有1個（或多個）目標基因的質粒進行轉化，該基因可能編碼參與代謝物（如乳酸、乙醇、維生素）產生的蛋白質或酶。此外，乳酸乳球菌可用于活粘膜疫苗接種，作為將蛋白質或代謝物輸送到粘膜表面的活載體。

2.1 藥物和食品級蛋白質的生產

乳酸乳球菌作為蛋白質生產工廠的一大優勢就是其優秀的分泌表達系統[5]，與大腸桿菌不同，大腸桿菌最常用的生產策略是細胞內表達，因此導致下游純化過程更加繁瑣。此外，與大腸桿菌不同，乳酸乳球菌不含高免疫原性脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），從而使生產過程更簡潔、安全[22]。乳酸乳球菌只有1種主要分泌蛋白Usp45，它分泌到培養基中，簡化了下游純化過程，并且只有1種胞外蛋白酶HtrA[22]。乳酸乳球菌中已經成功生產了幾種異源蛋白和藥物，例如細菌抗原、真核抗原和病毒抗原、白細胞介素、過敏原、毒力因子、細菌素和酶（表2）[5]。

2.2 疫苗生產

乳酸乳球菌除了在蛋白生產方面的應用之外，另一重要的應用就是抗原的生產工廠，將其作為口服疫苗使用。乳酸乳球菌作為疫苗載體有以下優勢：一是乳酸乳球菌能夠誘導黏膜免疫和全身免疫，二是具有佐劑特性，三是與傳統減毒活疫苗如沙門氏菌和分枝桿菌相比安全風險更低[61]。

使用乳酸乳球菌攜帶表達抗原基因的原核表達載體，可以將抗原遞送到宿主粘膜（如鼻腔、口腔或胃腸道）。抗原可以以3 種不同方式呈遞：①細胞質，需要細菌裂解來釋放抗原并傳遞到靶細胞，但具有保護抗原不被宿主粘膜降解的優點；②分泌到宿主粘膜，抗原直接與粘膜上皮細胞等靶細胞接觸；③表面展示抗原，抗原被錨定在細胞膜上，可以保護抗原不被蛋白水解降解[62]。

乳酸乳球菌能夠以比大腸桿菌和釀酒酵母高得多的比例表達膜錨定的異源蛋白，乳酸乳球菌膜錨定蛋白占總膜蛋白的5.0%～6.0%，大腸桿菌和釀酒酵母膜錨定蛋白分別占總膜蛋白的1.0%～1.5%和0.5%[63]。Mao等[64]比較了乳酸乳球菌分泌蛋白和錨定蛋白的穩定性，研究中在蛋白質N端加入了Usp45信號肽序列用于蛋白分泌，之后在蛋白質C 端添加了AcmA 重復序列用于蛋白錨定，發現乳酸乳球菌表面顯示蛋白比分泌蛋白更穩定，具有更高的生物活性。Ma等[65]用乳酸乳球菌以細胞質內、分泌和表面錨定3種方式表達雞柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella） 3-1E蛋白發現，表面錨定的蛋白質可以最大程度地保護雞免疫E. tenella 感染，進一步研究發現錨定表達的蛋白可以更有效的引發免疫反應。有研究還比較了細胞質蛋白和分泌蛋白的產量，發現分泌蛋白的產量高于細胞質產量[5]。Ribeiro等[66]使用pWV01和pAMβ1質粒在乳酸乳球菌中表達流產布魯氏菌抗原L7/L12，當蛋白質在細胞質中表達時，最大產量達到0.5 mg·L-1，而分泌的產量卻可以達到3.0 mg·L-1。總之，將蛋白質分泌到胞外，可以提高蛋白質產量，同時將蛋白質錨定在細胞表面可增加其穩定性和免疫反應生物活性。使用乳酸乳球菌進行抗原生產的研究總結如表3所示。

3 展望

近年來，乳酸乳球菌被用來生產異源蛋白，主要集中在食品和醫藥等行業。盡管乳酸乳球菌擁有生物安全性的特點，但相較于傳統的大腸桿菌和酵母等表達系統，乳酸乳球菌在異源表達蛋白方面的研究處于起步階段，同時在表達外源基因時，還會受到密碼子偏好性的影響，在表達如鏈球菌、屎腸球菌、乳桿菌的基因時問題較小，當表達其他來源的外源基因時，密碼子優化可能是改善乳酸乳球菌蛋白表達的一般必要條件[81]。同時，在蛋白產量方面，與需氧生長的枯草芽孢桿菌相比，乳酸乳球菌分泌的蛋白產量仍較低。

在進一步發展和完善乳酸乳球菌的表達系統時，可以從啟動子方面入手。在理論方面對于乳酸乳球菌σ因子、核糖體結合位點、轉錄因子結合位點的研究尚淺，解釋啟動子信號的工作機制有助于理解乳酸乳球菌轉錄過程和建立乳酸乳球菌的模型，篩選出乳酸乳球菌的轉錄因子也可以更好地理解它的轉錄機制以及如何調控基因的表達。在序列內在邏輯方面，深度學習方法具有強大的模式提取能力，可以更好地理解啟動子序列的內在邏輯，同時有助于建立精準的啟動子強度預測工具，篩選或合成強度更高或者更適宜應用的啟動子。在實際應用方面，高效可控的強啟動子，一直是工業生產所需求的，但同時也應注意成本，NICE系統作為目前應用最廣泛的系統，存在著nisin本身價格高且蛋白生產中需要下游提純的問題。因此，為適應工業生產的高需求，應開發新的更加便利節約的啟動子系統，或者對啟動子進行精準改造，通過對其結構的解析，進行針對性的改造，達到最佳的表達效果。

盡管關于乳酸乳球菌獲得性抗生素耐藥性的研究有限，乳酸乳球菌也被公認為是安全的食品級微生物，但隨著研究人員開發、構建了許多以抗生素抗性基因作為篩選標記的乳酸乳球菌表達載體，這些應用很容易導致抗性基因轉移到環境中，導致產生耐藥菌等生物安全問題。因此，研究和開發乳酸乳球菌表達系統時應注意設計載體所用的篩選標記，以保證產品的生物安全性。

乳酸乳球菌已經從一種食用細菌發展成為了一種微生物細胞工廠，用于生產有潛在生物經濟價值的工業產品，特別是在醫療領域。盡管目前乳酸乳球菌表達體系還存在局限性，但依然還有很大的改進空間。隨著對乳酸乳球菌相關研究的深入，會獲得更多的成熟高效的乳酸乳球菌表達系統，這無論是對理論研究還是實際應用都有重要意義。

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